Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben

Zusammenfassung

Citrus Greening ist eine besonders destruktive Erkrankung Zitrusfrüchte Kulturen weltweit. Hier ist eine einfache Methode PCR und genomische DNA-Extraktion von Zitrusfrüchten Blattgewebe für die genaue und präzise Identifikation des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. verwenden

Zusammenfassung

Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, ist eine zerstörerische Zitrus Krankheit verwüsten Zitrusfrucht Betriebe weltweit. Diese Krankheit verursacht asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, Vene Vergilbung, entblätterung, Wurzel Verfall und letztlich der Tod der Zitrusfrüchte Pflanze. Wenn infiziert, die Zitruspflanzen haben Wachstumsstörungen und Blumen außerhalb der Saison zu produzieren. Diese Blumen bringen selten Obst, und diejenigen, die kleine, bitter, unregelmäßig geformte Zitrusfrüchte, die nachgeben sind nicht erwünscht. Diese Krankheit ist durch die asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, und durch die Pfropfung von infizierten Zitrusfrüchten Gewebe verteilt. Der Erreger hat eine lange und Variable Inkubationszeit innerhalb der Zitrusfrüchte Pflanze – manchmal Jahre, bevor Symptome auftreten. Versuche, dieses Erregers in Vitro Kultur unterlegen, möglicherweise aufgrund der geringen und unebenen Konzentration des Erregers innerhalb von Zitrusfrüchten Gewebe infiziert, oder weil es schwierig ist, die Umwelt zu replizieren Bedingungen förderlich für Wachstum der der Erreger. Es ist sehr schwierig, die Krankheit zu identifizieren, bevor es sich ausgebreitet hat, aufgrund seiner langen Inkubationszeit und Forscher Unfähigkeit zur Kultur des Erregers. Dadurch zeigt sich die Krankheit erst nach der Zerstörung plötzlich ein Zitrus Bauer gesamte Ausbeute. Hier ist eine Methode für die genaue und spezifische Erkennung des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. mit einem genomische DNA-Extraktion Kit und PCR. Diese Methode ist einfach, effizient, kostengünstig und flexibel für die Quantitative Analyse. Diese Methode kann für den Einsatz auf jedem Zitrus Gewebe angepasst werden; jedoch wird es möglicherweise durch die Menge der Erreger im Gewebe vorhanden begrenzt. Allerdings wird diese Methode zulassen, dass Zitrusfrüchte Landwirte infizierten Zitruspflanzen früher zu identifizieren und die Ausbreitung dieser zerstörerischen Krankheit einzudämmen, bevor sie weiter verbreiten kann.

Einleitung

Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, hat einen bedeutenden Verlust von Zitrusbäumen verursacht. Ein repräsentativer Fall ist Florida, wo die Krankheit voraussichtlich eine Ermäßigung von 70 % in der Produktion von Florida orange-Boxen von 244 Millionen Kisten in der Saison 1997-1998 70 Millionen Kisten ab 2016-2017 Staffel¹zufügen. Über 90 % der Zitrusbäume in Florida sind infizierte², und es wird geschätzt, dass der Zitrusindustrie Florida etwa 1 Milliarde Dollar pro Jahr wegen Zitrusfrüchten Krankheiten verliert wobei citrus Greening eine wichtige Rolle-^{3 spielt}. Citrus Greening wird in erster Linie durch die invasive asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, verbreitet aber auch durch Pfropfung des infizierten Gewebes. verteilt werden können Die Krankheit verursacht Gelbfärbung der Venen, asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, vorzeitige entblätterung, Zweig absterben, Wurzel Verfall und Tod der Pflanze. Wichtig ist, verursacht die Krankheit die Zitrusfrüchte Pflanze Blumen in der Nebensaison zu produzieren, die nur selten Früchte zu produzieren. Die Frucht, die durch infizierte Zitruspflanzen entsteht sind unreif, grün und bitter schmecken⁴.

Der Zweck dieser Methode ist es, genau und bewegliche Bakterium Verbindung Liberibacter spp., dem Erreger der citrus Greening, Leben in das Phloem von infizierten Zitrusbäume⁵genau zu bestimmen. Genomischer DNA entzogen ganze Blattgewebe, die Leben Bakterien enthält. Diese extrahierte genomische DNA dient als Vorlage für konventionelle PCR wo Oligonukleotide ergänzen das Bakterium 16 s rDNA Sequenz verwendet werden, um diese Sequenz zu verstärken. Oligonukleotide, die komplementär zu einem Zitrus FBOX gen dienen als eine interne Amplifikationskontrolle. Wir haben diese Methode verwenden, weil es nachweislich um in der bisherigen Forschung⁶erfolgreich zu sein.

