Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Summary

Vi præsenterer her, to protokoller til måling af mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømning i isolerede mitochondrier og dyrkede celler. For isolerede mitochondrier, vi detalje en plade reader-baserede Ca^{2 +} import analyse ved hjælp af Ca^{2 +} følsomme farvestof calcium grøn-5N. For dyrkede celler beskriver vi en Konfokal mikroskopi metode ved hjælp af Ca^{2 +} farvestof Rhod-2/AM.

Abstract

Ca^{2 +} håndtering af mitokondrier er en kritisk funktion regulering både fysiologiske og patofysiologiske processer i et bredt spektrum af celler. Evnen til at præcist at måle tilstrømning og udstrømningen af Ca^{2 +} fra mitokondrier er vigtige til bestemmelse af rollen mitokondriel Ca^{2 +} håndtering i disse processer. I denne rapport præsenterer vi to metoder til måling af mitokondrie Ca^{2 +} håndtering i både isolerede mitochondrier og dyrkede celler. Vi detalje først en plade reader-baseret platform til måling af mitokondrie Ca^{2 +} optagelse ved hjælp af Ca^{2 +} følsomme farvestof calcium grøn-5N. Plade reader-baseret format omgår behovet for specialiseret udstyr, og calcium grøn-5N farvestof er velegnet til måling af Ca^{2 +} fra isoleret væv mitokondrier. For vores ansøgning beskriver vi måling af mitokondrie Ca^{2 +} optagelse i mitokondrierne isoleret fra mus hjerte væv; men denne procedure kan anvendes til at måle mitokondrie Ca^{2 +} optagelse i mitokondrierne isoleret fra andre væv som leveren, skeletmuskulatur og hjerne. For det andet vil beskrive vi en Konfokal mikroskopi-baseret analyse til måling af mitokondrie Ca^{2 +} i permeabilized celler ved hjælp af Ca^{2 +} følsomme farvestof Rhod-2/AM og imaging ved hjælp af 2-dimensionelle laser scanning mikroskopi. Denne permeabilization protokol eliminerer cytosole farvestof kontamination, giver mulighed for specifikke registrering af ændringer i mitokondrie Ca^{2 +}. Derudover laser scanning mikroskopi giver mulighed for høj billedhastigheder at fange hurtige ændringer i mitokondrie Ca^{2 +} reaktion på forskellige narkotika eller reagenser, der anvendes i den eksterne løsning. Denne protokol kan anvendes til at måle mitokondrie Ca^{2 +} optagelse i mange celletyper, herunder primærelementer som hjertets myocytes og neuroner og udødeliggjort cellelinjer.

Introduction

Mitokondrier er kritiske lokaliteter af intracellulære Ca^{2 +} opbevaring og signalering. Årtiers forskning har vist, at mitokondrier har evnen til at importere og udskille Ca^{2 + 1,2}. Mitokondrier, er imidlertid ikke kun passive websteder af Ca^{2 +} opbevaring. Ca^{2 +} på den mitokondrielle rum udfører grundlæggende signaling funktioner herunder regulering af metaboliske output og aktivering af mitokondrie-medieret celle død veje, som har været gennemgået tidligere³. For metabolisk regulering øger Ca^{2 +} aktiviteten af tre matrix-lokaliseret dehydrogenases tricarboxylic syre cyklus samt respiratoriske kæde komplekser, at øge mitokondriets energi produktion^4,5 . Med mitokondrie Ca^{2 +} overbelastning og dysregulated mitokondrie Ca^{2 +} håndtering, Ca^{2 +} udløser mitokondrie permeabilitet overgangen pore (MPTP) åbning, fører til indre membran permeabilization, membran potentielle tab, mitokondriel dysfunktion, hævelse, brud og i sidste ende, celle død^6,7,8,9. Således påvirker mitokondrie Ca^{2 +} signalering direkte både cellulært liv og død stier gennem metabolisk kontrol og MPTP-død akse.

