Die genaue Identifizierung der satellitenzellen ist wichtig für das Studium ihrer Aufgaben unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur satellitenzellen auf Erwachsene Skelettmuskulatur Abschnitte durch Immunfluoreszenz-basierte Färbung zu erkennen.
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Methodenartikel
Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Immunfluoreszenz ist eine wirkungsvolle Methode, die hilft, um verschiedene Zelltypen auf Gewebeschnitte zu identifizieren. Um die gewünschte Zellpopulation zu studieren, werden Antikörper für bestimmte Zelle Marker auf Gewebeschnitte angewendet. In der Erwachsenen Skelettmuskulatur sind satellitenzellen (SCs) Stammzellen, die zur Muskel-Reparatur und Regeneration beitragen. Daher ist es wichtig, zu visualisieren und die Satelliten-Zell-Population unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu verfolgen. Im ruhenden Skelettmuskel, wohnen SCs zwischen der Basallamina und Myofiber Plasmamembran. Ein häufig verwendeter Marker zur Identifizierung von SCs auf der Myofibers oder in der Zellkultur ist das gepaarte Box Protein Pax7. In diesem Artikel wird eine optimierte Pax7 Immunfluoreszenz Protokoll auf skelettartigen Muskel Abschnitten dargestellt, die unspezifische Färbung und Hintergrund minimiert. Ein weiterer Antikörper, die ein Protein (Laminin) von der Basallamina erkennt wurde auch hinzugefügt auch zur Identifizierung von SCs. ähnlich wie Protokolle verwendet werden können, durchführen, doppelte oder dreifache Beschriftung mit Pax7 und Antikörpern für zusätzliche Proteine des Interesses.
Einleitung
Skelettmuskulatur ist bestehend aus mehrkernigen Muskelzellen, genannt Myotubes, in Myofibers, die Kraft und Bewegungen durch Kontraktion erzeugen organisiert. Die Skelettmuskeln, außer für einige kraniofazialen Muskeln stammen aus embryonalen Provisorium ein Somiten1genannt. Myogen Vorläuferzellen delaminieren von epithelialen Somiten zu Myoblasten. Myoblasten weiter differenzieren in Myozyten, die Sicherung, Myotubes, Multi-kernhaltigen Myofibers bilden werden. Das obige Verfahren wird Myogenesis genannt und zeichnet sich durch zeitlich geregelt Kontrolle der Genexpression. Myogen Vorstufen express Pax3 und Pax7, während Myoblasten MyoD Expre....
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Protokoll
In diesem Protokoll wurden die vorderen Hind Gliedmaßen Muskeln Erwachsener Mäuse (2-6 Monate), Tibialis anterior (TA) und Beinstrecker m.digitorum Longus (EDL), als Beispiel eingesetzt, um die Immunfluoreszenz-Färbung auf ihre SCs durchführen. Alle Schritte, die Umgang mit Mäusen und Muskel Gewebe Sezierungen von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) des NIAMS/NIH genehmigt worden.
1. Zerlegen des TA/EDL-Muskels von der Maus Hind Gliedmaßen
- Die Maus in einer CO2 gefüllte Euthanasie Kammer nach den Richtlinien des ACUC des NIH einschläfern. Führen Sie zervikale Dislokation, wenn nötig.
- Setzen Sie die Maus n....
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Ergebnisse
Im Anschluss an die oben genannten Schritte können SCs erfolgreich in Erwachsenen ruhenden Muskel-Abschnitten unter dem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1) visualisiert werden. Obwohl der Erwachsene Muskelgewebe starke Auto-Fluoreszenz in bestimmten Fasern hat, die hellen Alexa Serie Farbstoffe können die Hintergrundgeräusche zu überwinden und das Signal zeichnet sich (Abb. 1A, B, Pfeilspitzen). Die zwei-Photonen.......
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Diskussion
Das obige Protokoll stützte sich auf eine Methode der Pax7/MF20 Färbung am Zebrafisch Skelettmuskulatur12. Die Lösungen verwendet und blockieren Schritte sind identisch oder ähnlich. Die verwendeten Antikörper sind identisch. Die bereinigte Schritte basieren auf Funktionen der Maus Muskelgewebe und SCs. Erstens wurde Laminin-Antikörper hinzugefügt, in der Mischung zu helfen, zu visualisieren und bestätigen die Position des SCs. Es war besonders hilfreich, um die Anzahl der SCs unter dem Mikroskop .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei den NIAMS Imaging Lichtschnitt für die Bereitstellung der Mikroskope und technische Hilfe. Die MF20 und Pax7 Antikörper wurden von der Entwicklungsbiologie Studien Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft der NICHD entwickelt und verwaltet von der Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City erhalten. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschung Programm des NIAMS von den National Institutes of Health unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Methylbutan | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (O.C.T.) | Elektronenmikroskopie Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normales Ziegenserum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Ziege Anti-Maus IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citratpuffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 monoklonaler Maus-Antikörper (IgG1) (Überstand) | Entwicklungsstudie Hybridom Bank | N/A | |
| polyklonaler Laminin-Kaninchen-Antikörper | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 monoklonaler Maus-Antikörper (IgG2b) (Überstand) | Entwicklungsstudie Hybridom Bank | N/A | |
| Ziege anti-Maus IgG1 kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Ziege anti-Maus IgG2b kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 Kryostat | |||
| Leica DM6000 Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop | |||
| Leica DMR Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop | |||
| Zeiss LSM510 Konfokalmikroskop | |||
| Zeiss LSM780 Konfokalmikroskop | |||
| Cuisinart elektronischer Schnellkochtopf |
Referenzen
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell D....
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Nachdrucke und Genehmigungen
