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Neuroscience

विवो फाइबर-युग्मित प्री-क्लिनिकल कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग एंडोमाइक्रोस्कोपी (पीसीएलई) में जागृत चूहों में हिप्पोकैम्पल केशिकाएं

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/57220
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3
1División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide, 2Barrow Neurological Institute, 3Ophthalmology, Neurology, and Physiology/Pharmacology, SUNY Downstate Medical Center

Summary

जबकि मल्टीफोटॉन इमेजिंग केवल ऊतक की सतह से सीमित गहराई पर प्रभावी है, पीसीएलई के माध्यम से किसी भी गहराई पर 3 μm रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करना संभव है। यहां, हम आईसीटीऔर जंगली प्रकार के चूहों के हिप्पोकैम्पस में माइक्रोवस्कुलर गतिशीलता को मापने के लिए पीसीईएल इमेजिंग का संचालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य भित्ति कोशिकाओं द्वारा संचालित दौरे के दौरान केशिका रक्त प्रवाह प्रभावों को स्पष्ट करने के लिए अपने विशिष्ट अनुप्रयोग में फाइबर-ऑप्टिक-बंडल-युग्मित पूर्व-नैदानिक कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग एंडोमाइक्रोस्कोपी (पीसीएलई) का वर्णन करना है। इन विट्रो और विवो कॉर्टिकल इमेजिंग से पता चला है कि पेरिसाइट्स द्वारा संचालित केशिका कसना स्वस्थ जानवरों में कार्यात्मक स्थानीय तंत्रिका गतिविधि के साथ-साथ दवा के आवेदन से उत्पन्न हो सकता है। यहां, किसी भी ऊतक गहराई (विशेष रूप से हिप्पोकैम्पस में) पर मिर्गी में तंत्रिका अध: पतन में माइक्रोवस्कुलर गतिशीलता की भूमिका निर्धारित करने के लिए पीसीई का उपयोग करने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। हम एक सिर संयम तकनीक का वर्णन करते हैं जिसे जागृत जानवरों में पीसीई रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया गया है, ताकि तंत्रिका गतिविधि पर एनेस्थेटिक्स के संभावित दुष्प्रभावों को संबोधित किया जा सके। इन तरीकों का उपयोग करके, मस्तिष्क की गहरी तंत्रिका संरचनाओं में कई घंटों में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और इमेजिंग रिकॉर्डिंग आयोजित की जा सकती है।

Introduction

अन्य सूक्ष्मइमेजिंग विधियों 1,2,3,4,5,6,7,8 के विपरीत, विवो फाइबर-ऑप्टिक-आधारित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में रक्त प्रवाह की गतिशीलता को मापने की अनुमति देता है, किसी भी गहराई पर, उच्च गति पर (फील्ड-ऑफ-व्यू आकार9 के आधार पर 240 हर्ट्ज तक)।). एक फाइबर-ऑप्टिक जांच 3 μm रिज़ॉल्यूशन पर विवो कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग इमेजिंग में सक्षम बनाती है क्योंकि जांच की नोक (5000-6000 3 μm व्यास व्यक्तिगत फाइबर के बंडल से बना एक लेंस-कम उद्देश्य) को रुचि के फ्लोरोसेंट लक्ष्य के 15 μm के भीतर माइक्रोइलेक्ट्रोड की सटीकता के साथ तैनात किया जा सकता है। विवो टू-फोटॉन इमेजिंग के साथ, फ्लोरोफोर को पहले इमेजिंग लक्ष्य में पेश किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, फ्लोरेसिन डेक्सट्रान (या क्वांटम डॉट्स) को वाहिका में इंजेक्ट किया जा सकता है, या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन को कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है, या ओरेगन ग्रीन बाप्टा -1 जैसे फ्लोरोसेंट रंगों को इमेजिंग से पहले कोशिकाओं में थोक-लोड किया जा सकता है।

इन तकनीकों का उपयोग करके हाल के शोध में पाया गया है कि म्यूरल सेल मोटर गतिविधि जो आईसीटील केशिका वासोस्पाज्म की ओर ले जाती है- अचानक कसना जो दौरेके दौरान भित्ति कोशिकाओं की स्थिति में होता है 9- आईसीटील हिप्पोकैम्पस9 में न्यूरोडीजेनेरेशन में योगदान कर सकता है। जबकि पिछले इमेजिंग अध्ययनों ने इन विट्रो और विवो पेरिसिलेट कसना में दवा अनुप्रयोगों 6,7,10,11,12 से जुड़े दिखाया, लील-कैम्पानारियो एट अल ने मुराइन मस्तिष्क में विवो सहज केशिका कसना का पहला सबूत पाया। मानव टेम्पोरल लोब मिर्गी के लिए प्रासंगिकता स्थापित करने के लिए, उन्होंने पुरुष (पी 30-40 पुराने) नॉकआउट (केओ) केवी 1.1 (केसीएनए 1-नल) चूहों 14,15 (जेएएक्स स्टॉक # 003532), मानव एपिसोडिक गतिभंग टाइप 115 का एक आनुवंशिक मॉडल का अध्ययन किया। पेरिसाइट्स ने सहज मिर्गी जानवरों और उनके जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) केकूड़े में पैथोलॉजिकल और शारीरिक हिप्पोकैम्पल भित्ति वाहिकासंकीर्णन दोनों को प्रेरित किया। इन अवलोकनों को डब्ल्यूटी जानवरों में दोहराया गया था, जिन्हें केनिक-एसिड के साथ मिर्गी प्रदान की गई थी, जिससे मिर्गी के अन्य रूपों के लिए उनके सामान्यीकरण का संकेत मिलता है। इसके अलावा, नए स्टीरियोलॉजिकल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण ों का उपयोग करते हुए, लील-कैम्पानारियो एट अल ने निर्धारित किया कि मिर्गी के जानवरों में एपोप्टोटिक-लेकिन स्वस्थ नहीं-न्यूरॉन्स स्थानिक रूप से हिप्पोकैम्पल माइक्रोवास्कुलचर के साथ युग्मित थे। क्योंकि एक्साइटोटॉक्सिसिटी का वाहिका से कोई ज्ञात स्थानिक संबंध नहीं है, इस परिणाम ने संकेत दिया कि असामान्य केशिका वासोस्पास्मिक इस्किमिया-प्रेरित हाइपोक्सिया मिर्गी में न्यूरोडीजेनेरेशन में योगदान देता है। चित्रा 1 सामान्य सेटअप का एक योजनाबद्ध दिखाता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच दिशानिर्देशों का पालन करता है। सभी प्रक्रियाओं को बैरो न्यूरोलॉजिकल इंस्टीट्यूट की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. क्रैनियोटॉमी के लिए स्टीरियोटैक्सिक पोजिशनिंग

