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Methodenartikel

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

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DOI:

10.3791/57212

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19. April 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institutes of Health, 2Office of Science and Technology, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die genaue Identifizierung der satellitenzellen ist wichtig für das Studium ihrer Aufgaben unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur satellitenzellen auf Erwachsene Skelettmuskulatur Abschnitte durch Immunfluoreszenz-basierte Färbung zu erkennen.

Zusammenfassung

Immunfluoreszenz ist eine wirkungsvolle Methode, die hilft, um verschiedene Zelltypen auf Gewebeschnitte zu identifizieren. Um die gewünschte Zellpopulation zu studieren, werden Antikörper für bestimmte Zelle Marker auf Gewebeschnitte angewendet. In der Erwachsenen Skelettmuskulatur sind satellitenzellen (SCs) Stammzellen, die zur Muskel-Reparatur und Regeneration beitragen. Daher ist es wichtig, zu visualisieren und die Satelliten-Zell-Population unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu verfolgen. Im ruhenden Skelettmuskel, wohnen SCs zwischen der Basallamina und Myofiber Plasmamembran. Ein häufig verwendeter Marker zur Identifizierung von SCs auf der Myofibers oder in der Zellkultur ist das gepaarte Box Protein Pax7. In diesem Artikel wird eine optimierte Pax7 Immunfluoreszenz Protokoll auf skelettartigen Muskel Abschnitten dargestellt, die unspezifische Färbung und Hintergrund minimiert. Ein weiterer Antikörper, die ein Protein (Laminin) von der Basallamina erkennt wurde auch hinzugefügt auch zur Identifizierung von SCs. ähnlich wie Protokolle verwendet werden können, durchführen, doppelte oder dreifache Beschriftung mit Pax7 und Antikörpern für zusätzliche Proteine des Interesses.

Einleitung

Skelettmuskulatur ist bestehend aus mehrkernigen Muskelzellen, genannt Myotubes, in Myofibers, die Kraft und Bewegungen durch Kontraktion erzeugen organisiert. Die Skelettmuskeln, außer für einige kraniofazialen Muskeln stammen aus embryonalen Provisorium ein Somiten1genannt. Myogen Vorläuferzellen delaminieren von epithelialen Somiten zu Myoblasten. Myoblasten weiter differenzieren in Myozyten, die Sicherung, Myotubes, Multi-kernhaltigen Myofibers bilden werden. Das obige Verfahren wird Myogenesis genannt und zeichnet sich durch zeitlich geregelt Kontrolle der Genexpression. Myogen Vorstufen express Pax3 und Pax7, während Myoblasten MyoD Express und/oder Myf5 und Myozyten Myogenin und Myosins2,3 Express. Muskel-Wachstum ist ein Prozess, in dem Myofibers durch den Einbau von mehr Myonuclei in bestehenden Fasern (Hyperplasie) und durch eine Zunahme der Muskelfaser Größe (Hypertrophie)4größer geworden. Während das Muskelwachstum ist eine nachhaltige Energiequelle myogen Zellen, die Stammzell-Eigenschaften haben, dass sie differenzieren können und selbst zu erneuern. Diese Zellen werden anhand ihrer physischen Lage zwischen dem Sarkolemm (Zellmembran der Myofiber) und der Basallamina5Satelliten-Zellen bezeichnet. SCs kräftig dazu beitragen, Muskel-Wachstum in der juvenilen Phase (die ersten 2-3 Wochen postnatale Mäuse), aber Ruhestrom im ruhenden Erwachsenen Muskel6geworden. Bemerkenswert ist, können sie reaktiviert in Reaktion auf Muskel werden verletzt und in die neue Muskelzellen zu reparieren die beschädigten Muskeln7zu unterscheiden.

