Summary
Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.
Abstract
CA2 + verwerking door mitochondriën is een kritische functie regulering van de zowel de fysiologische en pathofysiologische processen in een breed spectrum van cellen. De mogelijkheid om de toestroom en efflux van Ca2 + uit mitochondriën nauwkeurig te meten is belangrijk voor het bepalen van de rol van mitochondriale Ca2 + behandeling in deze processen. In dit rapport presenteren we twee methoden voor het meten van mitochondriale Ca2 + behandeling in zowel geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. We detail eerst een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. De plaat lezer gebaseerde indeling omzeilt de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur, en de calcium groen-5N kleurstof is bij uitstek geschikt voor het meten van Ca2 + uit geïsoleerde weefsel mitochondriën. Voor onze toepassing beschrijven we de meting van mitochondriale Ca2 + opname in mitochondriën geïsoleerd van muis hartweefsel; deze procedure kan echter worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname in mitochondriën geïsoleerd van andere weefsels zoals lever, skeletspieren en de hersenen. Ten tweede, beschrijven we een confocal microscopie gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof Rhod-2/AM en beeldvorming met behulp van 2-dimensionale laser-scanning microscopie. Dit protocol permeabilization elimineert cytosolische kleurstof besmetting, rekening houdend met de specifieke opname van wijzigingen in mitochondriale Ca2 +. Bovendien voorziet laser scanning microscopie in hoge framesnelheid te vangen van snelle veranderingen in de mitochondriale Ca2 + in reactie op de verschillende drugs of reagentia toegepast in de externe oplossing. Dit protocol kan worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname in veel celtypen, met inbegrip van primaire cellen zoals cardiale myocytes neuronen en vereeuwigd cellijnen.
Introduction
Mitochondriën zijn kritieke sites van intracellulaire Ca2 + opslag en signalering. Decennia van onderzoek hebben aangetoond dat mitochondriën hebben de mogelijkheid om te importeren en sekwestreren Ca2 + 1,2. Mitochondriën, zijn echter niet louter passieve sites van Ca2 + opslag. CA2 + bij de mitochondriale compartiment functies fundamentele signalering met inbegrip van de verordening van metabole output en activering van mitochondriale-gemedieerde cel dood trajecten, die al herzien eerder3. Voor de verordening van het metabole verbetert Ca2 + de activiteit van drie matrix-gelokaliseerde dehydrogenases van de tricarboxylic acid cyclus evenals respiratoire ketencomplexen, te verhogen van mitochondriale energie productie4,5 . Met mitochondriale Ca2 + overbelasting en dysregulated mitochondriale Ca2 + handling, Ca2 + triggers mitochondriale permeabiliteit overgang porie (MPTP) openen, wat leidt tot mitochondriale binnenste membraan-permeabilization, membraan potentiële verlies, mitochondriale dysfunctie, zwelling, scheuren en uiteindelijk, cel dood6,7,8,9. Dus, mitochondriale Ca2 + signalering direct invloed zowel cellulaire leven en dood paden door metabole controle- en MPTP-dood as.
In de afgelopen jaren, er heeft zijn snel groeiende belangstelling voor de studie van mitochondriale Ca2 + dynamiek gepast in groot deel aan de identificatie van de moleculaire bestanddelen van de mitochondriale Ca2 + uniporter complex, een mitochondriale inner membraan-vervoerder die is een primaire modus van Ca2 + importeren in de mitochondriale matrix 10,11,12. Identificatie van deze structureel en regelgevend subeenheden van de uniporter heeft de mogelijkheid van genetisch targeting mitochondriale Ca2 + toestroom te moduleren mitochondriale functie en dysfunctie voortgebracht en vergemakkelijkt de studie van de bijdrage van de uniporter complexe en mitochondriale Ca2 + toestroom aan ziekte13,14,15. Inderdaad, de mitochondriale Ca2 + signalering heeft zijn betrokken bij de pathologieën van een divers scala aan ziekten, variërend van cardiale ziekte neurodegeneratie, en kanker16,17,18, 19,20.
