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Methodenartikel

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

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DOI:

10.3791/57346

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12. September 2018

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1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

Zusammenfassung

Verständnis-Blut - Hirn-Schranke-Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, die halten das Versprechen Gehirn Drug-Delivery, Gehirn-Schutz zu verbessern, und Gehirn zu behandeln Störungen. Studium der menschlichen Blut - Hirn-Schranke-Funktion ist jedoch schwierig. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für geeignete Modelle. In diesem Zusammenhang vertreten Gehirn Kapillaren isoliert aus menschlichen Hirngewebe ein einzigartiges Werkzeug, Barriere-Funktion als in der Nähe der menschlichen in-Vivo -Situation wie möglich zu studieren. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu eine hohe Ausbeute und mit gleichbleibender Qualität und Reinheit zu isolieren. Kapillaren sind aus frischen menschlichen Gehirngewebe mit mechanischer Homogenisierung, Dichtegradienten Zentrifugation und Filtrierung isoliert. Nach der Isolierung können die menschliche Gehirn-Kapillaren für verschiedene Anwendungen einschließlich Leckage-Assays, live Cell Imaging und Immune basierende Assays verwendet werden, Protein-Expression und Funktion, Enzym-Aktivität oder intrazellulären Signalisierung zu studieren. Isolierte Gehirn-Kapillaren sind ein einzigartiges Modell die Verordnung der menschlichen Blut - Hirn-Schranke Funktion aufzuklären. Dieses Modell bieten Einblicke in die Pathogenese der zentralen Nervensystems (ZNS), die die Entwicklung von Therapiestrategien zur Behandlung von CNS Störungen helfen.

Einleitung

Die Blut - Hirn-Schranke ist eine streng kontrollierte Schnittstelle zwischen Blut und Gehirn, der bestimmt, was geht in und aus dem Gehirn heraus kommt. Anatomisch, Endothelzellen der Blut - Hirn-Schranke zu komponieren und bildet eine komplexe, durchgehende kapillarnetzes. Physiologisch, versorgt dieses engmaschiges Netz das Gehirn mit Sauerstoff und Nährstoffen während gleichzeitig Entsorgung von Kohlendioxid und Abfallprodukte des Stoffwechsels. Wichtig ist, unterstützt Beweise, dass die Änderungen an der Schranke zu zahlreichen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Epilepsie und Schlaganfall1,2,3,4,5 beitragen , 6 , 7. Gehirn endotheliale Zellen auch als ein Hindernis für die Behandlung dienen durch die Blockierung der Droge Aufnahme ins Gehirn, zB., Chemotherapie von Glioblastoma Multiforme nach Tumor Resektion8,9, 10. In diesem Zusammenhang isolierte Gehirn-Kapillaren stellen eine einzigartige ex Vivo Blut - Hirn-Schranke Modell, das Barriere Eigenschaften in-vivo, ähnelt die für das Studium der Barriere-Funktion und Dysfunktion im Gesundheitswesen ermöglicht und Krankheit. In diesem Artikel bieten wir ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren vom menschlichen Gehirn auf eine gleichbleibend hohe Qualität der Kapillare zu isolieren und Ertrag um die Blut - Hirn-Schranke zu studieren.