  1. केटामाइन-ज़ाइलेज़िन (100 मिलीग्राम / किग्रा - 10 मिलीग्राम / किग्रा) कॉकटेल के साथ माउस को तौलें और फिर एनेस्थेटाइज करें। सुनिश्चित करें कि जानवर को पूंछ और / या पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी को देखकर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
  2. माउस के नीचे एक हीटिंग पैड रखें और प्रारंभिक एनेस्थेटाइज्ड इम्प्लांटेशन सर्जरी (चित्रा 2 ए) के दौरान अपने शरीर के तापमान की लगातार निगरानी करने के लिए रेक्टल थर्मामीटर का उपयोग करें।
  3. आंखों के सूखेपन को रोकने के लिए नेत्र मरहम लगाएं।
  4. माउस एडाप्टर के साथ फिट किए गए कृंतक स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम में जानवर के सिर को स्थिर करें। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस को ठीक से उन्मुख करने के लिए, जानवर के दांतों को बाइट-बार के छेद के अंदर रखें (चित्रा 2 ए और चित्रा 3 ए, आइटम जी)। नाक-क्लैंप को तब तक कसें जब तक कि यह स्नूग न हो जाए (चित्रा 2 ए, बी और चित्रा 3 ए, आइटम एच)। माउस की बॉडी पोजिशनिंग यथासंभव सीधी होनी चाहिए (जैसा कि चित्रा 2 ए में है)।
    1. खोपड़ी की जाइगोमेटिक प्रक्रियाओं को मजबूती से दबाने के लिए जबड़े धारक कफ (चित्रा 2 ए और चित्रा 3 ए, आइटम आई) के साथ माउस कान-सलाखों का उपयोग करके जानवर के सिर को सुरक्षित करें।
      नोट: एक बार सुरक्षित होने के बाद, माउस के सिर में क्षैतिज गति की कोई सीमा नहीं होनी चाहिए।
  5. एक बार जब माउस स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (चित्रा 3 बी, आइटम जे) में समायोजित हो जाता है, तो खोपड़ी को क्लोर-हेक्सेडाइन स्क्रब से 2-3 बार पोंछकर साफ और निष्फल करें, हर बार शराब कुल्ला करें। फिर, सिर के शीर्ष पर सामयिक लिडोकेन लागू करें।
  6. खोपड़ी की मध्य रेखा के साथ पीछे से पूर्वकाल तक एक चीरा लगाएं (खोपड़ी के आधार पर चीरा शुरू करें और इसे आंखों के बीच पूरा करें; 12-15 मिमी) खोपड़ी की मध्य रेखा के साथ, या तो बारीक कैंची या ब्लेड का उपयोग करके। खोपड़ी को उजागर करने और कार्य क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए चार 28 मिमी बुलडॉग सेरिफाइंड क्लैंप के साथ खोपड़ी की सीमाओं को पीछे हटाएं (चित्रा 2 बी और चित्रा 3 सी)।
  7. पेरीओस्टेम को चीरे के किनारों पर खुरचने के लिए स्केलपेल या माइक्रोस्पैटुला (चित्रा 3 सी) का उपयोग करें। गर्दन के पीछे की मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक वापस लेने के लिए ऊतक-अलग करने वाली कैंची या फोर्सप्स (चित्रा 3 सी) का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)।
  8. कपाल सीवन के विज़ुअलाइज़ेशन को अनुकूलित करने के लिए, खोपड़ी के शीर्ष को एक कपास-युक्त एप्लिकेटर के साथ सुखाएं, अल्कोहल या 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ नम करें। संयोजी ऊतक को हटा दिए जाने के बाद खोपड़ी पर खारा लगाएं।
  9. एक बार जब माउस का सिर स्टीरियोटेक्सिक तंत्र में स्थिर हो जाता है, तो इलेक्ट्रोड धारक (चित्रा 3 बी, आइटम एल) में एक सिरिंज सुई टिप (21 ग्राम) रखें, और इलेक्ट्रोड होल्डर को स्टीरियोटैक्सिक माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें, सुई की नोक को खोपड़ी के स्तर तक कम करें (चित्रा 2 डी)।
  10. खोपड़ी की मध्यम-पार्श्व दिशा को ब्रेग्मा (यानी, -2.0 मिमी) के पीछे किसी भी दूरी पर मापकर और खोपड़ी के दोनों ओर मध्य रेखा से दो समान दूरी पार्श्व (यानी, ± 1.5 मिमी) को मापकर समायोजित करें (चित्रा 2 डी)। पृष्ठीय-उदर दिशा में 0.05 मिमी से कम स्थानों में ऊंचाई अंतर का लक्ष्य रखें।
    1. यदि 0.05 मिमी से अधिक है, तो माउस की खोपड़ी को काटने की पट्टी का उपयोग करके घुमाएं, या माउस के सिर को कान-सलाखों को सावधानी से ढीला करके, आवश्यकतानुसार सिर और कान-सलाखों को पार्श्व रूप से स्थानांतरित करें, और फिर कान-सलाखों को फिर से कस दें।
  11. एक बार जब खोपड़ी को स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस में रखा जाता है, तो एंटेरोपोस्टीरियर (एपी), मेडियल लेटरल (एमएल), और पृष्ठीय वेंट्रल (डीवी) अक्षों के साथ ब्रेग्मा और लैम्ब्डा खोपड़ी सीवन के स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक निर्धारित और रिकॉर्ड करें।
  12. एक स्टीरियोटैक्सिक एटलस की सहायता से लक्ष्य बिंदु (दाएं हिप्पोकैम्पस) की पहचान करें। फिर, खोपड़ी पर ब्रेग्मा (एपी: -2.7 मिमी, एमएल: -2.7 मिमी) (चित्रा 2 ई) के सापेक्ष लक्ष्य बिंदु निर्देशांक का पता लगाएं।
  13. एक सर्जिकल मार्कर का उपयोग करके, खोपड़ी पर 1.4 मिमी x 2 मिमी इमेजिंग विंडो के चार कोनों को डॉट्स के साथ चिह्नित करें, जो हिप्पोकैम्पस (चित्रा 2 एफ) के ऊपर लक्ष्य बिंदु के आसपास केंद्रित है, बाद में क्रैनियोटॉमी के लिए।
  14. दो अतिरिक्त बिंदुओं को खींचने के लिए सर्जिकल मार्कर का उपयोग करें: एक शीर्ष-बाएं पार्श्विका हड्डी (चित्रा 2 जी) पर और दूसरा दाएं ललाट हड्डी (चित्रा 2 एच) पर, दो हड्डी स्क्रू (चित्रा 3 ए, आइटम बी) के भविष्य के प्लेसमेंट को इंगित करने के लिए जो खोपड़ी में हेड-कैप (चित्रा 3 बी, आइटम एम) को लंगर देगा।
  15. सर्जिकल मार्कर का उपयोग तीन और बिंदुओं को खींचने के लिए करें जो दर्शाता है कि एपिड्यूरल ईईजी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कहां डाले जाएंगे: एक बिंदु मध्य रेखा के दोनों ओर 1 मिमी स्थित है, और लैम्ब्डा के पीछे 1 मिमी स्थित मध्य रेखा पर एक अतिरिक्त बिंदु (चित्रा 2 ई, चित्रा 4 ए और चित्रा 5 बी)।

