Method Article

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

DOI:

10.3791/57322

⸱

May 6th, 2018

 , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem eine Kaskade von Ereignissen in Bildung eines ausgereiften anhaftende Bakteriengemeinschaft1,2,3gipfelt. Bakterien produzieren Adhesins um die frühe Bindung während der Verschiebung adhäsin gen expressionsprofile zur Stärkung der Anlage während der Reifung der Biofilm zu erleichtern. Gleichzeitig tritt die EPS-Produktion zu beschichten der Bakteriengemeinschaft in einer Matrix, die Zellen vor den ersten Stressor zu schützen. Der Biofilm enthaltene Bakterien sind langsam wachsend; und als solche die meisten Antibiotika unwirksam macht. Darüber hinaus spart das langsame Wachstum Energie, bis Bedingungen ändern, um bakterielles Wachstum1,2,3bevorzugen. Nach die harten Bedingungen bestanden haben, Bakterien den Biofilm zu zerstreuen und wieder planktonischen Lebensweise1,2,3. Traditionell, Biofilmen auf Oberflächen eingehalten werden und eine anhaltende klinische Herausforderung wegen Infektion Stauseen auf Katheter und in Wohnung Geräte1,2,3vorhanden.

Biofilmbildung wurde kürzlich für mehrere magensaftresistenten Krankheitserreger beschrieben; Bakterien, die den Dünndarm oder Dickdarm4infizieren. Shigella -Arten, tritt Infektion im menschlichen Dickdarm nach einer Durchreise durch die Mehrheit des Magen-Darm-Trakt. Während der Passage durch den Dünndarm ist Shigella Galle ausgesetzt; ein Lipid-abbauenden Waschmittel abgesondert in den Darm zur Verdauung von Lipiden während gleichzeitig töten die meisten Bakterien5zu erleichtern. Enterische Krankheitserregern haben die einzigartige Fähigkeit, die bakterizide Wirkung der Galle6widerstehen. Unsere jüngsten Analyse verwendet in-Vivo-wie Kombinationen aus Glukose und Gallensalze, robuste Biofilmbildung in S. Flexneri demonstrieren sowie anderen Arten von Shigellen, pathogene Escherichia coliund Salmonellen4. Zuvor, Salmonella Enterica Serovar Typhi gezeigt werden konnte, bilden einen Galle-induzierte Biofilm durch einzigartige Besiedlung der Gallenblase während der chronischen Infektion7,8,9, 10. Darüber hinaus vorherige Forschung mit Vibrio11und Campylobacter12 gezeigt Biofilmbildung auf Galle. Daher die Analysen erweitert die Galle-induzierte Biofilm Formation Beobachtungen auf andere Krankheitserreger und helfen, um Demonstration der konservierten magensaftresistenten Erreger Antwort auf Galle zu etablieren. Im Gegensatz zu chronischen Biofilme in der bakteriellen Gentranskription ist begrenzt und Zelle Seneszenz kann auftreten,1,2,3schlagen wir vor, dass der Magensaftresistente Galle-induzierte Biofilm in der Natur mehr vergänglich ist. Diese vorübergehende virulenten Biofilm ist geprägt durch eine schnelle Demontage (gesehen in der Dispersion-Assay) und verbesserte Virulenz Genexpression beobachtet in den Biofilm Bevölkerung4,6. 

