Methodenartikel

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/57348

⸱

2. Mai 2018

 , 
1Department of Physics Education, Kongju National University, 2Department of Physics, Harvard University, 3FAS Center for Systems Biology, Harvard University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.

Zusammenfassung

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In den letzten zehn Jahren mikrofluidischen Techniken angewendet wurden, um kleine Tiere, einschließlich der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, zu studieren und haben sich bewährt als praktisch live imaging Plattform bietet Funktionen für präzise Steuerung der experimentellen Bedingungen in Echtzeit. In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmern beschäftigt WormSpa, ein zuvor veröffentlichten benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht. Um die Funktion zu veranschaulichen, haben wir Proof of Principle Experimenten, in denen Würmer im Gerät mit pathogenen Keimen infiziert wurden, und die Dynamik des Ausdrucks der Immunantwort Gene und Eiablage wurden in einzelnen kontinuierlich überwacht Tiere. Einfache Planung und Betrieb dieses Gerätes machen es für Benutzer ohne Vorkenntnisse mit mikrofluidischen basierenden Experimente geeignet. Wir schlagen vor, dass dieser Ansatz nützlich für viele Forscher in Längsrichtung Beobachtungen biologischer Prozesse unter genau definierten Bedingungen interessiert sind.

Einleitung

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Veränderungen der Umweltbedingungen führen zu einer Aktivierung des genetischen Programme, die begleitet von Induktion und Unterdrückung der Expression bestimmter Gene1,2. Diese kinetische Änderungen möglicherweise Variable unter Gewebe in den gleichen Tieren und zwischen den verschiedenen Tieren. Studien über solche genetische Programme fordern daher Methoden, die ermöglichen längs-Bildgebung einzelner Tiere und dynamische Kontrolle der Umweltbedingungen.

In den letzten Jahren wurden Microfabricated fluidischen Geräten verwendet, um viele Aspekte der Reaktion und Verhalten bei kleinen Tieren, darunter Würmer, fliegen, Bärtierchen und weitere3,4,5,6zu studieren, 7. Anwendungen sind zum Beispiel Tiefe Phänotypisierung, optogenetische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität in Reaktion auf chemische Reize und Nachverfolgung der motorischen Verhaltensweisen wie Fortbewegung und Pumpen8,9,10 , 11.

Mikrofluidik-basierte Ansätze halten viele Eigenschaften, die langfristige längs Bildgebung der Reaktion auf ökologische Hinweise, einschließlich präzise dynamische Steuerung der lokalen Mikroumgebung, flexibles Design, das ermöglicht die Aufrechterhaltung der profitieren könnten einzelne Tiere in getrennten Bereichen und günstige Eigenschaften für die Bildgebung. Pflege Tiere in einer mikrofluidischen Kammer für eine lange Zeit mit minimalen negativen Auswirkungen auf ihre gut Wesen ist jedoch eine Herausforderung, die besonderen Sorgfalt bei der Gestaltung von mikrofluidischen Gerät sowie bei der Durchführung des Experiments erfordert.

Hier zeigen wir die Verwendung von WormSpa, einem mikrofluidischen Gerät für die longitudinale Bildgebung von Caenorhabditis Elegans. 5 einzelne Würmer beschränken sich in Kammern. Niedrige Zufuhr von Flüssigkeit und bakterielle Federung gewährleistet, dass Würmer sind gut gefüttert und ausreichend aktiv zur Erhaltung guten Gesundheits und Stress zu lindern, und die Struktur der Kammern Würmer Eier legen. Die Einfachheit der Konstruktion und Betrieb von WormSpa sollte Forscher ohne Vorkenntnisse Mikrofluidik, dieses Gerät in ihre eigenen Forschungsvorhaben zu integrieren ermöglichen.

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Protokoll

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Das Protokoll unten verwendet WormSpa5, ein zuvor beschriebenen mikrofluidischen Gerät für die longitudinale Bildgebung von Würmern. Herstellung von WormSpa (beginnend mit CAD-Dateien, die von den Autoren auf Anfrage erreicht werden können) ist einfach aber erfordert einiges an Fachwissen. In den meisten Fällen kann Fertigung ohne weiteres erfolgen, durch eine zentrale Anlage oder von einem gewerblichen Unternehmen, das solche Dienste bereitstellt. Wenn das Gerät herstellen, stellen Sie sicher, um anzugeben, dass die Höhe der Features 50 µm beträgt.

