Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Zusammenfassung

Exposition gegenüber bestimmten Umweltchemikalien in Mensch und Tier wurde gefunden, um zelluläre Schäden der Bauchspeicheldrüse β-Zellen verursachen, die zu die Entwicklung von Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) führt. Obwohl die Mechanismen für die chemisch induzierte β Zellschädigung unklar und wahrscheinlich zu komplex waren, ist eine immer wiederkehrende Erkenntnis, dass diese Chemikalien verursachen oxidativen Stress führt zu der Generation von übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) die Schäden zu verursachen die β-Zelle. Ermittlung potenzieller diabetogene Umweltchemikalien, isoliert wir pankreatische Inselzellen von C57BL/6 Mäusen und kultivierten Inselzellen in 96-Well Zellplatten Kultur; dann wurden die Inselzellen mit Chemikalien dosiert und die ROS-Generation wurde von 2', 7'-dichlorofluoresceins (RLKV-DA) Fluoreszenzfarbstoff erkannt. Mit dieser Methode wir gefunden, dass Bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) und polychlorierten Biphenylen (PCB), können hohe Konzentrationen von ROS, was darauf hindeutet, dass sie potenziell Schaden in Inselzellen induzieren können induzieren. Diese Methode sollte für das screening von diabetogene XENOBIOTIKA nützlich sein. Darüber hinaus können die kultivierten Inselzellen auch für in-vitro- Analyse der chemisch induzierten Toxizität in Zellen der Bauchspeicheldrüse angepasst werden.

Einleitung

Anstieg der Prävalenz von T2DM geworden in den letzten Jahren stellt eine ernsthafte Bedrohung für öffentliche Gesundheit¹einer weltweiten Gesundheitskrise. Viele Faktoren gefunden worden zur Entwicklung des T2DM, darunter kausal verknüpft werden wiederkehrende Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine konvergente Gemeinsamkeit dieser Faktoren ist die Induktion von oxidativem Stress führt zu der Generation von übermäßigen ROS^{2 , 3}.

Ein breites Spektrum von Umweltchemikalien wie PCB, Dioxine und BaP hat sich herausgestellt, induzieren oxidativen Stress beeinträchtigen die Funktion der Bauchspeicheldrüse β-Zellen und zu Insulin-Resistenz und T2DM⁴führen kann. Obwohl der physiologische Ebene von ROS in zellulären Funktionen eine wichtige Rolle spielt, ROS, die die Kapazität des antioxidativen Systems übersteigt führt zu Schäden an Zellen/Gewebe und führt zu Krankheiten⁵. Pankreatische β-Zellen express ein niedriges Niveau der antioxidativen Enzym, und somit ist eine sensible Zielgruppe für den oxidativen Stress-vermittelten Schäden^6,7. Chronische Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von ROS wurde gezeigt, dass Stress-induzierte Pankreas Zelle Dysfunktion⁵ verursachen sowie Insulinresistenz in der Leber und Fettgewebe⁸.

Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, eine zellbasierte Assays Bildschirm Chemikalien für ihre diabetogene Potenziale basierend auf ihre Induktion von ROS in Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln. Die Bauchspeicheldrüse fehlt metabolische Entgiftung und ist ein sensibler Ziel für Fremdstoff-induzierten Schäden^6,7. Daher soll dieser Assay durch direkte Messung der ROS erzeugt in den Zellen der Bauchspeicheldrüsen, eine direkte Annäherung an die chemisch induzierte Schädigung der Bauchspeicheldrüse. Um diese Methode zu entwickeln, wir Maus Pankreas Inseln isoliert, kultiviert die isolierte Insel unter Zelle Kultur Bedingung mit Chemikalien und genutzt, die chemisch induzierte ROS-Generation als das Auslesen. Dieses Verfahren ist einfach und effektiv bei der Identifizierung von ROS-induzierende Chemikalien in der isolierten Insel; Es kann für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität weiterentwickelt werden, die speziell für die Bauchspeicheldrüse in Vitro.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden hingerichtet, unter Beachtung aller relevanten Richtlinien, Verordnungen und Aufsichtsbehörden. Das Protokoll wird gezeigt wurde unter der Leitung und Genehmigung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Texas A & M Institut für Genomic Medizin durchgeführt.