Gezien het fundamentele belang van mitochondriale Ca2 + signalering in metabolisme en dood van de cel, en gecombineerd met het brede bereik van biologische systemen dat mitochondriale Ca2 + signalering gevolgen, methoden voor het beoordelen van de mitochondriale Ca2 + instroom zijn van groot belang. Niet verrassend, een verscheidenheid aan technieken en hulpmiddelen voor het meten van mitochondriale Ca2 + zijn ontwikkeld. Deze omvatten methoden die gebruik maken van hulpmiddelen zoals fluorescerende Ca2 +-gevoelige kleurstoffen21,22 engenetisch-gecodeerde Ca 2 + sensoren gericht op de mitochondriën, zoals cameleon en aequorin23, 24. Het doel van dit artikel is om te markeren van de verschillende methoden en modelsystemen waarin mitochondriale Ca2 + opname kan worden gemeten. Presenteren we twee experimentele methoden voor de beoordeling van de mitochondriale Ca2 + toestroom capaciteit. Cardiale mitochondriën als een voorbeeld gebruikt, we detail een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N die ideaal geschikt is voor geïsoleerde weefsel mitochondria14 . Met behulp van gekweekte NIH 3T3 cellen, beschrijven we ook een confocale microscopie imaging gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof Rhod-2/AM25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Emory University.
Opmerking: Het eerste deel is de experimentele procedure voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde cardiale mitochondriën met behulp van een afleesapparaat.
1. reagentia en oplossingen
- Breng 500 mL MS-EGTA buffer voor mitochondriale isolatie: 225 mM mannitol, sacharose 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 1 mM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA), pH aangepast aan 7.4 met KOH. Het steriliseren door een 0,22 μm filter en bewaren bij 4 ° C. Zorg ervoor dat de MS-EGTA buffer vooraf gekoeld tot 4 ° C vóór gebruik.
- Bereiden van 100 mL KCl Buffer: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA en pH aangepast aan 7.2 met KOH. Opslaan bij kamertemperatuur.
- Bereiden 1 mM calcium groen-5N voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO). De kalk groen-5N voorraad kan worden aliquotted en opgeslagen bij-20 ° C.
-
Substraten voor Ca2 + opname voor te bereiden.
- Bereiden 1 M natrium pyruvaat, pH 7.4. Opslaan in aliquots bij-20 ° C.
- Het bereiden van 500 mM malate, pH 7.4. Opslaan in aliquots bij-20 ° C.
2. isolatie van cardiale Mitochondria
- De muis volgens de institutionele normen euthanaseren.
Opmerking: Voor onze institutioneel goedgekeurde methode van euthanasie, muizen waren verdoofd door inademing van de isofluorane en opgeofferd door cervicale dislocatie. - Verzamelen het hart door het openen van de borstholte, snijden langs weerszijden van de ribben, begeleidende van het hart, knippen weg het middenrif, middendoor is gespleten en de hartweefsel.
Opmerking: In dit protocol, mitochondriale isolatie wordt uitgevoerd vanuit een hele hart verzameld van een volwassen muis (ongeveer 120 mg), die voldoende zijn voor 3-4 experimenten moet. Voor mitochondriale los van andere weefsels van de mitochondriën-rijke zoals de lever, kan tot 200 mg van weefsel worden gebruikt volgens het protocol beschreven. - Spoel het weefsel grondig in 25 mL ijskoud 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) ervoor te zorgen dat alle bloed uit de ventrikels is gedrukt.
Opmerking: Het hart zal voldoende gespoeld worden wanneer de vloeistof uit het hart gedrukt duidelijk loopt. - Blad voor het hart in kleine stukjes in 5 mL ijskoud 1 x PBS met behulp van een paar scherpe schaar.