Die Stammzelle Eigenschaften machen das Studium der SCs für grundlegende Muskel Biologie und Therapien von Muskel-Krankheiten-8. Infolgedessen ist es eine Fläche von intensiver Untersuchung in den letzten Jahrzehnten gewesen. Eine enorme Fortschritte erzielt in sezieren die Genetik und Epigenetik SCs9,10. Techniken, die Isolierung und Identifizierung von SCs in Situ beteiligt waren entwickelt und optimiert entlang dem Weg11. Immunofluorescent Färbung ermöglicht die Identifikation von SCs durch den Einsatz von spezifischen Antikörpern, auch bei Pax7. Die Knappheit und die geringe Größe des SCs kombiniert mit einem starken Auto-Fluoreszenz von Erwachsenen skelettmuskelgewebe rendern die Visualisierung jedoch herausfordernd. Hier beschreiben wir eine immunofluorescent staining Protokoll optimiert für Maus Muskelgewebe für Pax7 und basierend auf einer vorhandenen Methode für Zebrafisch Muskel12. Darüber hinaus wird ein Laminin-Antikörper mit einer deutlichen Fluorophor beschriftet eingesetzt, um die Basallamina zu identifizieren, unter denen die SCs befinden. Dieses Protokoll ermöglicht konsequent die Visualisierung von Pax7-Positive SCs und myogen Vorstufen unter physiologischen Bedingungen alles geprüft und Entwicklungsstadien.

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Protokoll

In diesem Protokoll wurden die vorderen Hind Gliedmaßen Muskeln Erwachsener Mäuse (2-6 Monate), Tibialis anterior (TA) und Beinstrecker m.digitorum Longus (EDL), als Beispiel eingesetzt, um die Immunfluoreszenz-Färbung auf ihre SCs durchführen. Alle Schritte, die Umgang mit Mäusen und Muskel Gewebe Sezierungen von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) des NIAMS/NIH genehmigt worden.

1. Zerlegen des TA/EDL-Muskels von der Maus Hind Gliedmaßen

  1. Die Maus in einer CO2 gefüllte Euthanasie Kammer nach den Richtlinien des ACUC des NIH einschläfern. Führen Sie zervikale Dislokation, wenn nötig.
  2. Setzen Sie die Maus nach oben auf eine Dissektion Pad (Rückenlage). Sprühen Sie 70 % Ethanol auf seinen Bauch Haut. Schneiden Sie eine 1-2 cm Öffnung horizontal in der Mitte der Maus Bauch Haut, dann deskin der Maus durch Ziehen an der Öffnung für die Mausfüße. Setzen Sie eine Seite der Maus Hind Gliedmaßen.
  3. Zwei scharfe Pinzetten verwenden: Verwenden Sie eine der Sehnen zu halten, mit denen der TA/EDL bis zum Knöchel befestigt, und verwenden Sie die anderen zu brechen und die Faszie für TA/EDL zu scheren. Sobald die Faszie abgeschält ist, verwenden Sie die scharfe Spitze der Zange, um TA/EDL aus dem Schienbein Knochen zu lösen, indem man die Spitze unter den TA/EDL-Muskel.
  4. Die Knöchel Sehnen und halten sie mit der Pinzette mit einer Schere abgeschnitten. Schneiden Sie den Muskel mit einer Schere entlang der Längsachse der TA/EDL vom Knöchel bis zum Knie beim Anheben der TA/EDL seitens der Knöchel mit der Zange. Schneiden Sie die Knie-Seite sehnen um den ganzen TA/EDL aus der Tibia zu lösen.

(2) Cryo-Einbettung des Muskels TA/EDL

  1. Bereiten ein flüssiger Stickstoff-Bad in einem Behälter, zB., ein flüssiger Stickstoff Dewar Kolben. Gießen Sie Methylbutane in eine kleine Kunststoffbecher (ca. 20 mL), halb voll. Dann legen Sie das Becherglas in flüssigem Stickstoff Bad es einfrieren. Nach ein paar Minuten zu überprüfen, dass die Methylbutane eingefroren ist.
    Hinweis: Der flüssige Stickstoff kann ersetzt werden durch einen Eimer mit Trockeneis, aber die Gefrierzeit ist langsamer.
  2. Legen Sie seziert TA/EDL auf die flache Oberfläche des einen kleinen Plastik Spritzenkolbens. Decken Sie vollständig die TA/EDL mit ein paar Tropfen der optimale Schnitt Temperatur (O.C.T.) Verbindung (das Einfrieren Medium).
  3. Methylbutane Becher aus dem flüssigen Stickstoff-Bad zu nehmen und Auftauen die Oberfläche mit einem warmen Gegenstand (zB., den Griff der Schere). Schnell bedeckt Dip der O.C.T. TA/EDL auf den Kolben in die geschmolzene Methylbutane zu Snap-das Gewebe einfrieren.
  4. Das eingebettete Gewebe von den Kolben mit der Pinzette zu lösen, und steckte es in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff beim Umgang mit mehr Proben zu speichern.
    Hinweis: Die eingebettete Gewebe kann bei-80 ° C für längere Zeit (2 Jahre) oder-20 ° C für kurze Zeit (6 Monate) gespeichert werden.