1. Vorbereitung der Lösung

1. 10 X Hank ausgeglichene Salzlösung, 1 X mit doppelt destilliertem H₂O verdünnen und Lagerung bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie die Isolierungslösung indem HEPES (10 mM), MgCl₂ (1 mM) und Glukose (5 mM). Einstellen Sie den pH-Wert 7,4 und halten Sie auf dem Eis.
3. Bereiten Sie die Kollagenase-Lösung von Kollagenase Typ 4.
   Hinweis: Insbesondere enthält Kollagenase Typ 4 160 U pro mg Trockengewicht. 1 g Kollagenase Typ 4 wird in 5 mL doppelt destilliertem H₂O mit einer Konzentration von 200 mg/mL verdünnt. 2 mL der verdünnten Kollagenase ist 30 mL Eis kalt isoliert Projektmappe hinzugefügt, und 6 mL Kollagenase-Lösung wird in ein 50 mL-Tube für jede Maus übertragen.
4. Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 1 mM CaCl₂ zur Isolierungslösung.
5. Bereiten Sie die Reinigung Lösung mit kalten Polysucrose/Natrium-Diatrizoate-Lösung (1,1119 g/mL, 5 mL).
6. Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Inselchen durch Zugabe von L-Glutamin (20 mM), Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und fetalen bovine Serum (FBS) (10 %) in RPMI Medium vor.
7. Vorbereiten der RLKV-DA-Stammlösung durch Auflösen des Pulvers in destilliertem Wasser bei 200 µM und Store bei-20 ° C.
   Hinweis: Die Färbelösung ROS wird durch Verdünnung RLKV-DA-Stammlösung auf die Endkonzentration von 5 µM in RPMI frisch zubereitet. Dieses Reagenz sollten vor Licht geschützt werden.

2. chirurgische Vorbereitung

1. Intraperitoneale Injektion (i.p.) eine Maus mit avertin (2,5 % avertin, 0,4 mL/20 g). Nach die Maus völlig betäubt ist und nicht mehr reagiert zum hinteren Fuß drückt, einschläfern die Maus und die biologische Motorhaube.
2. Platzieren Sie die euthanasierten Maus mit dem Bauch nach oben und sprühen Sie die Haut mit 70 % igem Ethanol für die Sterilisation.
3. Öffnen der Bauchhöhle mit einem 1 cm U-Schnitt auf den Oberbauch aus- und Einfahren der Haut in Richtung rostral über der Brust, die Bauchhöhle verfügbar zu machen.

3. die Bauchspeicheldrüse Perfusion und Entfernung

1. Wie in Abbildung 1dargestellt, finden Sie den Standort der Ampulle. Verwenden Sie ein paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie den Zwölffingerdarm nahe der Position des Sphincter Oddi. Verwenden Sie ein weiteres Paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie die Zwölffingerdarm Wand um den Weg der Galle in den Zwölffingerdarm zu blockieren.
   Hinweis: Der Ampulle wurde nicht in diesem Schritt eingefügt. Dieser Schritt soll die Galle Weg in den Zwölffingerdarm blockieren.
2. Positionieren Sie die Maus mit dem Kopf proximalen und distalen in Bezug auf die Forscher die Füße.
3. Finden Sie den hauptgallengang und injizieren Sie langsam 3 mL Kollagenase-Lösung mit einer 30 G Nadel und 5 mL Spritze. Sicherstellen Sie, dass der Gallengang und Bauchspeicheldrüse nach der Injektion aufgeblasen werden.
4. Entfernen Sie die aufgeblähten Bauchspeicheldrüse mit den gebogenen Pinzette und feine Schere, um es von den absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz zu trennen. Die Bauchspeicheldrüse in einen 50-mL-Röhrchen mit 3 mL Kollagenase-Lösung und lassen Sie ihn auf Eis.

4. Bauchspeicheldrüse Verdauung

1. Legen Sie je 50-mL-Tube in einem 37 ° C-Wasserbad. 15-20 min inkubieren (Zeit variiert je nach Sorte und Alter der Mäuse).
2. Schwingen Sie das Rohr mit einem Wirbel.
3. Pool 4-5 verdaute Bauchspeicheldrüse in ein großes sterile Waschbecken Sieb und eine Kugel verwenden, um die Bauchspeicheldrüse gründlich auseinander zu fallen. Verwenden Sie eine 23 G Nadel und 10 mL Spritze mit Waschlösung, um mit Nachdruck die verdauten Zellen außerhalb des Bildschirms pipette. Sammeln Sie die Waschlösung in einen 50-mL-Tube.
4. Zentrifugieren Sie die Rohre mit 97 X g bei 4 ° C für 1 min und Dekantieren Sie des Überstandes.
5. Rohre fügen Sie 25 mL Waschlösung hinzu und erneut aussetzen Sie des Gewebes durch sanfte aufschütteln. Spin-down der Gewebe bei 97 X g bei 4 ° C für 1 min und den überstand abgießen. Für 3 Mal wiederholen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht das gebeizte Gewebe verdrängen.