- Negeren van de PBS en gehakt hartweefsel overbrengen in een vooraf gekoeld 7 mL glas-teflon dounce homogenizer met een 0.10 tot 0.15 mm speling.
- Voeg 5 mL ijskoud MS-EGTA buffer, en meng het monster tot weefsel stukken niet langer zijn zichtbaar (ongeveer 11 strokes).
Opmerking: Niet overdreven Meng het weefsel als het doel is het verkrijgen van intact en functionele mitochondriën. - Het homogenaat overbrengen in een tube van 15 mL.
- Centrifugeer het homogenaat bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten aan pellet kernen en ongebroken cellen.
- Het supernatant overbrengen in een tube vers 15 mL en Centrifugeer het bij 10.000 x g bij 4 ° C voor 10 min naar de pellet mitochondriën.
- Verwijder het supernatant en houden de mitochondriale pellet op ijs.
- Wassen van de mitochondriale pellet tweemaal met ijskoude MS-EGTA buffer. Voor elke wassen, resuspendeer de pellet van mitochondriale in 5 mL MS-EGTA buffer, het Centrifugeer bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Na de definitieve wash, verwijder het supernatant en resuspendeer de mitochondriën in 100 μl van ijs koud MS-EGTA buffer. Houd de mitochondriën op ijs.
Opmerking: Mitochondria moeten worden gebruikt voor experimenten binnen 1 uur. - Maatregel mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van een analyse van Bradford eiwit26.
3. plaat Reader gebaseerde meting van mitochondriale Calcium opname
Opmerking: Hier, het is het protocol beschreven voor het analyseren van mitochondriale Ca2 + opname met behulp van een multimode-afleesapparaat uitgerust met injectoren. Een lezer met de capaciteit van het lezen van calcium groen-5N fluorescentie plaat (excitatie/emissie van 506/532 nm) in een kinetische modus met geautomatiseerde reagens injectoren te houden van de reactie beschermd tegen licht kunnen worden gebruikt.
- Programma de afleesapparaat voor het uitvoeren van een kinetische Lees van calcium groen-5N fluorescentie met metingen per seconde voor een totale assay tijd van 1000 s. Daarnaast, program van de injectoren reagens af te zien van 5 μL van CaCl2 oplossing om de 30 s, 150 s, 300 s , 480 s en 690 s tijd punten.
Opmerking: De timing van de CaCl2 injecties zijn door de gebruiker gedefinieerd en kunnen worden aangepast voor volgens de experimentele behoeften. - Prime de injectoren reagens met de CaCl2 oplossing worden gebruikt.
Opmerking: De concentratie van de oplossing van de2 CaCl is door de gebruiker gedefinieerd, en op de volgende punten en titreer de hoeveelheid Ca2 + moet leiden tot opening van de MPTP kan worden aangepast. - 200 μg mitochondria toevoegen aan een afzonderlijke putje van een 96 goed plaat.
- Voeg het juiste volume van KCl buffer naar de waterput zodat het totale volume van de mitochondriën en KCl buffer om 197 μL gaat.
- 1 μL van pyruvaat 1 M en 1 μL van 500 mM malate toevoegen aan het mengsel van de mitochondriën. Pipet zachtjes te mengen, en Incubeer de mitochondriën met de substraten gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur toe mitochondria te worden energiek.
- Voeg 1 μl van 1 mM calcium groen-5N voorraad. Meng zachtjes door pipetteren.
Opmerking: Beschermen de reactie tegen licht na de toevoeging van de kalk groen-5N kleurstof. - Start de voorgeprogrammeerde kinetische protocol en monitor calcium groen-5N fluorescentie.
4. reagentia en oplossingen
Opmerking: Het tweede deel is experimentele procedure voor confocal beeldvorming van mitochondriale Ca2 + in gekweekte cellen
- Tyrode de oplossing (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose, en 10 mM HEPES, pH 7,2 met KOH) maken Bewaren bij 4 ° C. Warm het op kamertemperatuur vóór gebruik.