Wie Biofilmbildung eine facettenreiche, dynamischer Prozess und die Verwendung von Gallensalzen wie ein auslösende Faktor für die meisten enterischen Krankheitserregern nur vor kurzem beschrieben ist, sind die Werkzeuge und Techniken, die einzigartige und kreative Anwendungen der traditionellen Methoden. So sind die hier vorgestellten drei kostenlose Strategien, mehrere wichtige Eigenschaften der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erwachsenden bakterielle, Produktion von EPS-Matrix und Dispersion von lebensfähigen Bakterien von den Biofilm zu quantifizieren. Diese Techniken wurden in erster Linie für die Forschung mit Shigellagenutzt; und Bewertung der anderen enterischen Krankheitserregern erfordern daher, Optimierung. Dennoch positive Daten aus allen drei Tests unterstützen Identifikation von Biofilmen und reproduzierbare Protokolle für die Galle Salz-induzierte Biofilmbildung einführen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Gallensalze Medium: um tryptic Soy Bouillon (TSB) mit 0,4 % Gallensalze (Gewicht/Volumen) vorzubereiten, Aufschwemmen 200 mg der Gallensalze in 50 mL autoklaviert TSB. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Wöchentlich machen Sie frisches Medium.
    Anmerkungen: Die Salze der Gallensäure routinemäßig verwendet, ist eine 1:1 Mischung aus Natrium Cholate und Natrium-Deoxycholate von Schafen und Rindern Gallenblase isoliert. Wie zuvor4gezeigt hat, war die Anwesenheit von Glukose für Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Vergleich zu Luria-Bertani (LB) Brühe hinzugefügt; und daher war ausreichend induzieren Biofilmbildung in Shigella und die anderen enterischen Krankheitserregern analysiert. Abhängig von den Bakterien analysiert werden könnten verschiedene Glukosekonzentration oder verschiedene Zucker Anforderungen erforderlich sein.
  2. 0,5 % w/V Kristallviolett im Wasser: 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren.
  3. Concanavalin A (ConA) konjugiert zu Fluorescein erfolgt (FITC): rekonstruieren die Aktie mit 1 X PBS-Puffer. Die 10 mg konzentriert-Aktie mit 400 μl 1 X PBS, eine Endkonzentration von 25 µg/mL zu verdünnen und vor Licht schützen.
  4. PBS + Glukose: 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (2 % w/V Glukose final) auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.
  5. PBS + Gallensalze: Auflösen 40 mg in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze final). Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.
  6. PBS + Glukose und Gallensalze: 40 mg Gallensalze und 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze und 2 % w/V Glukose final) aufzulösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.
  7. LB-Agar-Platten vorbereiten.
  8. Formaldehyd/Glutaraldehyd Fix: Hinzufügen 810 µL Formaldehyd (37 %-Stammlösung, 3 % Endkonzentration) und 125 µL Glutaraldehyd (25 % Stammlösung, 0,25 % Endkonzentration) 14 mL 1 X PBS. Gründlich mischen und Lagerung bei 4 ° C. Das Update sollte für den bestimmungsgemäßen Gebrauch kalt sein.
    Achtung: Das Update ist giftig und Sondermüll Beseitigung erfordert.
  9. Antifade Eindeckmedium Lösung: Verwenden Sie antifade Eindeckmedium Lösung mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck, um Immunofluoreszenz immunofluorescent Mikroskopie Proben zu hemmen, während eindringmittel Färbung der DNS des Bakteriums.

2. Vorbereitung von Bakterien

  1. Wachsen Sie über Nacht Kulturen der Bakterienstämme impfen 3 mL TSB mit einer einzigen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kultur Rohr getestet werden. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 225 u/min für die Inkubation über Nacht (16-24 h).
    Hinweis: Stämme sollten aus Gefrierschrank Beständen alle 2 bis 4 Wochen und gepflegt auf Platten nicht mehr als 2 Wochen alt restreaked werden.

3. Einhaltung der Festphasen-Assay

Hinweis: Dieser Assay quantifiziert anhaftende Bakterien mit einer 96-Well-Platte-Methode. Bakterien werden statisch in flachen Bodenplatten angebaut. Waschen wird durchgeführt, um nicht-anhaftende Bakterien entfernen und anhaftende Bakterien sind mit Kristallviolett gefärbt. KRISTALLVIOLETT Fleck Peptidoglycan in der bakteriellen Zellwand bindet und mit Ethanol solubilisiert werden kann. Die Zahl der anhaftenden Bakterien wird anhand von Kristallviolett Aufbewahrung bestimmt.