(3) Kryostat schneiden

  1. Geben Sie einen Tropfen O.C.T. Verbindung in das Zentrum von einem Probenhalter von einem Kryostaten. Warten Sie, bis die O.C.T. Verbindung fast erstarrt ist. Schnell halten die eingebetteten TA/EDL, O.C.T. Verbindung, senkrecht mit dem Knöchel nach unten und die Knie-Seite oben.
  2. Befestigen Sie die Halterung der Probe auf einem Kryostaten, schneiden Sie das Gewebe bei 10 µm-Intervall und sammeln die Cryo-Abschnitte auf Frost beschichteten Folien mit über 4-8 Abschnitte auf einer Folie.
  3. Trocknen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur mindestens 3 h über Nacht.
    Hinweis: Obwohl die Abschnitte in der Tiefkühltruhe über Nacht oder länger Trocknen akzeptabel ist, erhöht sich zwangsläufig die Autofluoreszenz. Für beste Ergebnisse trockene Abschnitte für 0,5 h, fahren Sie dann mit der Fixierung und Färbung Schritte sofort.
  4. Sammeln Sie die Folien in einer Folie Box und sofort verwenden Sie, oder speichern Sie die Folien bei-80 ° C oder-20 ° C für die spätere Verwendung zu.

4. Vorbereitung der Reagenzien für die Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Bereiten Sie Puffer:
    1. 2 L 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) von 10 X PBS vorzubereiten.
    2. Bereiten Sie 40 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer von 16 % PFA.
    3. 2 L PBST vorbereiten: 1 X PBS mit 0,1 % Triton-100.
    4. 50 mL PBST-B: PBST mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) vorzubereiten.
    5. 10 mL PBST-B-g: PBST mit 2 % BSA und 5 % normalem Ziegenserum vorzubereiten.
    6. Bereiten Sie 1 mL der Lösung blockieren. Verdünnte AffiniPure Fab-Fragment-Ziege-Anti-Maus IgG (H + L) (01:10) in PBST-B.
    7. 200 mL 1 X Citrat Puffer vorzubereiten.
      Hinweis: Die Mengen der oben genannten Lösungen sind ausreichend für mindestens 5 Dias. Mengen sollten entsprechend die Anzahl der Folien und die Größe der Folie Behälter angepasst werden.
  2. Bereiten Sie Antikörper Flecken:
    1. Primären Antikörper (arbeiten Konzentration): 1,2 mL Primärantikörper Mix durch Verdünnung Pax7 monoklonale Maus-Antikörper (IgG1) vorbereiten (1-5 µg/mL) + Laminin Kaninchen polyklonalen Antikörper (0,5-2 µg/mL) + MF20 monoklonale Maus-Antikörper (IgG2b) (0,5-2,5 µg / mL) in PBST-B-G.
      Hinweis: MF20 monoklonale Maus-Antikörper (IgG2b) ist optional.
    2. Sekundärantikörper (arbeiten Konzentration): 1,2 mL Sekundärantikörper Mix durch Verdünnung Goat Anti-Maus IgG1 Kreuz adsorbiert Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 vorbereiten (0,5-2 µg/mL) + Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) hoch Kreuz adsorbiert Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 555 (0,5-2 µg/mL) + Ziege Anti-Maus IgG2b Kreuz adsorbiert Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) in PBST-B-G.
      Hinweis: Alexa Fluor 647 ist optional.