- Bereid Wash-oplossing (100 mM Kaliumacetaat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0.35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM phosphocreatine, 10 mM HEPES, pH 7,2 met KOH). Bewaren bij 4 ° C. Warm het op kamertemperatuur vóór gebruik.
- Permeabilization oplossing, waarin 0.005% saponine in Wash oplossing voor te bereiden. Voorbereiden voor het vers dagelijks.
- Bereiden 0 Ca2 + interne oplossing (100 mM Kaliumacetaat, 15 mM KCl, 0.35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH aangepast aan 7.2 met KOH). Bewaren bij 4 ° C. Warm het op kamertemperatuur vóór gebruik.
- Bereid interne oplossing met Ca2 +. CaCl2 met de interne oplossing hierboven toevoegt aan het bereiken van de gewenste concentratie van gratis Ca2 +. De hoeveelheid CaCl2 toe te voegen is berekend aan de hand van het MaxChelator-programma (maxchelator.stanford.edu).
- Bereiden 1 mM Rhod-2/AM voorraad in DMSO en opslaan bij-20 ° C tot gebruik.
- Bereiden van 1 mM MitoTracker groene voorraad in DMSO en opslaan bij-20 ° C tot gebruik.
5. plating cellen voor Imaging
- Wassen van 22 x 22 cm2 glazen coverslips met 100% ethanol en laat de coverslips in de lucht droog.
- De glazen coverslips in individuele putjes van een 6-well weefselkweek schotel plaatsen.
Opmerking: Coverslips kan worden bedekt met laminin, poly-L-lysine, of vergelijkbare matrix ter bevordering van de bijlage van de cel. - Trypsinize en plaat van de cellen op de coverslips die voor ongeveer 70% samenvloeiing gericht zijn op de dag voor imaging.
6. laden cellen met de Rhod-2/AM en MitoTracker groen
- Bereiden Rhod-2/AM-MitoTracker groen werkende oplossing. Voeg 20 μL van Rhod-2/AM 1 mM voorraad, 0.2 μL van MitoTracker groen 1 mM voorraad en 2.5 μL van 20% pluronic F-127 tot 1 mL van de Tyrode oplossing. De uiteindelijke concentratie van Rhod-2 in de werkoplossing is 20 µM en de uiteindelijke concentratie van MitoTracker groen is 200 nM.
- Zachtjes Verwijder het medium van de groei van het dekglaasje aan.
Opmerking: Een wassen stap is niet nodig voordat kleurstof oplossing toevoeging. - Voeg de Rhod-2/AM-MitoTracker groene oplossing op een dropwise manier op het dekglaasje aan totdat het dekglaasje aan enkel is gedekt (ongeveer 3-4 druppels per dekglaasje aan).
- Incubeer het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om de cellen te laden met de kleurstoffen.
- -Esterify de Rhod-2/AM. Verwijder voorzichtig de Rhod-2/AM-MitoTracker groene oplossing, frisse kamertemperatuur Tyrode de oplossing te vervangen en Incubeer het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
7. confocal beeldvorming van de mitochondriale Rhod-2/AM en MitoTracker groen fluorescentie
- Het dekglaasje aan overbrengen naar de Microscoop imaging kamer en de kamer vullen met wassen oplossing.
- Schakel onder settings for observeren van cellen in fase contrast op 40 X, focus totdat cellen zichtbaar zijn en aanpassen in focus.
-
Permeabilize van het plasma-membraan van Rhod-2/AM-MitoTracker groen geladen cellen cytosol-gelokaliseerde Rhod-2, met behoud van de mitochondriën-gelokaliseerde kleurstof te verwijderen.
- Verwijder de Wash-oplossing uit het dekglaasje aan.
- Vervangen door het Permeabilization oplossing voor ongeveer 1 minuut.
- Visueel controleren de morfologie van het plasmamembraan gedurende het proces van permeabilization. Permeabel cellen zal ontwikkelen een geruwd oppervlak.