1. Versuchsaufbau

  1. Montieren Sie das mikrofluidischen Gerät auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Stadium.
  2. Legen Sie einem Orbitalschüttler nahe dem Mikroskop, aber stellen Sie sicher, dass die Schwingung aus dem Shaker wirkt nicht direkt das Mikroskop. Legen Sie beispielsweise den Shaker auf einem Regal befestigt an der Wand, die keinen Kontakt mit der optischen Tisch macht.
  3. Die Orbitalschüttler eine Spritzenpumpe aufsetzen. Kleben Sie die Pumpe in den Shaker, damit es nicht beim Schütteln wackeln.

2. Vorbereitung der mikrofluidischen Umgebung

Hinweis: Während des Experiments sind vier Spritzen mit mikrofluidischen Gerät per Spritze Röhren verbunden, wie in Abbildung 1dargestellt. Dieser Schritt beschreibt die Vorbereitung der diese Spritzen. Sofern nicht anders erwähnt, halten Sie die Spritze Röhren so kurz wie möglich ohne sie straff.

  1. Bereiten Sie ein Outlet-Spritze und ein Rohr der Spritze. Diese Spritze (S1 in Abbildung 1) wird später an die Steckdose des Geräts durch das Rohr der Spritze angeschlossen und verwendet für die temporäre Speicherung von Flüssigkeit aus dem Gerät kommen.
    1. Machen Sie eine Adapter-Nadel durch Kunststoffteile ein 20 X 1/2 Zoll-Spritze-Tip, halten nur die Nadel (Metallteil) entfernen. Tun Sie dies durch den Kunststoff und Metall-Teile mit einer Zange halten und Auseinanderziehen. Verbleibenden kunststoffreste auf der Nadel kann mit dem Bunsenbrenner abgebrannt.
    2. Biegen Sie die Nadel nach der Geometrie des experimentellen Aufbaus während seiner beiden Enden mit einer Zange halten. In der hier beschriebenen Ausführung ist die Nadel in der Mitte in einem Winkel von ~ 110 ° Biegung am bequemsten.
    3. Stecken Sie die Adapter-Nadel auf halbem Weg in die Röhre. Die andere Hälfte wird später an das Gerät angeschlossen werden. Das Rohr der Spritze sollte mit 20 G Spritze Spitze ohne ein Leck (z. B. Schläuche mit Innendurchmesser von 0,86 mm und Außendurchmesser von 1,32 mm) kompatibel. Die empfohlene Länge ist ca. 50 cm.
    4. Verbinden Sie eine 10 mL Spritze mit Luer-Lock mit anderen (offenen) Ende der Spritze Röhre über einen 20 X 1/2 Zoll-Spritze-Tipp.
  2. Puffer-Einlass Spritzen vorbereiten und Spritze Röhren. Einer der diese Spritzen (S2 in Abbildung 1) dient als Reservoir für die Flüssigkeit, die in das Gerät und zur Steuerung der Einspritzung geht. Die andere Spritze (S3 in Abbildung 1) ist für Buffer Tausch erforderlich, wie in Schritt 3.2 erläutert.
    1. Eine 10 mL Spritze mit Luer-Lock (S2) direkt an ein 3-Wege-Ventil und schließen Sie eine andere Spritze (S3) an das gleiche Ventil über eine Spritze Schlauch (Abbildung 1): S3 mit dem Rohr über eine Spritze Tipp zu verbinden, und schließen Sie den Schlauch an das Ventil über eine andere Spritze Spitze.
      Hinweis: Die Reihenfolge, in der diese Materialien verbunden sind, spielt keine Rolle.
    2. Schließen Sie einen Spritze Schlauch an den verbliebenen Anschluss des 3-Wege-Ventil. Bereiten Sie einen anderen Adapter Nadel wie in Schritt 2.1.2, und stecken Sie die Nadel halbwegs in anderen (offenen) Ende der Spritze Röhre.
    3. Das Ventil so eingestellt, dass die Spritze Röhre im Schritt 2.2.2 und S2 verbunden sind, während S3 geschlossen ist (Abbildung 1).
  3. Bereiten Sie eine Wurm-Einlauf Spritze und eine Spritze Schlauch. Diese Spritze (S4 in Abbildung 1) dient der Würmer in das Gerät laden.
    1. Schließen Sie einen lange Spritze Schlauch an eine 10 mL Spritze mit Luer-Lock (S4). Bestimmen Sie die Länge des Rohres aus dem Volumen der Flüssigkeit, die zum Laden verwendet werden; 100 cm Rohr unterstützt z. B. mehr als 2 mL Flüssigkeit (auch, siehe Punkt 4.2).
    2. Bereiten Sie einen anderen Adapter Nadel wie in Schritt 2.1.2, und stecken Sie eine Hälfte der Nadel, um anderen (offenen) Ende der Spritze Röhre.
  4. Spülen Sie die Spritzen und Schläuche mit S-Medium12 zweimal. Füllen Sie die Spritzen und die Rohre mit S-Mittel, kümmert sich um alle Luftblasen zu entfernen.
  5. Schließen Sie den Auslass Spritze Schlauch an das Gerät an.
    1. Stecken Sie die Adapter-Nadel am Ende der Spritze Schlauch zum Auslass.
    2. Ein kleines Volumen des S-Mediums durch den Auslass des Geräts zu füllen, bis ein wenig S-Medium aus dem Puffer Einlass und Wurm Einlauf kommt zu injizieren.
  6. Schließen Sie den Puffer-Spritze Schlauch an der Puffer-Ansaugöffnung des Gerätes, beim Einstecken des Wurm-Einlass mit einem Stift (Edelstahl Dübel Pin mit einem 1/32-Zoll-Durchmesser).
  7. Injizieren Sie einen konstanten Strom von Puffer in das Gerät. Laden Sie die Puffer-Einlauf Spritze S2 auf eine Spritze Pumpe13, und die Pumpe so eingestellt, dass das Medium in S2 in das Gerät bei einer Durchflussmenge von 3 µL/min kontinuierlich eingespritzt wird.