2. हेड-कैप स्थापना

  1. 0.7 मिमी व्यास के (चित्रा 3 सी) का उपयोग करके, खोपड़ी में दो छोटे छेदों को सावधानीपूर्वक ड्रिल करें, हड्डी के स्क्रू प्लेसमेंट का संकेत देने वाली डॉट पोजीशन पर (ऊपर चरण 1.15 देखें)। फिर, दो हड्डी स्क्रू (स्टेनलेस स्टील-स्लॉट, लंबाई: 4 मिमी; व्यास: 0.85 मिमी) पहले इथेनॉल 70-80% के साथ कीटाणुरहित करें, और अतिरिक्त सिर-टोपी स्थिरता के लिए उन्हें खोपड़ी में पेंच करें (चित्रा 2आई-जे और चित्रा 3 ए, आइटम बी)।
    1. सुनिश्चित करें कि पेंच युक्तियां खोपड़ी गुहा में हड्डी के नीचे से परे बाहर न निकलें, जिससे मस्तिष्क को नुकसान हो। ध्यान दें कि दो हड्डी स्क्रू में से एक दो हेड-कैप स्क्रू के पूर्ववर्ती होगा, और दूसरा उनके पीछे होगा (चित्रा 2जी-जे)।
  2. खोपड़ी को ठंडा करने और इसे साफ करने के लिए उस पर खारा पानी डालें। फिर खोपड़ी को पूरी तरह से सुखाएं और स्क्रू के चारों ओर साइनोएक्रिलेट की एक पतली परत लागू करें।
  3. स्टीरियोटेक्सिक डिवाइस (चित्रा 2 एफ-जे और चित्रा 3 ए, आइटम डी) पर लगाए गए माइक्रोड्राइव पर एक कस्टम संरेखण टुकड़े (चित्रा 3 ए, आइटम सी) का उपयोग करें, ताकि हेड-कैप की स्थिति मध्य रेखा के साथ संरेखित हो, जिसमें पूर्वकाल रिज ब्रेग्मा के ऊपर हो। यह कस्टम स्टेनलेस-स्टील का टुकड़ा एल-आकार का है (90 ° पर कोण), जिसमें दो छेद 4 मिमी (चित्रा 2एफ-जे और चित्रा 3 ए, आइटम सी) से अलग हैं।
    1. एल-आकार के संरेखण टुकड़े को रखने के लिए स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर का उपयोग करें, जिसमें दो फिलिस्टर हेड स्लॉट ड्राइव स्क्रू संलग्न हैं (एम 1.6 x 0.35 मीट्रिक मोटे, 12 मिमी लंबाई; चित्र 3 ए, आइटम ए) ब्रेग्मा के ऊपर, जब तक कि स्क्रू का आधार खोपड़ी पर सपाट न हो, खोपड़ी पर दबाव न डालने के लिए सावधान रहें (चित्रा 2आई-जे)।
  4. स्क्रू के आधार को खोपड़ी से जोड़ने के लिए दंत सीमेंट के बाद साइनोएक्रिलेट लागू करें। हिप्पोकैम्पस (चित्रा 2 के) पर इमेजिंग विंडो संदर्भ निशान को बाधित न करने के लिए सावधान रहें।

3. इमेजिंग विंडो क्रैनियोटॉमी सर्जरी

  1. क्रानियोटॉमी संदर्भ चिह्नों के प्रत्येक स्थान पर जो इमेजिंग विंडो के कोनों को इंगित करते हैं (ऊपर चरण 1.14 देखें), 0.7 मिमी व्यास का छेद ड्रिल करें, इसके बाद ड्रिल के साथ 1.4 मिमी x 2 मिमी क्रैनियोटॉमी विंडो की परिधि को धीरे से चित्रित करें, जिसमें पुनरावृत्ति रूप से गहरे कट (चित्रा 2 एल) हैं।
  2. ध्यान रखें कि खोपड़ी पर बहुत गहराई से या बहुत अधिक बल के साथ ड्रिल न करें, जो पतली और नाजुक है, जिसकी मोटाई लगभग 300 μm है। एक बार हड्डी का फ्लैप पूरा हो जाने के बाद, ढीले फ्लैप को स्केलपेल की नोक से ऊपर उठाएं, इस बात का ध्यान रखें कि अंतर्निहित ड्यूरा मैटर को नुकसान न पहुंचे।
  3. खुली खिड़की को हड्डी मोम (चित्रा 2 एम) के साथ कवर करें।
  4. 0.9 मिमी व्यास के का उपयोग करके, एपिड्यूरल ईईजी इलेक्ट्रोड के भविष्य के प्लेसमेंट के लिए तीन छेद ड्रिल करें (ऊपर चरण 1.15 देखें) इस बात का ध्यान रखते हुए कि ड्यूरा मैटर (चित्रा 2ई, एल) के माध्यम से न काटा जाए।
  5. हड्डी के मोम के साथ तीन छेद ों को कवर करें।
  6. हड्डी-मोम से ढकी इमेजिंग विंडो और ईईजी छेद के किनारों के आसपास धीरे से साइनोएक्रिलेट लागू करें, क्रैनियोटॉमी को सील न करने के लिए सावधान रहें (चित्रा 2 एल)।
  7. दंत सीमेंट की एक दीवार बनाएं जो इमेजिंग विंडो और ईईजी छेद को शामिल करती है और इसे पहले से सीमेंटेड हेड-कैप (चित्रा 2 एम और चित्रा 3 बी, आइटम एम) से बांधती है।
  8. सीमेंट को कम से कम 10 मिनट तक सूखने दें।
  9. 4-0 या 5-0 काले चोटी वाले रेशम (चित्रा 2 एन और चित्रा 3 सी) का उपयोग करके सरल बाधित सीवन के साथ किसी भी ढीले घाव मार्जिन को बंद करें।