  1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + Gallensalze (BS).
  2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
  3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).
  4. Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp (TSB und TSB + BS) getestet werden.
  5. Fügen Sie 130 µL/Well des beimpften Kultur in drei Vertiefungen und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.
  6. Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.
  7. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.
  8. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Vakuum durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen des Mediums am unteren Rand des Brunnens. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bakterienpopulation befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Wenn während der Inkubationszeit EPS Matrix produziert wurde, wird die Matrix als einen weißen Niederschlag visualisiert werden. Stören Sie die EPS-Matrix nicht.
  9. Vorsichtig waschen der Brunnen einmal mit 200 µL steriler PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.
  10. Invertieren Sie die Platte zum Trocknen. Lassen Sie ein Minimum von 20 min trocknen.
    Hinweis: Da der Biofilm vor Verschmutzung gründlich getrocknet werden muss, kann das Protokoll angehalten bei diesem Schritt für ein paar Stunden oder sogar über Nacht sein. Die zusätzliche Trocknungszeit wird das Färbeverfahren nicht verändern, während unvollständige Trocknung Quantifizierung der Ergebnisse und der Reproduzierbarkeit auswirkt.
  11. Gut 150 µL 0,5 % Kristallviolett bis jeweils experimentell und Steuerung hinzufügen.
  12. 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
  13. Der Brunnen einmal mit 400 µL destilliertes Wasser zu waschen. Das zusätzliche Volumen hilft, um passives Kristallviolett Fleck von den Seiten der Brunnen zu entfernen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung.
  14. Die Brunnen fünfmal mit 200 µL destilliertes Wasser zu waschen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung.
    Hinweis: Gründliches Waschen ist wichtig für die Quantifizierung. Wenn die leere Brunnen aus destilliertem Wasser sind und keine verbleibenden Kristallviolett Fleck enthalten, fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt fort.
  15. Invertieren Sie die Platte trocken, vor Licht geschützt werden. Stellen Sie sicher, vollständige Trocknung der Platte wie oben erwähnt.
  16. Destain Brunnen mit 200 µL von 95 % Ethanol. Inkubieren Sie die Platte auf den Shaker für 30 min. Zur Vermeidung von Verdampfung, besonders bei höheren Temperaturen führen Sie diesen Schritt bei 4 ° C.
  17. Mit einem Teller Reader, Aufzeichnen der OD-540.
    Hinweis: Die Wellenlänge für maximale Absorption von Kristallviolett ist in der Nähe von 590 nm. Die Literatur berichtet eine Reihe von OD540 - OD5954,13,14,15,16 für Kristallviolett Absorption; So wählen Sie eine Wellenlänge zur Verfügung basierend auf der Platte-Leser.

4. EPS-Matrix-Erkennung

Hinweis: Diese kostenlose Proben zu quantifizieren und visualisieren die EPS. In beiden Fällen EPS-Erkennung erfolgt anhand einer Lektin Polysaccharide zu binden. Das eindringmittel konjugiert Protein ermöglicht die Quantifizierung (Schritt 4.1) oder Visualisierung (Schritt 4.2).

