Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.
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Methodenartikel
Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.
Einleitung
Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem ei....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Gallensalze Medium: um tryptic Soy Bouillon (TSB) mit 0,4 % Gallensalze (Gewicht/Volumen) vorzubereiten, Aufschwemmen 200 mg der Gallensalze in 50 mL autoklaviert TSB. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Wöchentlich machen Sie frisches Medium.
Anmerkungen: Die Salze der Gallensäure routinemäßig verwendet, ist eine 1:1 Mischung aus Natrium Cholate und Natrium-Deoxycholate von Schafen und Rindern Gallenblase isoliert. Wie zuvor4gezeigt hat, war die Anwesenheit von Glukose für Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Vergleich zu Luria-Bertani (LB) Brühe hinzuge....
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Ergebnisse
In Abbildung 1wird in den meisten der sechs magensaftresistenten Krankheitserreger getestet nach dem Wachstum in Medien, die Salze der Gallensäure Biofilmbildung induziert. Eine deutliche Zunahme der anhaftenden Bakterien nach Gallensalze Exposition in fast allen Stämmen beobachtet wird getestet. Die Ausnahme ist Enteroaggregative E. Coli (EAEC); beachten Sie jedoch die induzierte Beobachtung der Δaaf mutierten4
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Diskussion
Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Experimente.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Tryptische Sojabrühe | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Kristallviolett | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glukose | Sigma | G7021-1KG | |
| Gallensalze | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL Kulturröhrchen, 17 x 100 mm, Kunststoff, steril | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hartes Antifading mit DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyd | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyd | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| 96-Well-Platten mit flachem Boden (klar) | TPP | 92696 | |
| 96-Well-Platten mit flachem Boden (schwarz) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| 24-Well-Platten mit flachem Boden (klar) | TPP | 92424 | |
| Glasdeckgläser 12mm, rund | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-Well-Plattenleser | Spectramax | ||
| Fluoreszierender Plattenleser | Biotek Synergy 2 | ||
| Konfokal oder fluoreszierend Mikroskop | Nikon A1 konfokales Mikroskop | ||
| 37°; C Schüttel-Brutkasten | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37° C-Platten-Inkubator | Thermolyne Serie 5000 |
Referenzen
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
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Nachdrucke und Genehmigungen