4. सर्जरी के बाद

  1. घाव के किनारे के आसपास संवेदना को कम करने के लिए उजागर त्वचा के चारों ओर लिडोकेन मलहम लगाने के लिए एक कपास युक्त एप्लिकेटर का उपयोग करें।
  2. उजागर त्वचा पर नियोस्पोरिन लगाने के लिए एक बाँझ कपास-टिंप एप्लिकेटर का उपयोग करें।
  3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (चित्रा 2 एन) से जानवर को हटा दें।
  4. पोस्ट-सर्जिकल एनाल्जेसिया के लिए केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) आईपी या आईएम इंजेक्ट करें।
  5. जानवर का निरीक्षण करें जब तक कि वह सतर्क और चलता न हो (यह आमतौर पर मिनटों के भीतर होगा)।
  6. जानवर को एक गर्म पिंजरे में रखें और उसकी वसूली की निगरानी करना जारी रखें जब तक कि वह पीता या खाता है और पशु आवास में स्थानांतरित करने के लिए तैयार नहीं होता है।
  7. सर्जरी के बाद लगभग एक सप्ताह के लिए रोजाना कम से कम एक बार जानवर की जांच करें, सूचीहीन व्यवहार और / या अपर्याप्त खाने / पीने के किसी भी संकेत को देखें (चित्रा 2 ओ)।

5. डाई इंजेक्शन और ईईजी रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए हेड-कैप इम्प्लांटेशन सर्जरी के बाद कम से कम एक दिन प्रतीक्षा करें।
  2. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (चित्रा 3 बी, आइटम एन और जे) के भीतर, माउस को अपने शरीर में ढाले गए फोम-निरोधक डिवाइस में रखें।
  3. हेड-कैप (चित्रा 3 बी-आई, आइटम एम) को कस्टम माउंटिंग बार में सुरक्षित करें जो स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम (चित्रा 3 ए, बी, आइटम ई और जे, और चित्रा 4 ए) से जुड़ा हुआ है। आइटम ई (चित्रा 3ए, बी) के लंबे खंड की लंबाई 9.4 - 13 मिमी के बीच होनी चाहिए। आइटम f (1.5 सेमी x 0.5 सेमी आयाम वाली एक माउंटिंग प्लेट, जिसमें दो छेद केंद्र से केंद्र तक 4 मिमी अलग होते हैं) को आइटम e (चित्रा 3A, B, आइटम e, f और k) में फिक्स करें। यह संरेखण प्रणाली जागृत माउस को इमेजिंग सत्रों (चित्रा 4) के दौरान स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में सुरक्षित रूप से स्थान देगी।
  4. एपिड्यूरल ईईजी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (चित्रा 5 ए) डालें, पीछे के केंद्रीय छेद के भीतर ग्राउंड इलेक्ट्रोड (सफेद तार) रखें, और पूर्ववर्ती बाएं और दाएं छेद (चित्रा 2 ई, चित्रा 4 ई और चित्रा 5 ई) में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (लाल तार)। विद्युत संपर्क को अनुकूलित करने के लिए खोपड़ी और ड्यूरा मैटर (चित्रा 5 सी) के बीच प्रत्येक तार को एल-आकार में रखें।
  5. हिप्पोकैम्पस के भीतर रक्त प्रवाह की कल्पना करने के लिए पूंछ की नस को हरे फ्लोरेसिन लाइसिन-फिक्सेबल डेक्सट्रान (0.2 एमएल / 25 ग्राम बॉडी डब्ल्यूटी फ्लोरेसिन 5% डब्ल्यू / डब्ल्यू) के साथ इंजेक्ट करें।
    1. इंजेक्शन से पहले माउस की पूंछ की केंद्रीय नस के फैलाव को बढ़ाने के लिए, निम्नलिखित रणनीतियों में से एक या अधिक का उपयोग करें: ए) कपास-टिंप एप्लिकेटर का उपयोग करके केंद्रीय नस में 70% इथेनॉल लागू करें; बी) 1-3 मिनट के लिए गर्म पानी (35-40 डिग्री सेल्सियस) में पूंछ डुबोएं; सी) पूंछ को कुछ मिनटों के लिए हीटिंग लैंप में उजागर करें।
    2. दो उंगलियों के साथ माउस की पूंछ को सुरक्षित करें और केंद्रीय नस का पता लगाएं, जो त्वचा के ठीक नीचे स्थित है। सुई (एकीकृत सुई 30 ग्राम के साथ अल्ट्राफाइन इंसुलिन सिरिंज) को नस में डालें, पूंछ के आधार से लगभग आधे से दो तिहाई तक। इंजेक्शन के दौरान सुई को पूंछ के समानांतर रखें।
    3. सुई या पूंछ की स्थिति में किसी भी बदलाव से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, डाई को धीरे-धीरे और लगातार इंजेक्ट करें।
      नोट: सिरिंज प्लंजर को दबाने पर कोई प्रतिरोध नहीं होना चाहिए।
    4. इंजेक्शन पूरा करने के बाद, सुई को वापस लें और पोत को सील करने के लिए पंचर साइट पर कोमल दबाव लागू करें।
    5. थक्के बनने दें।

6. विवो फाइबर-ऑप्टिक-बंडल-युग्मित प्री-क्लिनिकल कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग एंडोमाइक्रोस्कोपी (पीसीएलई) में।