Im Jahr 1969 Siakotos Et Al. 11 waren die ersten, die Isolation der Gehirn-Kapillaren aus Rind- und menschlichen Hirngewebe mit Steigung Zentrifugierung und Glas Bead Spalte dichtetrennung zu melden. Später, Goldstein Et al. 12 verbessert diese Methode, indem mehrere filtrationsschritte verringern die Menge des Gewebes erforderlich, Gehirn-Kapillaren von Ratten, unter Beibehaltung der Stoffwechselaktivität der Glukose Transport isoliert zu studieren. Seitdem optimiert Forscher die Kapillare Isolierung Verfahren mehrfach, Verbesserung der Methode und des Gehirns Kapillaren Modells mit jeder Iteration13,14,15. Z. B. Pardridge Et Al. 16 bovine Kapillaren mit enzymatischen Verdauung anstelle mechanischer Homogenisierung isoliert, und dann anschließend eine Kapillare Suspension durch ein Filtersieb 210 µm und eine Glassäule Wulst. Diese Änderungen verbessert den Trypan blau Ausgrenzung Fleck isolierte Gehirn-Kapillaren und so erhöhte endotheliale Zellviabilität. Anfang der 1990er Jahre Dallaire Et Al. 17 isoliert Rindern und Ratte Kapillaren, die waren frei von neuronalen Kontamination und metabolische Aktivität der γ-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTase) und alkalische Phosphatase gepflegt. Im Jahr 2000 Miller Et Al. 18, verwendet isolierten Ratten und Schweinen Gehirn Kapillaren in Kombination mit konfokalen Mikroskopie um zu zeigen, die Anhäufung von Transport-Substrate in das Lumen der Kapillaren. Anschließend haben unser Labor hat weiterhin das Gehirn Kapillare Isolierung Verfahren zu optimieren und wir Transport Tests ermitteln, P-Glykoprotein (P-Gp)19,20,21, Brustkrebs Widerstand Protein (BCRP)22,23und Multi-Drug Resistance Protein 2 (Mrp2)24 Transportaktivität. Im Jahr 2004 veröffentlichten wir zwei Berichte wo wir isolierte Ratte Gehirn Kapillaren verwendet, um verschiedene Signalwege zu untersuchen. In Hartz Et Al. 21, fanden wir, dass das Peptid Endothelin-1 schnell und reversibel P-Gp Transportfunktion im Gehirn Kapillaren durch Einwirkung durch Endothelin-Rezeptor B (ETB) Rezeptor, Stickoxid-Synthase (NOS) und Proteinkinase C (PKC) reduziert. In Bauer Et al. 19, haben wir bewiesen, Ausdruck des nuklearen Rezeptoren Pregnane X-Rezeptors (PXR) und zeigte PXR-Modulation des P-Gp Ausdruck und Transport-Funktion im Gehirn-Kapillaren. In Experimenten mit transgenen Mäusen, humanisierter PXR wir diese Linie der Forschung erweitert und zeigte in Vivo Verschärfung der Barriere von heraufregulierende P-Gp durch hPXR Aktivierung25. Im Jahr 2010 Hartz Et Al. 26 verwendet diesen Ansatz zur Wiederherstellung von P-Gp-Protein-Expression und Aktivität in transgenen menschlichen Amyloid-Precursor-Protein (hAPP)-Mäuse, die hAPP overexpress zu transportieren. Darüber hinaus reduziert Wiederherstellung des P-Gp in hAPP Mäuse Beta-Amyloid (Aβ)40und Aβ-42-Gehirn-Spiegel.

Neben dem Studium Signalwege, lässt die isolierte Gehirn-Kapillaren Veränderungen in Kapillare Permeabilität bestimmen, welche wir als Kapillare durchsickern bezeichnen. Insbesondere dient der Texas Red-Leckage-Test zur Bewertung Austreten von der Fluoreszenzfarbstoff Texas Red aus der Kapillare Lumen über Zeit und diese Daten werden verwendet, um die Leckraten zu analysieren. Verstärkte Kapillare Leckraten im Vergleich zu denen von Kontrolle Kapillaren anzugeben Änderungen in die körperliche Integrität der Blut - Hirn-Schranke2. Dies ist wertvoll, denn es zahlreiche Krankheitszustände Barriere Störung, z.B.zugeordnet gibt., Epilepsie, Multiple Sklerose, Alzheimer-Krankheit und Schädel-Hirn Verletzungen27,28,29, 30. Andere Gruppen haben auch isolierte Kapillaren um Signalwege zu erkennen, die Protein-Expression und Transportaktivität Proteine31,32,33,34regulieren genutzt, 35,36,37. Schließlich haben wir diese Methode für die Isolierung der Kapillaren des menschlichen Gehirns zu optimieren und, vor kurzem, wir zeigten erhöhte P-Gp Ausdruck im menschlichen Blut - Hirn-Schranke bei Patienten mit Epilepsie im Vergleich zu anfallsfrei Kontrolle38 . Zusammengenommen zeigen diese Entwicklungen, dass isolierte Gehirn-Kapillaren als ein vielseitiges Modell Barrierefunktion studieren dienen können.

Verschiedenen in vivo, ex-Vivound in Vitro Blut - Hirn-Schranke-Modelle wurden in Grundlagenforschung und der industriellen Drogentest, vor allem mit dem Ziel der Drug-Delivery zum Gehirn39,40,41 Tests verwendet ,42,43,44. Neben isolierten ex Vivo Gehirn-Kapillaren sind aktuelle Modelle der Blut - Hirn-Schranke in Silico Modelle, in Vitro Zellkultur von isolierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen oder immortalisierte Zelllinien aus verschiedenen Arten, in-vitro- Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC), die in Kapillare endothelial Zellen des Gehirns und mikrofluidischen Modelle auf einem Chip zu differenzieren.