  1. Semi-quantitativen Nachweis von EPS
    1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.
    2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
    3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (eine 01:50 Verdünnung).
    4. Fügen Sie in eine sterile, schwarz, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden. Die Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.
    5. Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.
    6. Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine klare 96-Well-Platte mit einer Pipette, idealerweise ein Mehrkanal-Pipette. Seien Sie vorsichtig, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung und/oder der EPS befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Beiseite stellen.
    7. Die schwarze Platte für 15 min bei RT mit 200 µL/Well von Formaldehyd/Glutaraldehyd in 1 X PBS zu beheben.
    8. Während die anhaftende Bevölkerung Befestigung ist, bewerten Sie die überstehende Fraktion aus Schritt 4.1.6. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment.
      1. Alternativ kann der gesamte Test in eine schwarze klar Bodenplatte erfolgen. Unter diesen Umständen die OD600 Werte aufgezeichnet werden können und das Kulturmedium können anschließend vor 4.1.7 Schritt verworfen werden. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normieren im Fall gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.
    9. Entfernen Sie das Update und in den Sondermüll zu entsorgen.
    10. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die PBS waschen mit der Vakuumleitung durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen der Wäsche am unteren Rand des Brunnens.
    11. 150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren
    12. Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL PBS.
    13. Fügen Sie 150 µL PBS in jede Vertiefung. Aufzeichnen die Fluoreszenz bei 488 nm.
  2. Konfokale Mikroskopie Visualisierung von EPS-Produktion und Berechnung der Biofilm Dicke
    1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.
    2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
    3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).
    4. Richten Sie eine sterile 24-Well-Platte mit 12 mm Runde Glasdeckgläser steril. Drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen fügen Sie 400 µL/Well nicht inokulierten Kontrolle Medien hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.
    5. Brunnen in zweifacher Ausfertigung 400 µL der beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen überzogen sind.
    6. Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.
    7. Bestätigen Sie visuell Wachstum in der TSB Zustand, Wachstum und EPS Niederschlag in der TSB (weiß) + BS Zustand und kein Wachstum und/oder weißen Niederschlag in sterilen Kontroll-Vertiefungen. Entfernen Sie die Überstände.
    8. Fix für 15 min bei RT mit 200 µL/Well Formaldehyd/Glutaraldehyd Lösung mit 1 X PBS-Puffer.
    9. Entfernen Sie das Update und Sondermüll zu entsorgen.
    10. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.
    11. 150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren
    12. Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL/Well von PBS.
    13. Mit antifade Eindeckmedium Lösung mit DAPI montieren.
      Hinweis: Die Lösung ist eine fertige, Glycerin-basierte Montage-Lösung mit DAPI für Erhaltung der fluoreszierenden Labels während gleichzeitig Färbung der DNS in bakterielle Zellen für die Visualisierung als eine gegenfärbung. Folgen Sie des Kits Wegbeschreibungen und Empfehlungen für Inkubationszeiten vor imaging Proben. Das DAPI Färbeverfahren kann durchgeführt werden, vor der Anwendung antifade Eindeckmedium Lösung, die keine DAPI enthält.
    14. Bewerten von konfokalen Mikroskopie. Auf einem confocal Mikroskop legen des Lasers auf 495 nm/519 nm Anregung/Emission für FITC Visualisierung. Legen Sie einen zweiten Laser auf 360 nm/460 nm Anregung/Emission DAPI zu visualisieren. Suchen Sie den Biofilm durch die Konzentration auf das DAPI-Kanal. Das DAPI und FITC Kanäle verwenden, um die volle Dicke bestimmen und legen Sie die obere und untere Grenzen imaging. Volle Dicke Z-Stapel Bilder aufnehmen von Aufnahmen jeder 0,25 µm nach dem Festlegen der Umfänge auf der Ober- und Unterseite des Stapels Z. Finden Sie für weitere Informationen über konfokalen Mikroskopie in Publikationen von Paddock Et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Die 3D-Bilder in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) zu visualisieren die volle Biofilmbildung und berechnen Sie die Dicke der Biofilm zu rekonstruieren. Die durchschnittliche Dicke erhielt für S. Flexneri Galle-Salz induzierte Biofilme war 14 µm4.

(5) Dispersion Assay

Hinweis: In diesem Test wird die Demontage der Biofilm durch bakterielle Streuung erkannt. Hier Reife Biofilme werden festgelegt und anschließend (in der Regel am nächsten Tag), die Medien werden durch PBS ersetzt oder ergänzt PBS. Überstand Komponente wird dann bewertet, um die Anzahl der Bakterien quantitate, die von den Biofilm getrennt haben.