Diese Methode hat den klaren Vorteil, einfach, kostengünstig und in der Lage, in jedem normal ausgestatteten Biochemie Labor durchgeführt werden. Darüber hinaus bleibt die PCR die genaue und präzise Methode zur Erkennung von dieser Erreger, wegen der Schwierigkeit der Kultivierung dieser Erreger-⁷und der Erreger Fähigkeit zu überleben und sich fortzupflanzen, seit Jahren im Rahmen einer asymptomatischen Host-⁸. Viele andere Spezialität-PCR-Assays wurden verwendet, um erfolgreich diese Erreger erkennen; konventionelle PCR bleibt jedoch der einfachste Test für präzise und spezifische Erkennung, vor allem innerhalb von asymptomatischen Gastgeber⁸.

Protokoll

(1) Isolierung genomischen DNA aus pflanzlichem Gewebe mit einem genomischen Extraction Kit

1. Erhalten Sie Zitrus Blattgewebe schneiden ein ganzer frischen Blatt von einem Zitrusfrüchte Baum mit einer sauberen Schere, und legen Sie das Blatt in einen sauberen Plastikbeutel.
   Hinweis: Die Tasche mit dem Blattgewebe sollte im Kühlschrank 4 ° C oder auf Eis in einem isolierten Behälter so bald wie möglich nach der Entnahme zu sparsam zu sein platziert werden.
2. Fügen Sie eine kleine Menge von flüssigem Stickstoff in einem Mörser und Stößel chill. Während sie entspannen, sind, mit einer Schere schneiden Sie ein kleines Stück Blattgewebe, ca. 1 Quadratzoll in der Größe. Platzieren Sie das geschnittene Gewebe im Mörser, sofort es einzufrieren. Mehr flüssigen Stickstoff, bei Bedarf hinzugefügt werden.
   Hinweis: Isolierte Handschuhe sollten immer getragen werden, beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.
3. Mahlen Sie schnell das Pflanzengewebe zu einem feinen Pulver mit dem Mörtel. Schleifen der flüssige Stickstoff vollständig verdampft, bis ein feines grünes Pulver bleibt weiter.
4. Kurz entspannen Sie eine Spachtel aus Metall in flüssigem Stickstoff für 10-15 s, dann schöpfen Sie das Boden-Gewebe im Inneren des Mörtels zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, mit dem Spatel.
5. Fügen Sie 600 µL Kerne Lyse Lösung (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 1000 µL pipette und Wirbel der Probe für 1-3 s, dann im Wasserbad 65 ° C für 15 min inkubieren.
6. Fügen Sie 3 µL RNase-Lösung hinzu, die lysate mit einer Pipette 10µL, Invertieren Sie die Röhre 2 - 5 Mal zu mischen, und bei 37 ° C in einem Schrank Inkubator für 15 min inkubieren.
   Hinweis: Lassen Sie die Mischung abkühlen auf Raumtemperatur bevor Sie fortfahren.
7. Fügen Sie 200 µL Niederschlag Proteinlösung, Vortex: bei Hochgeschwindigkeit, 20 s, dann Zentrifuge für 3 min bei 13.000 x g eine feste Kugel zu bilden. Während die Probe zentrifugiert wird, ist fügen Sie 600 µL Raumtemperatur Isopropanol einen frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch hinzu.
8. Mit einer 1000 µL Pipette, vorsichtig aus der zentrifugiert Probe, Übertragung auf den frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit Isopropanol überstand. Die Pellets kann nun verworfen werden.
   Hinweis: Vermeidung einer Kontamination des Überstands mit Protein durch eine winzige Menge überstand über die Pellets verlassen.
9. Invertieren Sie das Rohr, bis die DNA als eine Masse von fadenförmige Stränge sichtbar wird, dann Zentrifugieren bei 13.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur.
10. Dekantieren des Überstands, das Pellet 600 µL 70 % Ethanol hinzu, Invertieren Sie das Rohr mehrmals zu waschen die DNA, und 13.000 x g für 1 min zentrifugieren.
11. Vorsichtig Aspirieren das Ethanol, verlassen das lose DNA-Pellet dann öffnen und invertieren der Röhre, ruht auf saugfähigem Papier. An der Luft trocknen bei Raumtemperatur 15 Minuten.
12. Das getrocknete DNA-Pellet fügen Sie 100 µL DNA Rehydratationslösung hinzu, dann Brüten Sie die DNA im Wasserbad 65 ° C für 1 h, beim Mischen in regelmäßigen Abständen durch Tippen auf das Rohr.
13. Eine Küvette setzen Sie 1 µL gereinigtes Wasser auf, und legen Sie sie in einem Spektralphotometer als Leerzeichen verwendet werden. Berechnen Sie die Konzentration von DNA vorhanden, indem 1 µL Probe auf der Küvette und Einfügen in das Spektrophotometer. DNA-Konzentration (ng/µL) kann (ein₂₆₀- A₃₂₀) berechnete × Verdünnung Faktor × 50 ng/µL.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe kann bei 4 ° c gelagert werden