In Silico Modelle sind am häufigsten in der Medikamentenentwicklung verwendet, für die Auswahl von Arzneimittelkandidaten anhand der prognostizierten Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) Eigenschaften. Methoden wie quantitative Struktur-Eigenschaft Beziehung (QSPR) Modelle und quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (QSAR) Modelle sind beliebte Methoden im Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken, Gehirn Eindringen von Wirkstoffkandidaten vorauszusagen 45 , 46. diese Modelle eignen sich zur Bildschirm-Moleküle für Barriereeigenschaften eindringen.

Betz Et al. 47 Monolagen der kultivierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen als ein in-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modellsystem etabliert. In-vitro- Kultur zellmodelle mit frischem Gewebe oder verewigt endotheliale Zell-Linien wie menschlichen zerebralen kapilläre Endothelzellen (hCMECs) können ein weiteres Hochdurchsatz-Screening-Tool für Gehirn eindringen oder mechanistische Studien sein. Jedoch Gehirn Kapillare endothelial Zelle Kultur Modelle fehlen die physiologischen Scherspannung des Blutflusses in der Kapillare Lumen, sind in ihrer gesamten biologischen Komplexität begrenzt und Veränderungen in Ausdruck und Lokalisierung der Hindernis-Komponenten wie tight Junction Proteinen Kanäle Oberfläche Rezeptoren, Transporter, Enzyme und Ionen-48,49,50. Umgekehrt, endotheliale Monolagen abgeleitet hPSCs, niedrigen Saccharose Durchlässigkeit im Vergleich zu hCMEC/D3 Kulturen und enthalten polarisierte Ausdruck einige Blut - Hirn-Schranke Transporter, Adhäsionsmoleküle und tight Junctions51, 52. allerdings diese Zellen unterliegen ebenfalls ändern Eigenschaften in der Kultur, und das System muss für die Reprise des in Vivo Barriere Eigenschaften52validiert werden.

Neuere Trends in der Blut - Hirn-Schranke Forschung umfassen unter Verwendung 3D Zellkultur Systeme schaffen künstliche Kapillaren, mit der Orgel-on-Chip-Technologie um mikrofluidischen Geräte verursachen, oder unter Verwendung der Hohlfaser-Technologie53, 54 , 55. künstliche Kapillaren haben jedoch deutlich größere Durchmesser (100 – 200 µm) als Gehirn-Kapillaren (3 – 7 µm). Daher ähneln die Schere Kräfte in Vitro nicht vollständig die in-Vivo -Situation. Dies richtet sich in "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrofluidischen Geräten, wo künstliche Membranen Form "Blut" und "Gehirn" Fächern und Flüssigkeiten durch diese Geräte erzeugen mikrofluidischen Scherkräfte gepumpt werden. In ähnlicher Weise wurden ko-Kulturen von Endothelzellen in verschiedenen Kombinationen mit Astrozyten und vaskulären glatten Muskelzellen auch mit der Hohlfaser-Technologie zur rheologischen Parameter unter in Vivo Bedingungen56 neu , 57 , 58. es ist jedoch unklar, wie gut dieses Modell andere Eigenschaften die Blut - Hirn-Schranke, wie Transport, Stoffwechsel, Signalisierung und andere reflektiert. Diese künstliche Kapillare und Chip-Modelle eignen sich für Hochdurchsatz-Screening von Drogen, aber die Zellen zur Erzeugung von diesen Modells vorbehalten auch während der Kultur.

Gefrorene und festen Gehirnscheiben oder primäre Gehirn, die Kapillare endothelial Zellkulturen sind weitere Modelle, dieStudie der menschlichen Microvasculature5,59,60,61genutzt werden können. Zum Beispiel Immunohistochemistry von festen Hirngewebe dient zur Bestimmung von Protein-Lokalisierung und Ausdruck in gesunden im Vergleich zu erkranktem Gewebe.

Neben Gewebe Scheiben und die in-vitro- Modelle können oben beschrieben, frisch isolierte Gehirn-Kapillaren genutzt werden, um die Funktion der Blut - Hirn-Schranke zu untersuchen. Einschränkungen dieses isolierte Kapillare Modells umfassen die Schwierigkeit zu frischem menschlichen Hirngewebe, Abwesenheit von Astrozyten und Neuronen und eine relativ aufwändige Isolierung Prozess. Ein Vorteil der Kapillare isolierte Gehirn-Modells ist, dass dieses Modell die in-Vivo -Situation ähnelt und daher verwendet werden, kann um die Barriere-Funktion und Dysfunktion zu charakterisieren. Wichtig ist, kann auch verwendet werden, zu erkennen, Signalisierung Mechanismen, die mit einer Vielzahl von Tests und Verfahren der molekularen3,19,62,63.