  1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.
  2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
  3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).
  4. Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.
  5. Drei Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.
  6. Statisch inkubieren Sie Platte-für 4-24 h bei 37 ° C.
  7. Bevor Sie fortfahren, zu wärmen, PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose auf 37 ° c Diese Reagenzien täglich frisch zubereiten.
  8. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Medium ohne Anzeichen von Trübung klar. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.
  9. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Vakuumleitung. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung befindet sich auf der Kunststoffoberfläche.
  10. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.
  11. Ersetzen Sie die Wäsche mit 130 µL/Well des folgenden in drei Brunnen: PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose. Diese Reagenzien müssen auf 37 ° c vorgewärmt werden.
  12. Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° c
  13. Entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Inkubator 37 ° C. Übertragen Sie die Überstände auf eine frische, sterile 96-Well-Platte.
  14. Mit einer 96-Well Platte oder Verdünnung Block 10-fach vorbereiten (01:10) serielle Verdünnungen des Überstands in sterilen PBS.
    Hinweis: Die Verdünnungsreihe sollte von unverdünnt bis 10-6 je nach Bakterienstamm zu prüfenden Bereich. Pilotprojekten können durchgeführt werden, um den optimalen Verdünnung zu ermitteln.
  15. Platte 5 µL jeder Verdünnung auf LB-Agar mit einer Mehrkanal-Pipette zu erkennen. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Zählen Sie Kolonien auf den nächsten Tag und Konto für den Verdünnungsfaktor, bei der Festlegung der Wiederherstellung koloniebildenden Einheiten (KBE). Um die prozentuale Dispersion im Vergleich zu den 1 x PBS Steuerelementsatz (100 %) zu berechnen, teilen Sie die Wiederaufnahme KBE aus jeder Behandlung Zustand durch die Erholung KBE von 1 X PBS Kontrollprobe.
    Hinweis: Routine Medien Platten für die bakterielle Belastung von Interesse können auch verwendet werden. Beispielsweise können Shigella auf Kongo-rot Platten beschichtet werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten trocken für geeignete Stelle-Plating-Techniken sind.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Abbildung 1wird in den meisten der sechs magensaftresistenten Krankheitserreger getestet nach dem Wachstum in Medien, die Salze der Gallensäure Biofilmbildung induziert. Eine deutliche Zunahme der anhaftenden Bakterien nach Gallensalze Exposition in fast allen Stämmen beobachtet wird getestet. Die Ausnahme ist Enteroaggregative E. Coli (EAEC); beachten Sie jedoch die induzierte Beobachtung der Δaaf mutierten4

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Experimente...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Angaben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptische SojabrüheSigma-Aldrich22092-500G
KristallviolettSigmaC6158-50
Concanavalin-A FITCSigmaC7642-10mg
GlukoseSigmaG7021-1KG
GallensalzeSigmaB8756-100G
LB AgarSigmaL7533-1KG
14 mL Kulturröhrchen, 17 x 100 mm, Kunststoff, sterilFisher14-959-11B
Vectashield hartes Antifading mit DAPIVector LaboratoriesH-1500
FormaldehydSigma-AldrichF1635-500
GluteraldehydSigma-AldrichG6257
96-Well-Platten mit flachem Boden (klar)TPP92696
96-Well-Platten mit flachem Boden (schwarz)Greiner Bio-One655076
24-Well-Platten mit flachem Boden (klar)TPP92424
Glasdeckgläser 12mm, rundFisher08-774-383
96-Well-PlattenleserSpectramax
Fluoreszierender PlattenleserBiotek Synergy 2
Konfokal oder fluoreszierend MikroskopNikon A1 konfokales Mikroskop
37°; C Schüttel-BrutkastenNew Brunswick Scientific Excella E25
37° C-Platten-InkubatorThermolyne Serie 5000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063(2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202(2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132(2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745(2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151(2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178(2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

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