(3) laden Bakterien in mikrofluidischen Gerät

  1. Bereiten Sie Escherichia coli OP50 in S-Medium12ausgesetzt.
    1. Im Anschluss an ein standard-Protokoll eine 250 mL Flasche mit 50 mL LB und eine einzige Kolonie zu impfen, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    2. Zentrifugieren Sie Nacht Kultur bei 4000 u/min für 10 Minuten und Aufschwemmen Sie das Pellet in 30 mL S-Medium.
    3. Filtern Sie die Aussetzung durch eine 5 µm-Spritze-Filter. Messen Sie die Bakterienkonzentration durch seine optische Dichte bei 600 nm (OD600), und passen Sie die Konzentration auf eine OD600 3. Diese hohe Dichte ist erforderlich, um die Würmer satt zu halten.
  2. Tauschen Sie den Puffer in das Gerät mit dem OP50-Fahrwerk.
    1. Bereiten Sie eine saubere Spritze (S5) gefüllt mit dem OP50-Fahrwerk. Halten Sie die Spritze senkrecht und drücken Sie es mehrmals, um die Luftblasen an der Spitze zu sammeln.
    2. Drehen Sie das 3-Wege Ventil der Puffer-Einlass Spritzen, schließen Sie die Verbindung zum Gerät, und verbinden Sie die zwei Spritzen, S2 und S3. S2 aus der Spritzenpumpe zu lösen.
    3. Trennen Sie das Ventil S2 und schließen Sie S5 an das Ventil an. Drücken Sie die Luft an der Spitze der S5 S3 durchströmt werden gesammelt, bis ein wenig des Puffers OP50 in S3 geht. Stellen Sie auf diese Weise sicher, dass keine Luftblase in S5 oder das Ventil bleibt.
    4. Drehen Sie das 3-Wege-Ventil wieder in die ursprüngliche Position schließen die Verbindung zwischen S3 und S5 und S5 an das Gerät anschließen. Laden Sie S5 auf die Spritzenpumpe. Orbitalschüttler, das hält die Pumpe einschalten. Die schütteldrehzahl auf ca. 200 u/min einstellen
    5. Einstellen der Durchflussmenge 100 µL/min sein. Der Zeitaufwand für den neuen Puffer, um die Würmer in das Gerät zu erreichen hängt von der Länge der Puffer-Spritze Schlauch (ca. 5 Minuten mit dem oben beschriebenen Schlauch). Eine höhere Durchflussrate kann eingesetzt werden, wenn ein schneller Puffer Austausch erforderlich ist.
    6. Sobald die OP50 Puffer in das Gerät verbreitet, setzen Sie die Durchflussmenge auf 3 µL/min zurück.