Unser Labor hat Zugang zu beiden frischen und gefrorenen menschlichen Hirngewebe durch die Sanders-Brown-Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. In diesem Zusammenhang Autopsien folgen ein Standardprotokoll, Gehirne erhalten in < 4 h und alle Verfahren entsprechen den Best Practices von NIH Ibbl65. Angesichts dieser einzigartigen Zugang zum menschlichen Hirngewebe, wir eingerichtet und optimiert ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu isolieren, der eine hohe Ausbeute an intakten, lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren führt. Zwei gemeinsame Endpunkte von Interesse sind die Protein-Expression und Aktivität zu bestimmen. In diesem Zusammenhang haben wir u.a. verschiedene Assays etabliert, die mit isolierte Gehirn-Kapillaren verwendet werden können, um Protein-Expression und Aktivität zu studieren. Diese Tests umfassen, Western blotting, einfache Western-Assay, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Zymography, Transport-Aktivität-Assays, und Kapillare durchsickern Assays. Diese Tests erlauben Forschern Änderungen in Barriere-Funktion im menschlichen pathologischen Bedingungen zu studieren, bestimmen Signalwege, die Protein-Expression und Aktivität zu regieren und ermitteln pharmakologische Ziele für die Behandlung von Blut - Hirn-Schranke verbunden Krankheiten.

Frisch zusammen genommen können isolierte Gehirn-Kapillaren als stabile und reproduzierbare Modell der Blut - Hirn-Schranke dienen. Dieses Modell ist vor allem, mit vielen verschiedenen Assays zu bestimmen, eine breite Palette von Endgeräten, Barrierefunktion zu studieren kombinierbar.

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Protokoll

Die nachstehenden Informationen basiert auf aktuellen Sicherheits- und Regulierungsstandards an der University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Als Vorsichtsmaßnahme beziehen sich auf die Institution biologische Sicherheitsprogramm und den aktuellsten Vorschriften und Empfehlungen vor der Arbeit mit menschlichem Gewebe.

Achtung: Menschliches Gewebe kann eine Quelle von Blut übertragene Krankheitserreger, einschließlich Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B-Virus (HBV) und Hepatitis C-Virus (HCV). Arbeiten mit menschlichem Gewebe besteht die Gefahr einer Infektion durch Blut übertragbaren Krankheitserregern. Daher sind bestimmte regulatorische und Sicherheitserwägungen unerlässlich, bei der Arbeit mit menschlichem Gewebe, Laborpersonal zu schützen. Arbeiten mit menschlichem Gewebe in den USA erfordert Biosafety Level 2 Labor und Sicherheitsvorkehrungen sowie Ausbildung im Einklang mit NIH Abschnitt IV-B-7, OSHA Act von 1970-Klausel 5(a)(1) und des Benutzers institutionelle biologische Sicherheitsprogramm. Im Allgemeinen muss institutionelle Biosafety Committee und/oder Institutional Review Board Genehmigung eingeholt werden, vor der Durchführung jeder Forschung am menschlichen Material (Gewebe, Körperflüssigkeiten). Das Training ist für alle Mitarbeiter mit menschlichen Materialien erforderlich und enthält grundlegende Labor Sicherheitstraining, z.B., chemische Hygiene und Sicherheit im Labor, sowie spezifische Ausbildung für biologische Sicherheit, gefährliche Abfälle und Mensch Blut übertragbaren Krankheitserregern. Alle Mitarbeiter arbeiten mit menschlichen Materialien sind dringend empfohlen, Hepatitis B Impfungen, vor der Arbeit mit menschlichen Materialien zu erhalten. Mitarbeiter sind verpflichtet, bestimmten persönlichen Schutzausrüstung bei der Arbeit mit menschlichen Materialien, z.B.tragen., einen gefesselten Laborkittel und ein Gesicht zu schützen, und tragen Sie Handschuhe zu allen Zeiten. Alle Arbeiten werden in eine biologische Kabinett (Klasse 2) ausgeführt. Alle Geräte, der in Kontakt mit menschlichen Materialien und Abfällen aus menschlichen Materialien kommt ist entsprechend behandelt, um Verschmutzung und/oder Infektion des Personals zu verhindern. Alle Geräte und Oberflächen werden mit 10 % Bleichmittel und 75 % Ethanol jedes Verfahrens unter Beteiligung menschlichen Materialien gereinigt. Ein Überlauf mit menschlichen Materialien muss sofort bereinigt werden. Glas ist nach jedem Gebrauch autoklaviert. Abfälle, einschließlich der fixierten menschliches Gewebe, ist in einer beschrifteten Biohazard Auffangbeutel gesammelt und autoklaviert. Sharps werden in eine Punktion und auslaufsicheren Behälter beschriftet als biogefährlichen gesammelt. Alle Abfälle aus menschlichen Materialien ist die Institution biologische Sicherheitsvorschriften entsprechend entsorgt.