I de seneste år, der har hastigt voksende interesse for studiet af mitokondrie Ca^{2 +} dynamics skyldig i stor del til identifikation af molekylære bestanddele af den mitokondrielle Ca^{2 +} uniporter komplekse, en mitokondrie indre membran transporter, der er en primær tilstand af Ca^{2 +} importere ind i mitokondriets matrix ^10,11,12. Identifikation af disse strukturelle og regulerende underenheder af uniporter har frembragt muligheden for genetisk målretning mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømning til at modulere mitokondrie-funktion og dysfunktion og lettet studiet af den bidrag af uniporter komplekse og mitokondriel Ca^{2 +} tilstrømningen til sygdom^13,14,15. Faktisk, mitokondrie Ca^{2 +} signalering har været impliceret i patologier af en bred vifte af sygdomme lige fra hjertesygdomme neurodegeneration og kræft^{16,17,18, 19,20}.

Den grundlæggende betydning af mitokondrie Ca^{2 +} signalering i metabolisme og celledød, og kombineret med den bred rækkevidde af biologiske systemer påvirkninger at mitokondriel Ca^{2 +} signalering, metoder til at evaluere mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømning er af stor interesse. Ikke overraskende er blevet udviklet en række teknikker og værktøjer til at måle mitokondrie Ca^{2 +} . Disse omfatter metoder, der anvender værktøjer såsom fluorescerende Ca^{2 +}-følsomme farvestoffer^21,22 og genetisk kodet Ca^{2 +} sensorer målrettet til mitokondrier, såsom cameleon og aequorin^{23, 24}. Målet med denne artikel er at belyse forskellige metoder og modelsystemer som mitokondrielle Ca^{2 +} optagelse kan måles. Vi præsentere to eksperimentelle metoder til at vurdere mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømning kapacitet. Med hjerte mitokondrier som eksempel, vi detalje en plade reader-baseret platform til måling af mitokondrie Ca^{2 +} optagelse ved hjælp af Ca^{2 +} følsomme farvestof calcium grøn-5N, der er velegnet til isoleret væv mitokondrier¹⁴ . Ved hjælp af kulturperler NIH 3T3 celler, beskrive vi også en Konfokal mikroskopi imaging-baseret analyse til måling af mitokondrie Ca^{2 +} i permeabilized celler ved hjælp af Ca^{2 +} følsomme farvestof Rhod-2/AM²⁵.

Protocol

Alle metoder, der beskrives i denne protokol er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Emory University. Bemærk: Den første del er den eksperimentelle procedure til måling af mitokondrie Ca2 + tilstrømning i isolerede hjerte mitokondrier ved hjælp af en Pladelæser. 1. reagenser og løsninger Gøre 500 mL af MS-EGTA buffer til mitokondrie isolation: 225 mM mannitol, 75 mM saccharose, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-pip…

Representative Results

Figur 1 viser mitokondrie Ca2 + optagelse målinger i isolerede hjerte mitokondrierne bruger plade reader-baseret platform og Ca2 + farvning af calcium grøn-5N. Betingelser kontrol (figur 1A), cardiac mitokondrier blev suspenderet i KCl buffer indeholdende calcium grøn-5N og derefter udfordret med sekventiel pulser af CaCl2 (5 μl af en 0,6 mM CaCl2 løsning) tilføjet på 30 s, 150 s…

Discussion

Her beskriver vi to forskellige tilgange til at måle mitokondrie Ca^{2 +} tilstrømning. Plade reader-baserede calcium grøn-5N metode skærme extramitochondrial Ca^{2 +} niveauer og er en Ca^{2 +} optagelse assay, er velegnet til målinger i isolerede mitochondrier. Mens vi har vist repræsentative resultater fra isolerede murine hjerte mitokondrier, kan dette assay tilpasses let til mitokondrier isoleres fra væv med høj mitokondrie overflod herunder leveren, skeletmuskulatur og hjerne. Derudo…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440