- Wanneer permeabilization voltooid is, onmiddellijk de Permeabilization oplossing verwijderen en vervangen door 0 Ca2 + interne oplossing.
- Gelijktijdig beeld Rhod-2 fluorescentie (excitatie met behulp van de 559 nm laser lijn en emissie verzameld bij golflengten tussen 575-675 nm) en MitoTracker groene fluorescentie (met behulp van de 488nm laser lijn en emissie verzameld bij golflengten tussen excitatie 505-525 nm). Focus op permeabel cellen weer te geven van een duidelijk colocalization van Rhod-2 en MitoTracker groen.
- Verminderen van de Microscoop laser en krijgen de instellingen zodanig dat de mitochondriale Rhod-2 fluorescentie dim en net zichtbaar.
- Selecteer instellingen voor Microscoop te verwerven van 2-dimensionale scans op een passende frame rate en tijd cursus voor de specifieke toepassing. Een framesnelheid van ten minste 30 frames per seconde wordt aanbevolen om de kinetiek van veranderingen in mitochondriale Ca2 +nauwkeurig te vangen.
- Verwijder de 0 Ca2 + interne oplossing zonder verstoring van de cellen of Microscoop focus.
- Beeldacquisitie starten
- Voeg Ca2 +-vol interne oplossing 10 s tegelijkertijd wijs handmatig of met een perfusie-systeem.
- Selecteer de regio's van belang (ROIs) te omvatten van de regio's van de colocalization tussen mitochondriale Rhod-2 en MitoTracker groene signaal in de afbeelding acquisitie software.
Opmerking: Willekeurige fluorescentie (F) waarden voor elk punt van de tijd van de opname worden verkregen voor elke ROI. Deze waarden zijn achtergrond afgetrokken en genormaliseerd naar de eerste fluorescentie (vóór Ca2 + toevoeging; F0) en uitgezet als F/F0 na verloop van tijd voor de presentatie van gegevens en kwantificering van de amplitude van de verandering van mitochondriale Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont mitochondriale Ca2 + opname metingen in geïsoleerde cardiale mitochondriën met behulp van de plaat lezer gebaseerde platform en de Ca2 + kleurstof calcium groen-5N. Onder controlevoorwaarden (figuur 1A), cardiale mitochondriën werden opgeschort in KCl buffer met calcium groen-5N en vervolgens uitgedaagd met opeenvolgende pulsen van CaCl2 (5 μl van een 0.6 mM CaCl2 oplossing) toegevoegd om de 30 s, 150 s, 300 s, 480 s en 690 s tijd punten. De timing en het aantal CaCl2 toevoegingen kunnen worden aangepast door de gebruiker te voorzien van volledige mitochondriale opname van toegevoegde Ca2 + voorafgaand aan de latere toevoegingen. In deze test weerspiegelen stijgingen van de kalk groen-5N signaal verhoogde buffer Ca2 + . Aangezien mitochondriën importeren Ca2 +, vermindert Ca2 + wordt verwijderd uit de buffer en de kalk groen-5N fluorescentie. Nog belangrijker is, op de derde toevoeging van Ca2 +, de kalk groen-5N fluorescentie curve ondergaat een plotselinge en scherpe flexie naar boven, in plaats van verwijderen Ca2 + uit de buffer en wordt aangegeven door de rode pijl in figuur 1A . Deze plotselinge stijging van de fluorescentie weerspiegelt mitochondriale Ca2 + overbelasting en MPTP openen. Het totale bedrag van Ca2 + in beslag genomen door de mitochondriën vóór activering van de MPTP weerspiegelt de mitochondriale Ca2 + capaciteit, en kan worden uitgedrukt als μmol Ca2 +/mg eiwit. Door aanpassingen aan de timing en de concentraties van de calcium toegevoegd, de hoeveelheid Ca2 + nodig om te activeren kan permeabiliteit overgang worden bepaald. In figuur 1B, mitochondriën waren vooraf behandeld gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met 10 μM Ru360, een goed gekarakteriseerd Inhibitor van de omwenteling van de mitochondriale Ca2 + uniporter complexe27. Ru360 remt uniporter-afhankelijke mitochondriale Ca2 + opname, en dit wordt bewezen door de stapsgewijze verhogingen in calcium groen-5N fluorescentie na elke Ca2 + toevoeging.