Hinweis: Unser Labor erhält frische frontalen Kortex Proben von verstorbenen Personen durch den Sanders-Brown-Center on Aging (IRB #B15-2602-M). Einschlusskriterien sind: Einschreibung in der UK-ADC längs Autopsie Kohortenstudie und ein Post-Mortem-Intervall (PMI) ≤4 h64. Autopsien folgen ein Standardprotokoll und alle Verfahren entsprechen den NIH Ibbl Best Practice-Richtlinien65. Eine kurze PMI von weniger als 4 h ist von höchster Bedeutung für Kapillare Tragfähigkeit nach Isolierung. Frisches und gefrorenes Gewebe kann verwendet werden. Wenn einfrieren notwendig ist, frisch gewonnenen menschlichen Hirngewebe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei-80 ° c gelagert Frisch oder aufgetaut Gewebe sollte in Isolation Puffer (siehe unten) gespeichert und schnell verarbeitet werden. Wir finden, dass 10 g frisches menschliches Gewebe Erträge etwa 100 mg der Gehirn-Kapillaren (Frischgewicht).

1. setup

  1. Puffer-Vorbereitung
    Hinweis: Die Lautstärke des Puffers benötigt richtet sich nach der Menge des Gewebes. Alle Puffer Volumes in das folgende Protokoll basieren auf 10 g der menschlichen Hirnrinde Hirngewebe.
    1. L-Isolation-Puffer: Verwenden Sie 1,5 L Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) und ergänzen mit 5 mM D-Glukose (1,35 g ) und 1 mM Natrium Pyruvat (0,165 g). Nach dem Hinzufügen der Glukose und Pyruvat, passen Sie sich an pH 7.4 mit Natriumhydroxid. Abkühlen lassen und den Puffer um 4 ° C vor der Verwendung zu speichern.
    2. Rinderserumalbumin (BSA): Fügen Sie 10 g BSA Pulver 1 L Puffer, Isolierung um eine BSA-Endkonzentration von 1 hinzu %. Rühren Sie langsam um Luftblasen zu vermeiden, auf pH 7.4 einstellen und über Nacht bei 4 ° C lagern. Unmittelbar vor Gebrauch rühren Sie sanft; vermeiden Sie Luftblasen zur Vermeidung von Albumin Denaturierung.
    3. Dichte-Gradienten-Medium: wiegen 18 g Dichte Gradienten Mediums in eine Flasche und fügen Sie eine magnetische Stir Bar. Fügen Sie 60 mL Isolierung Puffer und 5 min lang kräftig schütteln Sie, bis alle Pulver ausgesetzt ist. Laden über Nacht bei 4 ° C, Dichte Gradienten Mittel-und auflösen lassen. Für 10 min vor Gebrauch umrühren.
    4. Speichern Sie alle Puffer bei 4 ° C; halten Sie alle Werkzeuge und Puffer auf dem Eis während des gesamten Isolierung-Verfahrens. Umrühren Sie alle Puffer vor Gebrauch.
  2. Versuchsaufbau
    1. Montieren Sie den Stößel der Potter-Elvehjem Gewebe Mühle auf der elektronischen Overhead Rührer. Legen Sie die Potter-Elvehjem-Gewebe-Mühle und Dounce-Homogenisator mit Stößel auf Eis unter der Haube. Bereiten Sie eine 300 µm Filternetz (5 x 5 cm2) Falten Sie es auf einem Kegel und einlegen Sie und verbinden Sie es mit einem 50 mL Falcon-Röhrchen mit Klebeband (Abbildung 1A).
    2. Miteinander verbundene Ringe und Zelle Stamm Filter (Porengröße: 30 µm) auf 50 mL Falcon Röhren. Bereiten Sie biogefährlichen Müllbeutel. Legen Sie alle benötigten Geräte in der Biosicherheit Schrank (siehe Tabelle der Materialien).