2. führen Sie PCR genomischer DNA-Proben

1. Kombinieren Sie 10 µL 2 (siehe Tabelle der Materialien), X PCR Master Mix 1 µL forward Primer (10 Uhr/µL), 1 µL reverse Primer (10 Uhr/µL) (siehe Tabelle 2 für Primer-Sequenzen), 100 ng von genomischer DNA aus der Probe extrahiert und gereinigtes Wasser (bis zu 20 µL Endvolumen) in ein 50 µL PCR-Röhrchen, Flick, mischen und kurz Zentrifuge.
2. Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler und entsprechend ausführen (siehe Tabelle 1).
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Gegebenenfalls speichern Sie Sample bei 4 ° C nachdem die Reaktion abgeschlossen ist.

3. die Amplifizierte DNA in ein Agarose-Gel electrophorese

1. Wiegen Sie 0,4 g Agarose Pulver und fügen Sie es zusammen mit 1 X TAE-Puffer auf eine saubere 200 mL Erlenmeyerkolben, Füllung bis zu 50 mL.
2. Mikrowelle auf hoch für 1,5 min schütteln alle 30 s, bis Agarose vollständig aufgelöst ist.
   Hinweis: Isolierte Handschuhe sollte getragen werden, beim Umgang mit flüssigen Agarose um Verbrennungen zu vermeiden.
3. Fügen Sie 2,5 µL 10 mg/mL Interkalation Bromid flüssige Agarose und schütteln zu mischen, dann Gießen Sie das flüssige Agarosegel in eine Ebene Gel-Form. Fügen Sie schnell standard 12-Zahn-Gel Kämme nach Gießen.
4. Lassen Sie das Gel für 20 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen, dann entfernen Gel Kämme, und legen Sie das Gel in eine Ebene Gel Box gefüllt mit 1 X TAE-Puffer.
5. Mit einer Mikropipette, laden Sie die insgesamt amplifizierten DNA-Proben in Brunnen. Fügen Sie 5 µL DNA ladder (siehe Tabelle der Materialien) in einem separaten gut aus Ihren Proben.
6. Electrophorese die Proben 35 min bei konstanter 90 V, dann das Gel zu entfernen und in einem UV-Transilluminator.
7. Fotografieren und analysieren das Gel Streifen Muster bei der Verwendung von UV-Durchleuchtung bei 302 nm.

Ergebnisse

Ein positives Ergebnis ergibt sich eine deutliche Band entspricht 500 bp für Verbindung Liberibacter Asiaticus Las606/Lss⁶, und/oder eine ausgeprägte Band entspricht 700 bp für Laa2/Laj5, Beilage in der 16 s ribosomalen β Operon⁹. Die interne Verstärkung kontrollbande muss auch immer am 400 bp. Diese Band Verstärkung der Zitrusfrüchte FBOX gen¹⁰entspricht, und müssen für ei...

Diskussion

Es ist wichtig, dass alle Schritte befolgt werden, genau um optimale Versuchsbedingungen zu erreichen. Ganze Blattgewebe diente während dieser Demonstration; das Protokoll kann theoretisch jede Art von Pflanzengewebe enthalten angepasst werden. Bisher haben Forscher Vene Blattgewebe, anstatt ganze Blattgewebe genomischen DNA entzogen und ähnliche Ergebnisse¹¹erreicht. Wenn die Band das citrus FBOX -gen entsprechend nicht angezeigt wird, das Ergebnis ist ungültig, und möglicherweise eine o...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Quelle für Zellkernlyse-, RNase-, Proteinfällungs- und DNA-Rehydrationslösungen
Flüssiger Stickstoff	Air Products	N/A
Mastercycler pro mit Bedienfeld	Eppendorf	6321000019
1250 W Mikrowelle	Panasonic	N/A
5424 Tischzentrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digitales Wasserbad	Fisher scientific	15-462-15Q
Metallspatel	Sigma-Aldrich	Z283274
Mörser und Stößel	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Steril 10 μ; L Spitzen	TipOne	1161-3730
Steril 200 μ L Spitzen	TipOne	1163-1730
Steril 1250 μ L-Spitzen	TipOne	1161-1750
Pipettierer-Kit mit variablem Volumen	VWR	75788-460
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Essigsäure	Fisher Chemical	A38-212
Tris-Basis	Sigma-Aldrich	10708976001
μ Küvette	Eppendorf	6138000018
Stapelbare Gießschale und Kämme	Carolina	213655
PowerPac Basic Netzteil	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospektrometer basic	Eppendorf	6135000009
0,2 mL PCR	Gefäße Fisher scientific	AB-0620
Mikrozentrifugenröhrchen	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Wasser, PCR-Qualität	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA-Leiter	Thermo Fisher Scientific	10787018