Voor confocal beeldvorming van mitochondriale calcium met behulp van Rhod-2/AM, tonen we de representatieve resultaten van NIH 3T3 cellen. MitoTracker green is een mitochondriën-selectieve kleurstof, die bij voorkeur het mitochondriaal netwerk (figuur 2A vlekken). Na saponine-gemedieerde permeabilization van het plasma-membraan, cytosolische Rhod-2 is weggewassen, verlaten van een Rhod-2 stained mitochondriële netwerk dat mede met het groene MitoTracker (figuur 2A lokaliseert). Rhod-2 kan ook zich ophopen in niet-mitochondriale structuren, dus ROI is te analyseren moet richten van regio's van de lokalisatie van de samenwerking tussen de MitoTracker groene en Rhod-2. In de cellen, de toevoeging van een Ca2 +-vol interne oplossing met 2 μM gratis Ca2 + veroorzaakt een snelle stijging in Rhod-2 fluorescentie, die wordt geremd wanneer uniporter complex wordt geremd met 10 μM Ru360 (figuur 2B).
Figuur 1: Mitochondriale Ca2 + opname in geïsoleerde cardiale mitochondriën. (A) grafieken van relatieve calcium groen-5N fluorescentie van controle hart mitochondriën en (B) mitochondriën vooraf behandeld met 10 μM Ru360 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, uitgedaagd met 5 μl van 0.6 mM CaCl2 (zwarte pijlen). Mitochondriale Ca2 + overbelasting-geïnduceerde permeabiliteit overgang wordt aangegeven met het rode pijltje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Representatieve analyse van mitochondriale Ca2 + in permeabel cellen. (A) vertegenwoordiger fluorescentie beeld van 3T3 cellen geladen met rhod-2 (rood) en de MitoTracker green (groen) en de samengevoegde afbeeldingen van rhod-2 en MitoTracker groen (geel) na permeabilization met saponine. (B) Rhod-2 tl trace uit een cel één 3T3 tijdens toepassing van 2 µM gratis Ca2 + interne oplossing onder controlevoorwaarden (zwarte sporen) of na 10 µM Ru360 voorbehandeling (rode trace). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we twee verschillende benaderingen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom. De plaat lezer gebaseerde calcium groen-5N methode monitoren extramitochondrial Ca2 + niveaus en is een Ca2 + opname test die is uitermate geschikt voor metingen in geïsoleerde mitochondriën. Terwijl wij representatieve resultaten uit geïsoleerde lymfkliertest cardiale mitochondriën hebben aangetoond, is deze test kunnen gemakkelijk aangepast voor mitochondria geïsoleerd uit weefsels met hoge mitochondriale overvloed, met inbegrip van de lever, de skeletspieren en de hersenen. Bovendien kan de plaatsysteem van de lezer een ideale optie voor laboratoria waar gespecialiseerde apparatuur traditioneel gebruikt voor Ca2 + metingen, zoals fluorometers, niet altijd onmiddellijk beschikbaar zijn. De beperkte maximale tijdsduur dat een afleesapparaat scannen kunt en de noodzaak om vooraf program reagens toevoegingen een zwakte van deze techniek kan worden vergeleken met fluorometers, echter, de kosten en beschikbaarheid van fluorometers kan opwegen tegen dit voordeel. Door het variëren van de concentratie van Ca2 + in de reagens injectoren, kan het bedrag van Ca2 + die mitochondriën kundig sekwestreren zijn voor triggering MPTP openen (de mitochondriale Ca2 + capaciteit) worden bepaald.