  1. सीधे टेल वेन इंजेक्शन (ऊपर चरण 5.5.3) के बाद, रोबोटिक स्टीरियोटैक्सिक ड्राइव के मोबाइल आर्म में नीचे की ओर अभिविन्यास में 300 μm बेवेल्ड फाइबर-ऑप्टिक बंडल (प्रत्येक बंडल में 5000-7000 3 μm फाइबर युक्त) को दबाएं।
  2. क्रानियोटॉमी से हड्डी के मोम को हटा दें।
  3. सिरिंज सुई की झुकी हुई नोक का उपयोग करके ड्यूरा को हटा दें।
  4. रोबोटिक पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग करके, सबसे पहले फाइबर उद्देश्य को उचित पूर्ववर्ती-पीछे और बाएं-दाएं स्टीरियोटैक्सिक स्थान पर ले जाएं, जिसमें कॉर्टेक्स की सतह पर जेड-अक्ष में टिप शून्य हो।
  5. ईईजी रिकॉर्डिंग शुरू करें (चित्रा 5 डी)।
  6. फाइबर-उद्देश्य के पिछले विमान की कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग शुरू करें, इसके बाद रोबोटिक माइक्रोड्राइव के जेड-कंट्रोल का उपयोग करके जेड-अक्ष में धीरे-धीरे उद्देश्य को नीचे उतारें, जब तक कि यह मस्तिष्क के भीतर लक्ष्य गहराई तक न पहुंच जाए (चित्रा 4 सी)। उतरते समय माइक्रोस्कोपिक सॉफ्टवेयर में इमेजिंग परिणाम देखें।
    1. यदि फाइबर टिप लक्ष्य एक्स-वाई-जेड रिकॉर्डिंग क्षेत्र के भीतर है, और दो या अधिक वाहिकाएं इमेजिंग विंडो के एफओवी में प्रवेश करती हैं, तो वंश को रोकें और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करें। सेलविज़ियो लैब के इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 11.7 हर्ट्ज पर रक्त प्रवाह की लाइव फुल-फील्ड टाइम-लैप्स फिल्में प्राप्त करें। (उच्च गति एक छोटे एफओवी के साथ प्राप्त की जा सकती है)। रिकॉर्डिंग एक समय में 4-5 घंटे के लिए हो सकती है, यदि आवश्यक हो तो लगातार दिनों में।
  7. सुई की नोक पर लगाए गए सिलिकॉन ट्यूबिंग के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, समय-समय पर चूहों के छर्रों से बने पेस्ट को पानी के साथ प्रदान करके रिकॉर्डिंग के दौरान जानवर को खिलाएं।
  8. इमेजिंग सत्र के अंत में, रिकॉर्डिंग को समाप्त करें।
  9. धीरे से ईईजी लीड को हटा दें और उन्हें टेरगाजाइम के साथ साफ करें।
  10. प्रवेश के जेड-अक्ष के साथ फाइबर को उलटकर धीरे-धीरे जानवर के मस्तिष्क से फाइबर-ऑप्टिक बंडल को हटा दें।
  11. जानवर को सिर पोस्ट और शरीर संयम से मुक्त करें।
  12. यदि उचित हो, तो रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करने के लिए आवश्यक इच्छामृत्यु और ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल का पालन करें।
  13. यदि भविष्य के सत्र में एक ही जानवर से रिकॉर्ड करने की योजना बना रहे हैं, तो इमेजिंग विंडो को हड्डी मोम या सिलास्टिक के साथ कवर करें।

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Representative Results

हमने इन तरीकों को यह आकलन करने के लिए विकसित किया है कि क्या हिप्पोकैम्पस में असामान्य पेरिसिलेट-संचालित केशिका वासोस्पाज्म - दौरे के परिणामस्वरूप होता है - फ्रैंक हाइपोक्सिया का कारण बन सकता है जो आईसीटील फोकस 9,13 में कोशिका मृत्यु में योगदान देता है।

हेड-कैप के विकास और इसकी उचित स्थापना ने रिकॉर्डिंग में उच्च-स्थिरता प्रदान की, जिससे ईईजी की एक साथ रिकॉर्डिंग और जंगली-प्रकार और मिर्गी जागृत चूहों के हिप्पोकैम्पस में रक्त प्रवाह की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति मिली। दौरे से संबंधित रक्त प्रवाह की घटनाओं को पकड़ने के लिए विस्तारित अवधि के लिए रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है, ताकि प्रेरित और स्वाभाविक रूप से होने वाले मिर्गी के दौरे दोनों के जवाब में आवधिक रक्त प्रवाह की घटनाओं (जैसे वासोस्पाज्म) को कैप्चर किया जा सके। संयम प्रणाली ने लंबे समय तक गहरे मस्तिष्क माइक्रोवाइल और उनके समीपस्थ भित्ति कोशिकाओं के स्थिर रक्त प्रवाह रिकॉर्डिंग की अनुमति दी (चित्रा 6ए-आर)। हमने पाया कि, पूरे माइक्रोवेसल्स में, रक्त प्रवाह रुक गया और लेबल किए गए भित्ति कोशिकाओं की स्थिति में हो गया।

हमने एक मानक स्टीरियोटैक्सिक एटलस से आंतरिक निर्देशांक के साथ लक्षित रोबोट स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस में जहाजों को विश्वसनीय रूप से स्थित किया। हमने फाइबर रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता को रक्त प्रवाह के उच्च-रिज़ॉल्यूशन दो-फोटॉन इमेजिंग रिकॉर्डिंग और कॉर्टिकल ऊतक से समकक्ष वासोस्पाज्म से तुलना करके सत्यापित किया, गहराई पर जो दो-फोटॉन इमेजिंग तक पहुंच सकता है (चित्रा 6एस-एए)। हमने रिकॉर्डिंग साइटों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके पीसीई परिणामों को सत्यापित किया, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाने के लिए कि हिप्पोकैम्पल भित्ति कोशिकाओं को सही ढंग से लक्षित किया गया था और वे न केवल संकुचित थे, बल्कि धमनी15 (चित्रा 7) से दूर माइक्रोवाइल में सख्ती से भी जुड़े थे।