4. Laden Würmer in mikrofluidischen Gerät

  1. Bereiten Sie einen kleine geringe Bindung Microcentrifuge Schlauch (650 µL) und füllen Sie ihn mit 100 µL OP50 Aufhängung. Übertragen um 20-30 Jahren synchronisiert jungen Erwachsenen Würmer (46 Stunden post L1 Larven Verhaftung bei 25 ° C) von einer nährbodenplatte NGM (Nematoden Wachstumsmedium) am Rohr durch Abnehmen sie eins nach dem anderen mit einem Wurm zu wählen. Alter-Synchronisation kann nach einem Standardprotokoll12erfolgen.
  2. Füllen Sie den Wurm-Einlass Spritze und Spritze tube (S4 in Abbildung 1) mit dem OP50-Fahrwerk. ~ 500 µL der Flüssigkeit in den Microcentrifuge Schlauch mit Würmern zu injizieren. Ziehen Sie die Suspension mit Würmern in den Wurm-Spritze Schlauch. Stellen Sie sicher, dass die Spritze Schlauch lang genug ist (> 1 m) und dass gezeichnete Würmer in das Rohr der Spritze zu bleiben und nicht zu machen, ganz nach der Spritze S4.
  3. S4 mit dem Wurm-Einlass zu verbinden. Injizieren Sie die Würmer in die Wurm-Spritze Schlauch in mikrofluidischen Gerät. Trennen Sie S4 und das Rohr der Spritze. Stecken Sie den Wurm-Einlass mit einem Stift.
  4. Lösen Sie die Puffer-Einlauf Spritze S2 von der mechanischen Pumpe ( Abbildung 1) zu und manuell steuern Sie, S1 und S2, um die Würmer in getrennten Kanälen zu schieben. S2 drücken bewegt sich Würmer in die Kanäle, während S1 drücken sie in die entgegengesetzte Richtung bewegen. Sobald ein Kanal geladen ist, wird die Wurm in jedem Kanal den Eintrag Andere Würmer blockieren.
  5. Lassen Sie Würmer für ca. 2-3 Stunden an die neue Umgebung anpassen.

(5) die Einrichtung eines Imaging-Protokoll

  1. Finden Sie alle Würmer, die sicher im Gerät befinden, und legen Sie eine bildgebende Position für jeden von ihnen in der Bild-Datenerfassungs-Software, die Ihr Mikroskop kontrolliert. Beachten Sie, dass in einigen Fällen (z.B. bei höherer Vergrößerung gewünscht wird, oder bei Verwendung von Kameras mit einem kleineren CCD-Sensor) mehrere bildgebende Positionen sind erforderlich für jeden Kanal.
    Hinweis: Während dies manuell durchgeführt werden, können einige Softwarepakete Erwerb eine Text-Datei laden, in dem die Positionen aufgelistet, wo Bilder aufgenommen werden sollte. Da diese Positionen regelmäßig in WormSpa bestellt werden, kann ein Benutzer (z. B. in Python oder kommerzielle Software) ein kleines Skript schreiben, das automatisch eine solche Liste erstellt. Das genaue Format dieses Skript würde abhängen, das Dateiformat von Datenerfassungs-Software (siehe ein Beispiel in ergänzenden Material 1) erwartet.
  2. Stellen Sie die erforderliche Frequenz der Zeitraffer Bildgebung. Beispielsweise erfolgt die Bildgebung immun gen Reaktion auf die Infektion mit einer Frequenz von 10 Minuten pro Frame. Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Kanäle (z. B. Hellfeld und die GFP-Fluoreszenz) zu jedem Zeitpunkt erworben werden.