De confocal imaging protocol dat we voor Rhod-2/AM metingen van mitochondriale Ca2 beschrijven + is ideaal voor gekweekte cellen en kan ook worden aangepast voor primaire cellen. Bij deze methode wordt is het plasma-membraan permeabel met saponine, waarmee de wegspoeling van cytosolische kleurstof. Alleen de kleurstof in de val gelokt in organellen blijft na deze procedure, zodat nauwkeurige en specifieke meting van mitochondriale fluorescentie. Bovendien biedt deze cel permeabel assay experimentele controle over extramitochondrial Ca2 + niveaus, alsmede gebruiker gedefinieerde voorwaarden waaronder de mitochondriën zijn blootgesteld. Rhod-2/AM confocal beeldvorming van mitochondriale Ca2 + in intact, niet-permeabel cellen mogen worden gebruikt, maar dit vereist de optimalisatie van de kleurstof laden en ambtshalve verestering om ervoor te zorgen een mitochondriën-specifieke Rhod-2 lokalisatie28. De troeven van de methode Rhod-2/AM zijn dat Rhod-2/AM commercieel beschikbaar is en de kleurstof kan gemakkelijk worden toegepast op een breed scala aan celtypes. De lokalisatie van de kleurstof Rhod-2, is echter een beperking te worden beschouwd. Om ervoor te zorgen de meting van de mitochondriën-specifieke Rhod-2 fluorescentie, kan een tweede spectraal-verschillende kleurstof, zoals MitoTracker groen, worden gebruikt om vlekken van mitochondriën voorafgaand aan de beeldvorming. Genetisch-gecodeerde Ca 2 + sensoren gericht op de mitochondriën kunnen het omzeilen van dit probleem, echter de cellen moeten worden transfected/getransduceerde met de constructie van de sensor en hebben genoeg tijd om uit te drukken van het eiwit. Dit is niet altijd ideaal voor primaire cellen met beperkte overlevingstijd en kleurstof laden mogelijk een tijdbesparende proces.
In beide protocollen gebruikten we de uniporter complexe remmer Ru360 ter illustratie van de effect-mitochondriale Ca2 + toestroom remming. Ru360 is de gouden standaard voor uniporter inhibitie en tot op heden, is de enige bekende specifieke inhibitor van de omwenteling van deze tranporter29. U kunt ook ruthenium rood kan ook gebruikt worden, ruthenium rood is echter een niet-specifieke uniporter-remmer die heeft aangetoond dat ook remmen Ca2 + vrijlating uit de sarcoplasmic reticulum30. Verminderde mitochondriale Ca2 + behandeling kunnen een teken van mitochondriale dysfunctie, aangezien het uniporter complex-afhankelijke Ca2 + vervoer Mitochondriale membraanpotentiaal dat afhankelijk, en bij uitbreiding, dit is afhankelijk van de functie van de respiratoire keten . Dus, mitochondriaal uncouplers, zoals carbonyl cyanide -4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP) en carbonyl cyanide m- chlorofenyl hydrazon (CCCP) die verdrijven van Mitochondriale membraanpotentiaal, kunnen ook worden gebruikt als besturingselement verbindingen om te remmen mitochondriale Ca2 + toestroom. Aangezien mitochondriën sites van intracellulaire Ca2 + opslag zijn, kunnen de mitochondriën functioneren als Ca2 + buffers in de intracellulaire ruimte. Dus, veranderingen in het mitochondriale Ca2 + behandeling mogelijk van invloed op de vorm van het cytosolische Ca2 + landschap. Gezien het groeiende aantal ziekten waar de mitochondriale Ca2 + dynamiek een rol kan spelen, de methoden geïllustreerd hier kunnen worden toegepast op de studie van mitochondriale Ca2 + toestroom in dierlijke en cellulaire modellen van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen aan verslag.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de subsidiefinanciering uit de American Heart Association (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A.
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