इन विधियों के साथ प्रकाशित निष्कर्ष वास्तव में दौरे से प्रेरित असामान्य हिप्पोकैम्पल केशिका वासोस्पाज्म दिखाते हैं, साथ ही केवी 1.1 मिर्गी उत्परिवर्ती चूहों और केनेट मॉडलमिर्गी चूहों 9,13 में सहसंबद्ध कोशिका मृत्यु भी दिखाते हैं। ये परिणाम असामान्य वासोस्पाज्म के कारण दौरे के दौरान कोशिका मृत्यु में स्थानीय आईसीटील इस्किमिया / हाइपोक्सिया की भूमिका का संकेत देते हैं, और काम के बढ़ते शरीर में योगदान करते हैं जो आईसीटील सेल मृत्यु के संभावित तंत्र पर विस्तार करता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। हमने जागृत मिर्गी चूहों और डब्ल्यूटी लिटरमेट्स दोनों के हिप्पोकैम्पल केशिकाओं में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का संचालन करते हुए ईईजी दर्ज किया। फ्लोरेसिन के साथ पूंछ की नस को इंजेक्ट करने के बाद, हमने मस्तिष्क में गहरे केशिका रक्त प्रवाह की गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए 0.3 मिमी के टिप व्यास के साथ एक फाइबर-उद्देश्य के साथ एक नोवेल प्रीक्लिनिकल कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग एंडोमाइक्रोस्कोपी (पीसीएलई) का उपयोग किया। पीला रक्त प्रवाह में वृद्धि को इंगित करता है, और लाल स्थिर या कम प्रवाह को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हेड-कैप इम्प्लांटेशन सर्जरी के लिए प्रोटोकॉल। ए) एनेस्थेटाइज्ड जानवर को हीटिंग पैड पर रखा गया था और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (चित्रा 3 बी, आइटम जे देखें) के भीतर तैनात किया गया था और हीटिंग पैड पर माउस ईयर-बार (चित्रा 3 ए, आइटम आई) और जबड़े धारक कफ (चित्रा 3 ए, आइटम जी, एच) के साथ सुरक्षित किया गया था। बी) कपाल सीवन का जोखिम। C-D) ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के माप। ई) जानवर की खोपड़ी पर ड्रिलिंग स्थानों का विज़ुअलाइज़ेशन। काले बिंदु और वर्ग हिप्पोकैम्पस पर खिड़की को इंगित करते हैं जो पीसीईएल सम्मिलन की अनुमति देगा। दो लाल घेरे ईईजी रिकॉर्डिंग तारों के लिए सम्मिलन की स्थिति को चिह्नित करते हैं। सफेद बिंदु ईईजी ग्राउंड तारों के सम्मिलन बिंदु को चिह्नित करता है। च) खोपड़ी पर चार काले बिंदु हिप्पोकैम्पस पर इमेजिंग विंडो क्रैनियोटॉमी के भविष्य के कोनों को चिह्नित करते हैं। स्टीरियोटैक्टिक माइक्रोड्राइव पोजिशनर (चित्रा 3 ए, आइटम डी) से जुड़े हेडपोस्ट प्रत्यारोपण (चित्रा 3 ए, आइटम ए) के साथ कस्टम संरेखण टुकड़ा (चित्रा 3 ए, आइटम सी)। G-H) दो अतिरिक्त बिंदु, एक पश्चवर्ती (जी) और एक पूर्ववर्ती (एच) हेड-कैप एंकर स्क्रू (चित्रा 3 ए, आइटम बी) के भविष्य के स्थान को चिह्नित करते हैं। I-J) दो छोटे पेंच सिर की टोपी को खोपड़ी तक लंगर डालते हैं (चित्रा 3 ए, आइटम बी)। के) साइनोएक्रिलेट और डेंटल सीमेंट पैनल I & J. L) हिप्पोकैम्पस पर इमेजिंग विंडो क्रैनियोटॉमी, और ईईजी इलेक्ट्रोड के लिए तीन छेद ड्रिल किए गए हैं। एम) इमेजिंग कक्ष तीन ईईजी छेद और इमेजिंग विंडो को घेरने के लिए अतिरिक्त दंत सीमेंट के साथ एक बेरम को गढ़कर बनाया गया है (चित्रा 3 बी, आइटम आई, एम)। एन) तैयार हेड-कैप का ओवरहेड दृश्य। ओ) प्रत्यारोपण सर्जरी के बाद बरामद माउस अपने पिंजरे में वापस आ गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री (निचले-केस अक्षरों के साथ गणना की गई विशिष्ट वस्तुएं)। ए) हेड-कैप बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री। (ए) दो एम 1.6 x 12 मिमी मशीन स्क्रू (हेडपोस्ट प्रत्यारोपण)। (ख) खोपड़ी में सिर की टोपी को सुरक्षित करने के लिए दो छोटे बोल्ट। (ग) एक कस्टम एल-आकार का स्टेनलेस-स्टील संरेखण टुकड़ा, जिसमें दो छेद 4 मिमी अलग होते हैं, जो सर्जरी के दौरान दो एम 1.6 स्क्रू को सुरक्षित करता है। (d) स्टीरियोटेक्सिक डिवाइस पर लगाया गया एक मानक माइक्रोड्राइव आइटम c. (e) (f) संरेखण टुकड़े के साथ एक कस्टम माउंटिंग बार जो आइटम c. (g) एक बाइट बार और (h) जानवर के सिर की स्थिति को स्थिर करने के लिए नाक क्लैंप से मेल खाता है। बी) रिकॉर्डिंग के दौरान सेटअप। (i) एनेस्थेटाइज्ड इम्प्लांटेशन सर्जरी के दौरान हेड-कैप को आइटम एफ से सुरक्षित किया जाता है। (जे) एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम माइक्रोड्राइव (आइटम डी) को रखता है। (एल) एक 21 जी सुई माइक्रोड्राइव (आइटम डी) से जुड़ी होती है और इसका उपयोग ब्रेग्मा और लैम्ब्डा क्रैनियल सीवन की स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जाता है। (एम) एक नकली हेड-कैप को यहां चित्रित किया गया है, जो आइटम एफ से जुड़ा हुआ है, ताकि (एन) फोम-लाइन ्ड नियंत्रक-ट्यूब (माउस मौजूद नहीं) में माउस की स्थिति प्रदर्शित की जा सके। आइटम एन खुद को माउस के शरीर के आकार