2. Gehirn Probenvorbereitung

Hinweis: Abbildung 1A zeigt das Workflow-Diagramm der unten beschriebenen Verfahren die gesamte Isolierung. Menschliche Gehirngewebe kann von jedem Teil des Kortex stammen und kann verwendet werden, frisch oder gefroren. Gefrorene Hirngewebe kann bei Raumtemperatur (kein Puffer; ~ 30 min für 10 g) aufgetaut werden. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, sollte der gleichen Hirnregion für jedes Experiment das Hirngewebe eingeholt werden. Dieses Protokoll ist optimiert für frisch (PMI < 4 h) menschlichen Hirnrinde, die nicht fixiert wurde.

  1. Vorbereitung der menschlichen Hirngewebe: das Gewicht des Hirngewebes zu dokumentieren. Alle Zahlen in das folgende Protokoll eignen sich für 10 g frische menschlichen Hirngewebe. Platzieren Sie das Hirngewebe in einem 100 mm Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute mit der Pinzette. Verwenden Sie ein Skalpell zum Abschneiden der weißen Substanz.
  2. Zerkleinerung von menschlichen Hirngewebe: sorgfältig zerschnitten das Hirngewebe und zerkleinere es mit einem Skalpell. Hackfleisch für ca. 5 min (2 – 3 mm Stück). Übertragen Sie das Gehirngewebe zum Potter-Elvehjem Gewebe Mahlwerk. 30 mL Isolierung Puffer hinzugeben.
    Hinweis: Die Hackfleisch / Gewebe-Stücke sind schwer zu sehen, da das Gehirngewebe in Brei durch den affektierten Prozess verwandelt.

3. Homogenisierung

  1. Potter-Elvehjem Gewebe Schleifer (Abstand: 150-230 µm): jede Probe mit 100 Schlägen Homogenisator Geschwindigkeiten von 50 u/min zu homogenisieren. Dokumentieren Sie der Zeit, jede 25 Schlägen und den gesamten Zeitaufwand für 100 Hüben. Siehe Tabelle 1 für eine vorgeschlagene Homogenisierung Protokoll; die Gesamtzeit für Homogenisieren 10 g des menschlichen frontalen Kortex ist ca. 22 Minuten. Rühren Sie nicht in Luft, um Luftblasen zu verhindern.
  2. Dounce-Homogenisator (Abstand: 80 – 130 µm): Das Homogenat in einem Dounce-Homogenisator auf Eis zu übertragen. Das Fahrwerk mit 20 Schlägen (~ 6 s/Hub, insgesamt ~ 2 min) zu homogenisieren. Vermeiden Sie Luftblasen.

(4) Zentrifugieren

  1. Verteilen Sie das Gehirn Homogenat ebenso in vier 50 mL Zentrifugation Röhren und dokumentieren das Gesamtvolumen der Homogenat. 50 mL Dichte Gradienten Puffer in die Zentrifugation Röhren (12,5 mL pro Röhrchen) zu verteilen. Verwenden Sie 10 mL Isolierung Puffer spülen Sie den Stößel und Homogenisator und verteilen in die vier Zentrifugation Röhren (~2.5 mL pro Röhre).
  2. Schließen Sie dicht die Zentrifuge Rohre mit Kappen. Mischen Sie Homogenat, Dichte-Gradienten-Medium und Puffer durch die Rohre kräftig schütteln. Zentrifugieren Sie bei 5.800 X g für 15 min bei 4 ° C (Rotor mit festen Winkeln); Wählen Sie eine mittlere Verzögerung Geschwindigkeit zu halten das Pellet am Rohr befestigt. Den überstand verwerfen und jedes Pellet in 2 mL 1 % BSA aufzuwirbeln.

(5) filtration

Hinweis: Um die Kapillaren von roten Blutkörperchen und andere zellenrückstand zu trennen, sind mehrere filtrationsschritte notwendig.