6. Wirtsantwort, Pseudomonas-Infektion

Hinweis: Dieser Schritt ist spezifisch für Wirt-Pathogen Interaktionen zu studieren. Alternativ kann man einen Puffer vorbereiten, der andere ökologische Hinweise von Interesse (biotische und abiotische Stressoren, Drogen, Signalisierung Moleküle, etc.) enthält.

  1. Bereiten Sie Pseudomonas Aeruginosa PA14 ausgesetzt in SK-Medium14 vor.
    1. Eine 250 mL Flasche mit 50 mL LB und eine einzige Kolonie zu impfen, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    2. Eine weitere 250 mL Flasche mit 50 mL LB und ein Aliquot der Kultur zu impfen, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    3. Zentrifugieren Sie Nacht Kultur bei 4000 u/min für 10 Minuten und Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL SK-Medium. Messen der Bakterienkonzentration und passen Sie die Konzentration auf OD600 = 4.
    4. Die Aussetzung in eine saubere Flasche und Inkubation bei 37 ° C für 24 Stunden und bei 25 ° C für weitere 24 Stunden unter schütteln. Dieser Schritt ahmt die Platte inkubationsschritt in der Norm Assay14zu töten.
    5. Filtern Sie die Aussetzung durch eine 5 µm-Spritze-Filter. Dies soll verhindern, dass bakterielle Aggregate verstopfen des Geräts.
  2. Ersetzen Sie die OP50 Suspension in das Gerät mit der PA14-Aussetzung, nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.2. Halten Sie imaging für 10 Stunden.

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Ergebnisse

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Alter-synchronisierte jungen Erwachsenen Würmer (46 Stunden Post L1 Larven Verhaftung bei 25 ° C)12 wurden in das Gerät geladen, wie im Protokoll beschrieben. Die Würmer befanden sich einzeln in separaten Kanälen ermöglichen längs der Tiere als Reaktion auf den Erreger zu messen. Wenn der Versuch erfolgreich ist, bleiben die meisten Würmer in ihren Kanälen für die Dauer des Experiments. In diesem Fall sind Bilder von einzelnen Würmer genommen, einfach indem man ihr...

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Diskussion

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Mikrofluidische Tools bieten mehrere Vorteile bei der Untersuchung von Würmern. Bildgebung in einem PDMS bietet Gerät höhere Bildqualität im Vergleich zu einer standard NGM-Agar-Platte. Mehrere Bilder können ein einziger Wurm, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden entnommen werden, in denen Tiere abgeholt von der Platte und montiert auf einen Objektträger für die Bildgebung. Darüber hinaus kann der Mikroumgebung, in denen Würmer befinden sich, konstant oder modulierte wie gewünscht, erlaubt präzise Zuordnung zwischen de...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Science Foundation durch Zuschüsse PHY-1205494 und MCB-1413134 (EL) und die National Research Foundation of Korea Grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
WormSpaN/AN/ADie CAD-Datei für WormSpa ist im Levine-Labor erhältlich.
Zusammengesetztes MikroskopZeissAxioObserver Z1Ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit motorisiertem Tisch
SpritzenpumpeNew Era Pump SystemsNE-501
TubingSCI Scientific Commodities Inc.BB31695-PE/50,034" (0,86 mm) Innendurchmesser x 0,052" (1,32 mm) Außendurchmesser
SpritzenspitzeCMLsupply901-20-05020 Gauge x 1/2" stumpfe Spitze Edelstahl-Canula
SpritzenvorsatzfilterPALL4650Acrodisc 32 mm Spritzenvorsatzfilter mit 5 μm Supor Membran
SpritzeQosinaC330710 mL männliche Luer-Lock-Spritze
3-Wege-VentilColeParmerFF-30600-233-Wege-Sperre mit großer Bohrung, Absperrhähne, 10/Packung, Unsteriler
PassstiftMcMaster-Carr90145A31718-8 Edelstahl-Passstifte (1/32" Durchmesser x 1/2" Lg.)
Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger BindungCorningCL S32060,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss mit niedriger Bindung

Referenzen

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