5. Immunfluoreszenz-Färbung-Schritte

  1. Rehydrieren und die Cryo-Abschnitte mit PFA befestigen.
    1. Entnehmen Sie ein paar der TA/EDL Cryo-Abschnitt Folien aus dem Folie Karton. Wärmen Sie die Folien in einer Dia-Holding-Schale bei Raumtemperatur.
    2. Verwenden Sie einen flüssigen Blocker Stift (PAP-Stift) um einen Bereich zu zeichnen, der die Cryo-Abschnitte auf der Folie enthält. Dieser Kreis wird verhindert, dass die Lösungen fließt aus der Folie.
    3. Nehmen Sie die Schale auf einem Labor-Abzug. Hinzufügen von 300-500 µL 4 % PFA auf der Folie in den eingekreisten Bereich, in den Abschnitten bei Raumtemperatur für 10 min. Auswaschen der PFA mit 1 X PBS zu beheben mindestens 3 x 5 min in einem Dia-Container.
      Achtung: PFA ist giftig und als gefährlicher Abfall; Es sollte mit Sorgfalt betrieben und in einen Behälter für gefährliche Abfälle entsorgt werden.
  2. Antigen-retrieval
    1. Füllen Sie eine weitere Folie Behälter mit 200 mL Citrat-Puffer.
    2. Übertragen Sie die Folien in den Behälter. Transfer der Containers mit den Folien zum Schnellkochtopf Folien in Hochdruck-Modus für 10 min kochen.
    3. Kühlen Sie des Behälters mit Ablassen von Wasser für 10 min. Transfer alle Dias in einen neuen Container mit PBST (200 mL ab), spülen Sie die Folien mit PBST mindestens 3 x 5 min lang.
  3. Blockieren
    1. Das Fach halten die Folien erstelle ich eine feuchte Umgebung um zu vermeiden, Trocknen der Folien fügen Sie Wasser getränkten Kimwipes hinzu.
    2. Verschieben Sie die Folien wieder in das Fach, und fügen Sie 200 µL Lösung auf jeder Folie zu blockieren. Bedecken Sie das Fach mit einer Kappe und lassen Sie die Sperrung für 30 min zu entwickeln.
      Hinweis: Pax7 Antikörper ist ein Maus monoklonaler Antikörper, so gibt es unspezifische Bindung der Maus IgG in Maus Muskelgewebe, die hohen Hintergrund erstellt. Mit der AffiniPure Fab-Fragment Goat Anti-Maus IgG (H + L) blockiert die Maus zu Maus unspezifische Bindung.
  4. Gelten Sie primäre Antikörper.
    1. Spülen Sie die Folien mit PBST einmal in der Dia-Container. Wechseln Sie die Folien wieder zu der Färbung Tablett.
    2. 200 µL Primärantikörper Mix auf jeder Folie anwenden, das Fach mit einer Kappe bedecken und die Reaktion bei Raumtemperatur 1 h oder bei 4 ° C über Nacht entwickeln zu lassen.
      Hinweis: Die Übernachtung Reaktion bei 4 ° C gibt das beste Ergebnis, obwohl die Reaktion bei Raumtemperatur zu entwickeln zufriedenstellende Ergebnisse liefert. Der Myosin-MF20-Antikörper kann in der Mischung ein Dreibettzimmer (Pax7, Laminin, MF20) Kennzeichnung durchführen hinzugefügt werden. MF20 Flecken differenzierten Muskelfasern. Dieser Schritt dient auch als ein weiteres Blockierungsschritt mit PBST-B-G, potentielle unspezifische Bindung von Sekundärantikörper (Ziege Antikörper) im folgenden Schritt zu reduzieren.
  5. Gelten Sie Sekundärantikörper.
    1. Auswaschen der primären Antikörper mit PBST bei Raumtemperatur mindestens 3 x 5 Minuten.
    2. Jede Folie 200 µL der Sekundärantikörper Mischung hinzu, und ermöglichen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur mindestens 1 h zu entwickeln.
      Hinweis: Verwenden Sie für Pax7 + Laminin, Goat Anti-Maus IgG1 Alexa 488 und Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa-555.
      Fügen Sie für Pax7 + Laminin + MF20 Ziege-Anti-Maus-IgG2b Alexa 647 in die Mischung hinzu.
    3. Auswaschen der Sekundärantikörper mit PBST mindestens 3 x 5 Minuten.
  6. DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) Counter Fleck und Montage
    1. Verdünnen Sie DAPI (01:20, 000) in PBST in der Folie-Container, z. B.10 µL des DAPI in 200 mL PBST.
    2. Färben Sie die Folien in der DAPI-Container für 3 min.
    3. Das DAPI mit PBST für mindestens 5 x 5 min. auswaschen.
    4. Montieren Sie die Folien mit Eindeckmedium. Decken Sie die Folien mit Deckgläsern.
      Achtung: DAPI ist giftig und gefährlich; Es sollte mit Vorsicht behandelt und in der Flasche Sondermüll entsorgt werden.