  1. 300 µm Netz: nach Re Aussetzung der Pellet, filtern die Aussetzung durch den 300 µm-Sieb. Kapillaren sind durch das Gitter gefiltert, während größere Schiffe und größeren Gehirn Ablagerungen auf dem Netz bleiben. Waschen Sie sorgfältig das Netz mit bis zu 50 mL 1 % BSA. Entsorgen Sie das Netz.
    Hinweis: Diese Filtrationsschritt löscht die Kapillare Aussetzung von jedem größeren Schiffe oder Teile des Gehirns Schutt.
  2. 30 µM Zelle Stamm filter
    Hinweis: Diese Filtrationsschritt trennt Kapillaren von roten Blutkörperchen und andere Gehirn Ablagerungen.
    1. Verteilen Sie die Kapillare Filtrat aus Schritt 6.1 über die fünf 30 µm Zelle Stamm Filter (ca. 10 mL der Kapillare Filtrat pro Zelle Stamm Filter). Kapillaren sind durch diesen Filter zurückgehalten, während rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und kleinen Gehirn Schmutz durch den Filter passieren und sind in das Filtrat gesammelt.
    2. Waschen Sie jeden Filter mit 25 mL 1 % BSA. Danach alle Filtrate übergießen der sechsten Filter, um den Ertrag zu steigern. Waschen Sie jeden Filter mit 50 mL 1 % BSA; halten Sie die Zelle Stamm Filter mit den Kapillaren und entsorgen Sie das Filtrat.

(6) Kapillare Sammlung

  1. Drehen Sie den Filter um und waschen Sie die Kapillaren mit 50 mL 1 % BSA für jeden Filter in 50 mL Röhrchen. Sanft andrücken mit einer 5 mL-Pipette pipettieren und bewegen Sie es über den Filter auf die Gehirn-Kapillaren abwaschen.
  2. Achten Sie darauf, alle Gehirn-Kapillaren, vor allem vom Rand des Filters abwaschen. Vermeiden Sie Luftblasen, denn dies die Filtration erschwert und die Wahrscheinlichkeit der Kapillare Verlust erhöht.

7. Waschen

  1. Nach dem Sammeln der Kapillaren, Zentrifugieren Sie alle Proben bei 1.500 X g für 3 min bei 4 ° C (schwingende Eimer Rotor). Entfernen Sie den überstand zu und wieder auszusetzen Sie das Pellet in etwa 3 mL Isolierung Puffer. Kombinieren Sie alle resuspendierte Pellets aus einer Probe in einem 15 mL konische Röhrchen und mit Isolierung Puffer zu füllen. Zentrifuge wieder bei 1.500 X g für 3 min bei 4 ° C und zwei Mal waschen.
  2. Dokumentieren Sie die Kapillare Reinheit mit einem Mikroskop (100 X Vergrößerung) und Kamera (Abbildung 1 b).
    Hinweis: Der Gehirn Kapillare Ertrag von 10 g des menschlichen Hirngewebe ist in der Regel etwa 100 mg. Die isolierte Gehirn-Kapillaren können nun verwendet werden, für Experimente, verarbeitet (z. B.., lysate, Membran-Isolierung), oder Blitz eingefroren und bei-80 ° C im Cryoröhrchen für ein Minimum von 6 – 12 Monaten (vermeiden Sie mehrere Gefrier-tau-Zyklen) gelagert werden.

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Ergebnisse

Die Isolationen aus menschlichen Hirngewebe ergeben eine Suspension im menschlichen Gehirn Kapillaren (Abbildung 1 b) angereichert mit geringen Mengen an größere Schiffe, rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und einige zellenrückstand. Einige Kapillaren verzweigt sind, und in einigen, roten Blutkörperchen in den Kapillaren Lumen gefangen sind. Die typische Kapillare hat einen 3 – 7 µm Durchmesser und ist etwa 100-200 µm lang mit offenen Lumen; die meisten...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakt und lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren aus frischem Gewebe. In diesem Abschnitt besprechen wir im Detail Folgendes: (1) Änderungen des Protokolls, 2) Problembehandlung für häufige Fehler, (3) die Grenzen der Technik, (4) die Bedeutung des Modells im Hinblick auf bestehende und alternative Blut - Hirn-Schranke-Modelle, und 5). Einsatzmöglichkeiten für isolierte Gehirn-Kapillaren.

