Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Neuronaler Aktivität bei Säugetieren wird vom Netzwerk Schwingungen, koordiniert die Informationsübertragung innerhalb und zwischen Gehirn Regionen^1,2,3,4zu unterstützen. Gehirn Rhythmen sind Schwingungen von sehr langsam (< 0,8 Hz) bis zu ultraschnellen (> 200 Hz) Frequenzen. Ein großer Körper des Beweises unterstützt Beteiligung der Netzwerk-Schwingungen in unterschiedlichen Gehirnfunktionen, einschließlich Kognition^5,6,7,8,9,10 , angeborene Verhaltensweisen^11,12 , sowie neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Parkinson und Epilepsie^13,14,15. Selektive und zeitlich präzise Methoden zur experimentellen Manipulation Netzwerk Schwingungen sind daher unabdingbar für die Entwicklung der physiologisch plausible Modelle der Synchronisation und für die kausale Verbindung mit Verhalten.

Netzwerksynchronisation wird durch vielfältige biologische Substrate und Prozesse, Molekulare Identität von Ionenkanälen und deren Kinetik bis hin zu Neuromodulation der Erregbarkeit und Netzwerkkonnektivität vermittelt. Die biologische Gestaltung der Rhythmus, die Generatoren, die¹⁶ offenbart worden ist für viele Gehirn Rhythmen, unterschiedliche Aspekte von denen (z.B.Frequenz, Amplitude) oft sind herbeigeführt durch Dynamik der unterschiedlichen Zelltypen und Netzwerke. Zum Beispiel sind hemmende Interneurone, die gezielt die Somata der wichtigsten Zellen die wichtigsten Akteure in Frequenzbänder und Gehirn Regionen^17,18, einschließlich Theta^19,20, Gamma^{20 , 21}und²² Schwingungen Welligkeit (140 – 200 Hz). Im Gegenzug wird Phase Synchronisation von weit entfernten Zellen durch robuste feedforward Signalisierung von Pyramidenzellen, die den Abschuss von Interneuronen zurückgesetzt gewährleistet. Ein entscheidender Parameter der Schwingungen, die synchronisierte neuronale Bevölkerungszahl ist eng verwandt mit der gemessenen LFP Oszillation Amplitude und mindestens für schnelle Schwingungen hängt der exzitatorischen befahren Interneuronen². Im Gegensatz dazu langsamere Schwingungen, wie Delta und Theta Rhythmen entstehen durch weiträumige reentrant Loops, gebildet von Cortico-thalamische^23,24 und hippocampal Medial septal Projektionen^{25, 26,27}, beziehungsweise. Schwingungen in solche Schaltungen sind durch Wechselwirkungen zwischen Ausbreitung signalverzögerungen, erregbar Antworten und ihre Häufigkeit Vorliebe in teilnehmenden Zellen^28,29,30, herbeigeführt ^{31 , 32}. hemmende Projektionen von Gabaergen Parvalbumin (PV)-positiven Zellen der medialen Nasenscheidewand (MS) zu Interneuronen in den Hippocampus^25,33, Parahippocampal Regionen und entorhinalen Kortex²⁶ wesentlich für die Erzeugung von Theta-Schwingungen in den medialen Temporallappen. So können physiologische Mechanismen der Netzwerk-Schwingungen und neuronale Synchronisation mit optogenetik mit einer Echtzeit-Präzision manipuliert werden.

Zelle typspezifischen optogenetische Manipulationen wurden bei Untersuchungen der Hippokampus und kortikalen Schwingungen in-vitro-^{34,35,36,37,38} und angewendet in-vivo^{30,39,40,41,42,43,44,45}, einschließlich funktioneller Untersuchungen von Gamma^{5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52} und welligkeit Schwingungen^40,53,54 und Schlaf Spindeln^55,56. Vor kurzem haben wir einen Cre-abhängige ChR2-Virus in den Mitgliedstaaten eine Schlüsselregion für die Generation des Hippokampus Theta-Rhythmus von PV-Cre-Mäusen. Mit Hilfe dieses Präparat, waren optogenetische Stimulation der hemmende Projektionen der MS in der Hippocampus-¹¹Funktionen der hippocampalen Theta Schwingungen (Häufigkeit und zeitliche Stabilität) gesteuert. Darüber hinaus evoziert Theta-Frequenz optogenetische Stimulation der hemmenden Septo-hippocampal Projektionen Theta-Rhythmus während wach Immobilität. Die Optogenetically mitgerissen Theta-Rhythmus angezeigt Eigenschaften des spontanen Theta Schwingungen in der Maus bei LFP und neuronale Aktivität.