(6) Fluoreszenz-Mikroskopie

Hinweis: Das immunofluorescent staining Protokoll berichtet über SCs Visualisierung mit entweder einem Weitfeld-Leuchtstofflampen oder confocal Mikroskop können. Es kann anfangs schwierig, SCs zu identifizieren sein. Hier sind ein paar empfohlene Schritte, die hilfreich sein können.

  1. Verwenden Sie DAPI Kanal und geringer Vergrößerung Ziele, um die Abschnitte auf den Folien zu visualisieren.
  2. Wechseln Sie die Vergrößerung von niedrig bis hoch. SCs zu beobachten, muss mindestens ein 20 X Objektiv).
  3. Verwenden Sie die dual-Filter-Cube für 488 (FITC) / 555 (Rhodamin) Pax7 und Laminin beobachten Signale gleichzeitig SCs zu identifizieren. Unter dieser Einstellung muss das Signal der Pax7 Färbung einen besseren Kontrast zu den Hintergrundgeräuschen.
  4. Wechseln Sie schnell den Kanal von FITC DAPI, SCs richtig zu identifizieren. Alle SCs sollte Pax7/DAPI-positiv.

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Ergebnisse

Im Anschluss an die oben genannten Schritte können SCs erfolgreich in Erwachsenen ruhenden Muskel-Abschnitten unter dem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1) visualisiert werden. Obwohl der Erwachsene Muskelgewebe starke Auto-Fluoreszenz in bestimmten Fasern hat, die hellen Alexa Serie Farbstoffe können die Hintergrundgeräusche zu überwinden und das Signal zeichnet sich (Abb. 1A, B, Pfeilspitzen). Die zwei-Photonen...

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Diskussion

Das obige Protokoll stützte sich auf eine Methode der Pax7/MF20 Färbung am Zebrafisch Skelettmuskulatur12. Die Lösungen verwendet und blockieren Schritte sind identisch oder ähnlich. Die verwendeten Antikörper sind identisch. Die bereinigte Schritte basieren auf Funktionen der Maus Muskelgewebe und SCs. Erstens wurde Laminin-Antikörper hinzugefügt, in der Mischung zu helfen, zu visualisieren und bestätigen die Position des SCs. Es war besonders hilfreich, um die Anzahl der SCs unter dem Mikroskop ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei den NIAMS Imaging Lichtschnitt für die Bereitstellung der Mikroskope und technische Hilfe. Die MF20 und Pax7 Antikörper wurden von der Entwicklungsbiologie Studien Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft der NICHD entwickelt und verwaltet von der Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City erhalten. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschung Programm des NIAMS von den National Institutes of Health unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MethylbutanSigma-AldrichM32631
Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (O.C.T.)Elektronenmikroskopie Sciences62550-01
10x PBSGibco, Themo Fisher70011-044
16% PFATED PELLA50-00-0
Triton-100Sigma-AldrichT8787
Normales ZiegenserumThermo Fisher0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-007-003
20x CitratpufferThermo Fisher00 500
Pax7 monoklonaler Maus-Antikörper (IgG1) (Überstand)Entwicklungsstudie Hybridom BankN/A
polyklonaler Laminin-Kaninchen-AntikörperSigma-AldrichL9393
MF20 monoklonaler Maus-Antikörper (IgG2b) (Überstand)Entwicklungsstudie Hybridom BankN/A
Ziege anti-Maus IgG1 kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488Thermo FisherA-21121
Ziege anti-Maus IgG2b kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21242
Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 555Thermo FisherA32732
Leica CM1860 Kryostat
Leica DM6000 Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop
Leica DMR Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop
Zeiss LSM510 Konfokalmikroskop
Zeiss LSM780 Konfokalmikroskop
Cuisinart elektronischer Schnellkochtopf

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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