Das hier beschriebene Protokoll ist für 10 g frische me...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken und Dr. Peter Nelson und Sonya Anderson in der UK-ADC Brain Tissue Bank für die Bereitstellung aller menschlichen Gehirns Gewebeproben anerkennen (NIH grant Nummer: P30 AG028383 vom National Institute on Aging). Wir danken Matt Hazzard und Tom Dolan, Universität von Kentucky, Information Technology Services, akademischen Technologie und Fakultät Engagement für grafische Unterstützung. Dieses Projekt wurde von Grant Nummer 1R01NS079507 vom National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (um b.b.) und Nummer 1R01AG039621 Zuschuss aus dem National Institute on Aging (zu A.M.S.H.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall oder das National Institute on Aging. Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
Diamond Grip Plus Latexhandschuhe, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636PSA
Einweg-LaborschutzkittelVWR, Radnor, PA, USA470146-214PSA; aufgrund der Beschaffenheit des menschlichen Ausgangsmaterials wird die Verwendung eines Einweg-Laborkittels empfohlen
Gesichtsschutz, EinwegThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA19460102PSA; aufgrund der Beschaffenheit des menschlichen Ausgangsmaterials wird die Verwendung eines Einweg-Gesichtsschutzes empfohlen
Sicherheitsmaterialien
Clavies Hochtemperatur-Autoklavenbeutel 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA01-815-6
Versi Trockenbankpapier 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32zur Abdeckung von Arbeitsbereichen
VWR Sharps ContainerSystems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272für gebrauchte Skalpelle
Bleach 8,2% Clorox Keimtötend 64 oz.Versorgungszentrum in Großbritannien, Lexington, KY, USA323775
Equipment
4 ° C KühlschrankThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA13-986-148
Accume BASIC AB15 pH-MessgerätThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, USA501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR ZentrifugeThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75004521
Leica L2 PräpariermikroskopLeica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USAzur Entfernung von Hirnhäuten
POLYTRON PT2500 HomogenisatorKinematica AG, Luzern, Schweiz9158168
Scale P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, USA0191392
Standard Mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA1151050
Thermoskannen Flüssiger Stickstoff DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Czum Einfrieren des Gewebes verwendet?
Voyager Pro AnalysenwaageOHAUS, Parsippany, NJ, USAVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USAzur Überprüfung isolierter Kapillaren
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1Waschen Sie die Kapillaren ab Filter
Finnpipette II Pipette 100-1.000 &Mikro; LThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1resuspendiertes Pellet in BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, USA739658
50 mL Falcon Röhrchen 25/Rack - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCO SkalpellklingenThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Czum Zerkleinern von Hirngewebe
PARAFILMVWR, Radnor, PA, USA52858-000zum Abdecken von Becherglas und Messkolben
Thermo Scientific Finntip Pipettenspitzen 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304zum Abwaschen der Kapillaren vom Filter
60 mL Spritze mit Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USABD309653Verwendung mit Verbindungsring zum Filtern der Kapillaren
Skalpellgriff #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13zum Zerkleinern
von Dumont Forceps #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10zum Entfernen von Hirnhäuten
Potter-Elvehjem TissueGrinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E2550 mL Volumen, Clearance: 150-230 μ m
Dounce HomogenisatorVWR, Radnor PA USA62400-64215 mL Volumen, Clearance: 80-130 μ m
Spectra/Mesh Woven Filter (300 & Mikro; m)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA146424Wird zur Filterung von Kapillarsuspension verwendet, um Hirnhäute zu entfernen, die
möglicherweise pluriSieber (Porengröße: 30 & Mikro; m)pluriSelect Life Science, Leipzig, Deutschland43-50030-03
VerbindungsringpluriSelect Life Science, Leipzig, Deutschland41-50000-03Mehrfache Wiederverwendung
1 L Messkolbenzur Herstellung von Isolationspuffer
1 L Becherglaszur Herstellung von 1% BSA
Rührstabzur Aufbereitung von 1% BSA und Ficoll®
Schott Flasche (60 mL)zur Herstellung von Ficoll®
Eiskübel, um alles kalt zu halten
100 mm Petrischalezum Zerkleinern von Hirngewebe
Tissue Culture Cell ScraperVWR, Radnor, PA, USA89260-222zum Entfernen von Überständen nach der Zentrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA9647-500gin DPBS mit Ca2+ & Mg2+ am Vortag. Vermeiden Sie Blasen bei der Zubereitung. Im Kühlschrank aufbewahren. Vor Gebrauch 10 Minuten langsam umrühren.
DPBS mit Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - Teil des Isolationspuffers
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375Hier kommt es auf eine exakte Messung an. In der Flasche mit Rührstäbchen abwiegen. Nach der Zugabe von DPBS kräftig schütteln. Im Kühlschrank aufbewahren O/N. Am Morgen wird es klar sein. Vor Gebrauch 10-15 Minuten vorsichtig umrühren. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.
Glukose (D-(+) Dextrose)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528Glukose (D-(+) Dextrose) Konzentration: 5 mM
Natriumhydroxid-StandardlösungSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474zur Einstellung des pH-Werts des DPBS
NatriumpyruvatsSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256Konzentration: 1 mM

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