5. Reinigung der kleinen Inseln

1. Das gewaschene Gewebe Pellet 10 mL Reinigung Lösung hinzu und Aufschwemmen Sie sanft des Inhalts.
2. Überlagern Sie sanft 5 mL Lösung zur Isolierung auf die Reinigung Lösung. Achten Sie darauf, um eine scharfe flüssigen Schnittstelle zwischen den beiden Lösungen zu halten.
3. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 560 x g bei 4 ° C für 15 min mit der langsamen Beschleunigung und keine Bremse. Legen Sie die Pipette in die Schnittstelle und sammeln Sie die Inselchen Schicht in neuen 50 mL Röhrchen.
4. Waschen Sie die kleinen Inseln, wie unter Punkt 3.5 beschrieben.

(6) Beschichtung und Behandlung von Inselzellen

1. Die kleinen Inseln in 10 mL Inselchen Kulturlösung Aufschwemmen, sanft gut mischen und 100 µL/Well mit einer Mehrkanal-Pipette auf eine 96-Well-Platte zu platzieren. Platzieren Sie ca. 5 Inseln pro 96 gut.
2. Legen Sie die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für 12 h.
3. Zentrifugieren Sie (112 X g) 96-Well-Platte und entfernen Sie das Kulturmedium zu.
4. Verdünnen Sie die Umweltchemikalien in das Kulturmedium Inselchen. 100 µL der einzelnen chemischen Verdünnungsmitteln in separaten Vertiefungen der Platte hinzufügen. Aufschwemmen der Inseln in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 12 h bei 37 ° C (die Konzentration variiert für verschiedenen Umweltchemikalien).

(7) ROS Färbung und Messung

1. Nachbehandlung der Inselchen mit 1 X PBS waschen (200 µL für jede 96-Well).
   Hinweis: Die Konzentration der Chemikalien ist wie folgt: AFB1: 3 µM, Atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-Östrogen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol und BPA: 100 µM.
2. Verwenden Sie N-Acetyl-Cystein (NAC) als Antioxidans ROS zu stillen. Die ROS-induzierten chemischen Verdünnungsmittel 5 mM der NAK hinzu und 12 h bei 37 ° c inkubieren
3. Die 96-Well-Platte bei 112 X g zentrifugieren und mit 5 µM-Lösung von fluoreszierenden Sonde (H2-RLKV-DA aufgelöst in RPMI Medien) bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
4. Die behandelten Inselzellen 3 Mal mit PBS waschen und Messung die Fluoreszenz mit Dozent Mikrotestplatte an 488 nm.
   Hinweis: Die Anhäufung von DCF in Zellen kann gemessen werden, durch eine Erhöhung der Fluoreszenz bei 530 nm, wenn die Probe bei 488 angeregt wird nm.
5. Führen Sie die Glukose stimuliert Insulin-Sekretion (GSIS) Assay⁹ auf ROS-induzierende Harnblase behandelt Inselchen und unbehandelten Inselchen, die insbesondere Auswirkungen auf die physiologische Funktion der Bauchspeicheldrüsen Inselchen zu messen.

Ergebnisse

Ein Schliffbild der gesunden isolierten Insel ist in Abbildung 2gezeigt, in dem kleinen Inseln eine Runde oder ovale Form mit relativ einheitliche Größe haben (obwohl Größe Einheitlichkeit von Stamm zu Stamm unterschiedlich sein kann). Wir als Nächstes untersucht pancreatic Islet-Funktionen in einer in-vitro- Assay durch das Inselchen zu isolieren und Stimulierung der Insulinsekretion in den Kultur-Inseln. Abbildung 3 ze...

Diskussion

Sammeln Beweise deutet darauf hin, dass die Exposition zu Umweltchemikalien spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des T2DM. XENOBIOTIKA-induzierte ROS wurde als ein möglicher ätiologischer Faktor zur Entwicklung des T2DM anerkannt. Menschen ein breites Spektrum von XENOBIOTIKA Chemikalien ausgesetzt sind, und es gibt ein großer Bedarf an neuartigen Forschungstechniken, effektiv die Bauchspeicheldrüse Giftstoffe zu identifizieren und zu untersuchen, den Mechanismus der Toxizität für die Zellen der Bauchspeicheldr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mal; Hank' s ausgewogene Salzlösung	GIBCO	14185-052
Kollagenase Typ 4	Worthington Biochemical Corporation	CLS-4
Polysaccharose/Natriumdiatrizoat-Lösung	Sigma	10771
2',7'-Dichlorfluorescein (DCFH-DA)	Sigma	D6883-50MG
Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader	Biotek
L-Glutamin	Sigma	G8540-25G
Streptomycin	GIBCO	15140148
FBS	GIBCO	26140079
RPMI 1640	GIBCO	11875-085
Avertin	Sigma	T48402-25G
Ratte/Maus Insulin ELISA Kit	Millipore	EZRMI-13K
Zentrifuge	Sorval	Sorval RT7	für 96-Well-Plattenzentrifuge
Mikrotiterplatten-Reader	Biotek	Epoch 2	für die Fluoreszenzmessung