में ढालता है। सी) सर्जरी करने के लिए आवश्यक उपकरण और आपूर्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: रिकॉर्डिंग सत्र सेटअप। ए) जानवर का सिर तय किया गया है। बी) ईईजी रिकॉर्डिंग तारों का स्थान। खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष में सफेद ईईजी तार अलग से रखे जाते हैं। लाल ईईजी तारों को मध्य-तल (जमीन) छेद में एक साथ रखा जाता है। सी) फाइबर-ऑप्टिक बंडल लक्ष्य खिड़की में डाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ईईजी रिकॉर्डिंग। ए) एपिड्यूरल ईईजी रिकॉर्डिंग फिजियोटेल एफ 20-ईईटी ट्रांसमीटरों के साथ आयोजित की जाती है, साथ ही साथ जागृत जानवर में फाइबर-ऑप्टिक पीसीएलई रिकॉर्डिंग के लिए। बी) ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए लीड डालने के लिए ड्रिल किए गए छेदों का स्थान। दो लाल लीड लाल बिंदुओं द्वारा इंगित दो छेदों में जाते हैं। सफेद बिंदु द्वारा इंगित छेद में दो सफेद लीड को एक साथ डाला जाता है। लाल वर्ग जानवर के हिप्पोकैम्पस पर लक्ष्य खिड़की को नामित करता है। माउस की खोपड़ी पर 'बी' अक्षर ब्रेग्मा को इंगित करता है। सी) ईईजी रिकॉर्डिंग तारों को खोपड़ी और ड्यूरा पदार्थ के बीच विद्युत संपर्क बढ़ाने के लिए एल-आकार में झुकाया जाता है। डी) जागृत चूहों में ईईजी रिकॉर्डिंग के उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: चूहों में भित्ति कोशिका वाहिकासंकीर्णन की रिकॉर्डिंग। A-R) विवो फाइबर-ऑप्टिक डुअल-बैंड पीसीईएल छवि में केशिका वासोस्पाज्म (हरे रंग में वाहिकाओं, 2एमडी फ्लोरेसिन-संयुग्मित डेक्सट्रान के साथ लेबल) को भित्ति कोशिकाओं (लाल, एलेक्सा फ्लुर 647 के अंतःशिरा नस पूंछ इंजेक्शन के माध्यम से लेबल किया जाता है) को दौरे के दौरान जागृत नॉकआउट चूहों में जोड़ा जाता है (तीर भित्ति कोशिका और संबंधित वासोस्पाज्म को इंगित करता है)। वीडियो 1 और वीडियो 2 देखें। एस-डब्ल्यू)। विवो टू-फोटॉन स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोपी (टीपीएलएसएम) में एक जंगली प्रकार के माउस के केशिका वाहिकाओं (हरे) और भित्ति कोशिकाओं (लाल) का स्टैक। वीडियो 3 देखें। X-Z) विवो टीपीएलएसएम में कैनिक चूहों के भित्ति-कोशिका-स्थानीयकृत (लाल) केशिका कसना होता है। वीडियो 4 देखें। AA) सफेद रेखा पर मापा गया पैनल एक्स-जेड से पोत कसना का परिमाणीकरण। पैनलों के लिए स्केल ए-आर = 5 μm; एस-डब्ल्यू = 25 μm; X-Z = 5 μm. वीडियो 11.7 हर्ट्ज पर रिकॉर्ड किए गए थे। लील-कैम्पानारियो एट अल.8 से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: रिकॉर्ड किए गए मस्तिष्क का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। A-B) विभिन्न आवर्धन पर वाहिकाओं को फ्लोरेसिन डेक्सट्रान (हरा) के साथ इंजेक्ट किया जाता है। नीले रंग (सफेद तीर) में DAPI-दाग वाले सेलुलर नाभिक। ए के लिए स्केल बार = 200 μm; B के लिए स्केल बार = 100 μm। सी) मस्तिष्क के विभिन्न खंड को फ्लोरेसिन के साथ इंजेक्ट किया जाता है जहां एक लाल रक्त कोशिका (लाल तीर) स्पष्ट रूप से देखी जाती है। स्केल बार = 50 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: केओ हिप्पोकैम्पल केशिका में वासोस्पाज्म और भित्ति कोशिका रक्त प्रवाह (11.7 हर्ट्ज) दर्ज किया गया। चित्र 6A-H में एक ही रिकॉर्डिंग से फ़्रेम देखें. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: वासोस्पाज्म, ल्यूकोसाइट रुकावटें, रक्त प्रवाह और भित्ति कोशिकाएं डब्ल्यूटी हिप्पोकैम्पल केशिका (11.7 हर्ट्ज) में दर्ज की गईं। चित्रा 6I-R में एक ही रिकॉर्डिंग से फ़्रेम देखें. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 3: टीपीएलएसएम के साथ दर्ज विवो डब्ल्यूटी माउस पार्श्विका कॉर्टेक्स में गैर-समान रक्त प्रवाह। चित्रा 6एस-डब्ल्यू में एक ही रिकॉर्डिंग से फ्रेम देखें। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 4: टीपीएलएसएम के साथ दर्ज किए गए कैनिक जानवर को जब्त करने के पार्श्विका कॉर्टेक्स से म्यूरल सेल-संचालित (लाल) केशिका (हरा) कसना। एक ही रिकॉर्डिंग चित्रा 6X-Z से फ़्रेम देखें. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमने जागृत चूहों में एक साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और फाइबर-ऑप्टिक पीसीईई प्रयोगों के लिए एक हेड-कैप संयम प्रणाली विकसित की, जिससे एनेस्थेटिक दवाओं के कारण संभावित प्रतिक्रिया संदूषण कम हो गया। हेड-कैप और माउंटिंग उपकरण निर्माण के लिए सरल हैं और पुरानी जागृति-व्यवहार इमेजिंग प्रयोगों के लिए पुन: प्रयोज्य हैं। हमने विवो माइक्रोस्कोपिक रक्त प्रवाह इमेजिंग, टीपीएलएसएम में स्वर्ण-मानक के खिलाफ रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता की जांच की।

