Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

Summary

Wir beschreiben eine Methode, um die Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, untersuchen und Moos Protonemata, zu verlängern, durch extrem schmale Lücken (~ 1 µm) in einem mikrofluidischen Gerät.

Abstract

In Vivo, Spitze wachsenden pflanzlichen Zellen müssen eine Reihe von physischen Barrieren zu überwinden; Allerdings fehlen Forscher die Methodik um zelluläre Verhalten in solchen restriktiven Bedingungen zu visualisieren. Um dieses Problem zu beheben, haben wir Klimakammern für Tipp-wachsende Pflanzenzellen, die eine Reihe von schmalen, Mikro-fabrizierten Lücken (~ 1 µm) enthalten in einem Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) Substrat entwickelt. Das transparente Material ermöglicht dem Benutzer, Tipp Dehnung Prozesse in einzelnen Zellen während der Mikrospalt Penetration durch Time-Lapse-Bildgebung zu überwachen. Mit Hilfe dieser experimentelle Plattform, beobachteten wir morphologische Veränderungen in pollenschläuche, wie sie der Mikrospalt eingedrungen. Die dynamischen Veränderungen in der Form eines eindringmittel beschrifteten vegetativen Kerns und Spermien in einem Pollen Rohr eingefangen wir während dieses Prozesses. Darüber hinaus haben wir die Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata, 1 µm Spalt durchdringen. Dieser in-vitro- Plattform verwendet werden, wie die einzelnen Zellen reagieren auf körperlich eingeschränkte Räume zu studieren und vielleicht geben Einblicke in Tipp-Wachstum-Mechanismen.

Introduction

Nachdem Pollenkörner auf ein Stigma Keimen, produziert jedes Korn ein Pollen Rohr, die Spermien in die Eizelle und die zentrale Zelle in das Ovulum für doppelte Befruchtung führt. Pollenschläuche verlängern durch den Stil und erreichen schließlich das Ovulum durch Sensierung mehrere Anleitungen Hinweise entlang ihrem Weg¹. Während die Dehnung auftreten pollenschläuche eine Reihe von physischen Barrieren; die übertragende Strecke ist mit Zellen gefüllt und pollenschläuche müssen die Minute micropylar Eröffnung das Ovulum, erreichen ihr Ziel (Abbildung 1A)²eingeben. Daher müssen die pollenschl....

Protocol

1. Herstellung von PDMS Mikroapparat, wachsen Pollenschläuche zu untersuchen und Moos Protonemata

Hinweis: Wir verwendet ein Instrument maskless Photolithographie PDMS Formen auf Silizium-Wafer vorzubereiten. Die Details zur Bedienung des Systems werden in dieser Handschrift ausgelassen. Ein standard Photolithographie Technik⁹ mit einer Fotomaske kann auch verwendet werden, um die PDMS Formen beschrieben in dieser Handschrift zu erstellen.

1. 11 g Pre-Polymer PDMS Mischung Gießen (Elastomer Basis: Härtemittel im Verhältnis 10:1) in jedem 4-Zoll-Form.
2. Entgasen Sie den Schimmel in Schritt 1.1 für 20 mi....

Results

Wie in Abbildung 1dargestellt, stoßen Spitze wachsenden Pflanzenzellen eine Reihe von physischen Barrieren entlang deren Wachstum Pfade in Vivo. Mikrofluidische in-vitro- Zelle Kultur Plattformen präsentiert in dieser Studie ermöglicht die Prüfung der Tipp-wachsender Prozess in drei Arten von Pflanzenzellen (pollenschläuche Wurzelhaare und Moos Protonemata) durch künstliche Lücken 1 µm (Abbildung 3,

Discussion

Mehrere wichtige Schritte im Protokoll müssen befolgt werden, um genau die oben dargestellten Ergebnisse zu erzielen. Erstens müssen die PDMS Schicht und Glas Schüssel Bodenflächen sowohl mit Plasma für eine ausreichende Menge an Zeit vor der Verklebung behandelt werden. Andernfalls kann die PDMS-Schicht lokal von der Glasoberfläche lösen, während Tipp erzeugenden Zellen die Mikropausen kreuzen. Ein weiterer entscheidender Schritt in der Wurzelhaare und Moos Protonemata-Protokoll ist die Sterilisation von der mikroappara.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Saccharose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm Glasbodenschale	Matsunami	Glasschale D210402
35 mm Glasbodenschale	Iwaki	3971-035
Chirurgische Klinge	Feder	Nr. 11
Biopsiestempel	Harris		Uni-Core
Gel Ladespitzen	Bio-Bik	124-R-204
Inverses Mikroskop	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		Für dieses kundenspezifische Mikroskop
ist keine Katalognummer verfügbarMetaMorph Bildgebungssoftware	Molecular Devices