हमारे द्वारा यहां वर्णित प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए कुशल शल्य चिकित्सा कौशल आवश्यक हैं। हिप्पोकैम्पस के ऊपर खिड़की को ड्रिल करते समय ड्यूरा मैटर को बरकरार रखने का ध्यान रखते हुए, सर्जरी को सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में और हमेशा एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए। अंतर्निहित वाहिका के साथ परिचित होना आवश्यक है, क्योंकि एक प्रमुख रक्त वाहिका से ऊपर काटने से अवांछनीय रक्तस्राव का खतरा पैदा होता है।

स्टीरियोटैक्सिक संरेखण में जानवर को सही ढंग से रखना यह सुनिश्चित करता है कि सिर-टोपी संलग्न करने से पहले पूर्वकाल-पीछे का विमान स्तर है। यह सुरक्षा एक मस्तिष्क एटलस की मदद से मस्तिष्क लोकी का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है।

माउस गति के परिणामस्वरूप वाहिकाओं को नुकसान हो सकता है या वासोस्पाज्म की गलत रिकॉर्डिंग (यानी, सच्चे वासोमोशन के बजाय फाइबर गति), इसलिए रिकॉर्डिंग के दौरान पशु गति को कम करना महत्वपूर्ण है। संयम ट्यूब के भीतर फोम पैडिंग माउस से तनाव और आंदोलन को कम करते हुए रिकॉर्डिंग सत्रों की अवधि का विस्तार करने में मदद करता है। चूहे फोम के भीतर स्नूली फिट होना पसंद करते हैं, इसलिए उचित फिटिंग अत्यधिक गति को कम करती है। इस सावधानी के बिना, चूहे संघर्ष कर सकते हैं। यदि माउस संघर्ष के लक्षण दिखाता है, तो रिकॉर्डिंग सत्र समाप्त कर दिया जाना चाहिए। शारीरिक तनाव प्रतिक्रियाओं के कम होने के बाद रिकॉर्डिंग अगले दिन फिर से शुरू हो सकती है। हमारी रिकॉर्डिंग में, जानवर स्पष्ट रूप से ज्यादातर समय शांत थे।

हम ध्यान दें कि पीसीईएल इमेजिंग विधि को सबसे नकारात्मक रूप से प्रभावित करने वाली गति तब होती है जब जांच मस्तिष्क के ऊतकों में अलग-अलग चलती है। पशु की श्वास, दौरे और गति अप्रासंगिक हैं जब तक कि वे ऊतक के संबंध में फाइबर-जांच को विस्थापित नहीं करते हैं। यही है, जब इमेजिंग जांच ऊतक में अलग-अलग चलती है तो पूरा इमेजिंग क्षेत्र एक इकाई के रूप में चलता है, जिससे गति कलाकृतियां स्पष्ट हो जाती हैं। इस प्रकार, एक समय में हमेशा दो या दो से अधिक वाहिकाओं से रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है: यदि सभी वाहिकाएं एक बार में चलती हैं, तो यह फाइबर अस्थिरता के कारण हो सकता है, जबकि यदि कम से कम एक पोत नहीं बदलता है, तो अन्य वाहिकाओं में देखे गए परिवर्तन रक्त प्रवाह में वास्तविक भिन्नताओं के कारण होने की संभावना है, जिसमें वासोस्पाज्म भी शामिल हैं।

टीपीएलएसएम की तुलना में पीसीईएल इमेजिंग विधि की एक सीमा यह है कि फाइबर-जांच पिया को पंचर करती है और इस प्रकार मस्तिष्क के लिए आक्रामक होती है। जैसे ही जांच उतरती है, यह तंत्रिका ऊतक को कुछ नुकसान पहुंचाती है जिससे यह गुजरता है। इस प्रकार, लगातार दो दिनों में एक ही पोत से रिकॉर्डिंग करना अत्यधिक कठिन हो सकता है, यहां तक कि दोनों सत्रों में एक ही सटीक निर्देशांक को नियोजित करते समय भी (और अक्सर केवल तभी संभव होता है जब प्रारंभिक रिकॉर्डिंग सत्र की अवधि कम हो)। इसलिए क्रोनिक रिकॉर्डिंग अध्ययन करते समय, बाद के रिकॉर्डिंग सत्रों में तेजी से अधिक गहराई पर रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है।

रक्त प्रवाह प्रयोगों के परिणाम बताते हैं कि एक्साइटोटॉक्सिसिटी आईसीटील सेल मृत्यु और हिप्पोकैम्पल स्केलेरोसिस13 के लिए एकमात्र यांत्रिक मार्ग नहीं है। यह खोज कि केशिका रक्त प्रवाह प्रतिबंध आईसीटील न्यूरोडीजेनेरेशन में एक भूमिका निभाता है, नैदानिक नैदानिक उद्देश्यों के लिए शरीर की किसी भी गहराई पर और किसी भी ऊतक में सूक्ष्म रक्त प्रवाह परिवर्तनों की पहचान के लिए यहां वर्णित तरीकों का विस्तार करने का मार्ग प्रशस्त करता है।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को अमेरिकन एपिलेप्सी सोसाइटी से एक रिसर्च इनिशिएटिव अवार्ड द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और एरिज़ोना बायोमेडिकल रिसर्च कमीशन से एसएलएम को एक पुरस्कार दिया गया था, साथ ही साथ एसयूएनआई डाउनस्टेट हेल्थ साइंसेज यूनिवर्सिटी, न्यूयॉर्क स्टेट एम्पायर इनोवेशन प्रोग्राम में ओप्थाल्मोलॉजी विभाग को अंधापन इंक को रोकने के लिए अनुसंधान से एक चुनौती अनुदान भी दिया गया था। और नेशनल साइंस फाउंडेशन (0726113, 0852636, और 1523614), बैरो न्यूरोलॉजिकल फाउंडेशन, श्रीमती मैरियन रोशेल, श्रीमती ग्रेस वेल्टन और डिग्निटी हेल्थ सीड अवार्ड्स और नेशनल साइंस फाउंडेशन (0726113, 0852636, और 1523614) से संघीय अनुदान और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (पुरस्कार R01EY031971 और R01CA258021) से एसएलएम और एसएमसी को और अनुदान प्रदान करते हैं। इस काम को स्वास्थ्य मामलों के लिए सहायक रक्षा सचिव के कार्यालय द्वारा भी पुरस्कार संख्या 10के तहत समर्थन दिया गया था। W81XWH-15-1-0138, S.L.M. एल-सी को स्पेनिश शिक्षा मंत्रालय से जोस कैस्टिलेजो फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। हम ओ कैबलेरो और एम लेडो को उनकी तकनीकी सलाह और सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। 

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.7 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-07 For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS from Handpiece solution AEU12C
Bull dog serrifine clump Fine Science Tools 18050-28
CellVizio dual band Mauna Kea Technologies
CellVizio single band Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package Reliance Dental Mfg Co. 602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw MSC industrial direct co. 2834117
Fine Point scissor Fine Science Tools 14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) Invitrogen, USA D7137
Halsey smooth needle holder Fine Science Tools 12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved Fine Science Tools 12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse Stoelting Co. 51704 51670
Methocel 2% Omnivision GmbH PZN: 04682367 Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse CWE Inc. 08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters DSI 270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT Stoelting Co.C13 51704
Sel-Tapping bone screws Fine Science Tools 19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic Stoelting Co 51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 Fine Science Tools 18020-40
Tissue separating microspatula Fine Science Tools 10091-121

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References

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Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, S., Macknik, S. L. In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice. J. Vis. Exp. (194), e57220, doi:10.3791/57220 (2023).

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