Wichtige Merkmale dieses Protokolls sind: (1) Nutzung von einem hemmenden Weg, das physiologisch wichtig für spontane Theta Schwingungen ist unter Vermeidung unspezifische Effekte auf hippocampal Erregbarkeit; (2) axonalen, d. h., Projektion-spezifische Stimulation, einen direkten Einfluss auf nicht-hippocampal MS Efferents; zu minimieren (3) lokale Theta-rhythmische Lichtstimulation, gewährleistet einen minimalen direkten Eingriff in Theta-rhythmische Septo-hippocampal Dynamik und einer globalen bilateralen Entrainment Theta Schwingungen; (4) parametrische Kontrolle der Theta-Schwingungen-Häufigkeit und Regelmäßigkeit; und (5) Quantifizierung der Entrainment Treue mit hoher zeitlicher Auflösung mit LFP um quantitative Kausalität Analyse im Verhalten der Tiere zu ermöglichen. Da dieses Präparat im Wesentlichen auf eine bekannte Rolle der Septo-hippocampal Enthemmung in Theta Generation^25,30nutzt, ermöglicht es robuste Kontrolle über verschiedene Parameter der Theta-Schwingungen im Verhalten Mäuse. Wo andere weniger untersuchten Signalwege und Zelltypen der Septo-hippocampal Schaltung wurden Studien manipuliert^{38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} offenbaren weitere Mechanismen des Theta-Rhythmus.

PV-Cre Knock-in männlichen Mäusen⁵⁹, 10-25 Wochen alt, wurden verwendet. Mäusen waren unter normalen Bedingungen in der Tierstation untergebracht und auf einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt und wurden von den örtlichen Gesundheitsbehörden (Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt Und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen) genehmigt.

1. virale Injektion

1. Folgen Sie während des gesamten Verfahrens biologische Sicherheit Richtlinien⁶⁰. Tragen Sie einen Laborkittel, einen Mundschutz, ein Haarnetz und zwei Paar Handschuhe.
2. Schlauch mit einem sterilen Skalpell oder einer Schere ca. 1 m Länge schneiden, legen Sie es in der Spritze Halter Block der Pumpe und befestigen.
   1. Füllen Sie den Schlauch komplett mit Silikonöl mit der Spritze.
   2. Überprüfen Sie, ob Luftblasen im Schlauch erscheinen. Wenn Luftblasen beobachtet werden, füllen Sie den Schlauch wieder mit Öl.
   3. Den Kolben, um die druckblock zu beheben.
   4. Langsam vorwärts den Schieber in Richtung der Spritze Halter Block, bis die Spitze des Kolbens den Schlauch berührt.
   5. Führen Sie die Spitze des Kolbens in den Schlauch und bewegen Sie automatisch den Schieber Block nach vorne mit einer langsamen Geschwindigkeit durch die Auswahl "Infuse" in das Befehlsfenster und eine niedrige Infusionsrate (z.B. 500 nL/min), bis die Spritze-Halter-Block erreicht.
3. Bereiten Sie die Injektionsnadel (34G).
   1. Entfernen Sie die Nadel-Hub mit einem klaren Schnitt mit einer Präzision Bohrer/Schleifmaschine mit einer Trennscheibe verbunden. Falls erforderlich, verwenden Sie eine Nadel, um Metallrückstände aus frisch geschnittenen Oberfläche zu entfernen.
   2. Kapillare Schläuche (ca. 3-4 cm Länge) durch die Nadel einfädeln.
   3. Kleben Sie die Nadel auf das Rohr mit Superkleber.
   4. Verbinden Sie die Injektionsnadel bis zum Ende der Schläuche, die mit der Microsyringe-Pumpe verbindet.
4. Legen Sie die Nadel auf der stereotaktischen Inhaber.
5. Ziehen Sie Luft, bis eine Luftblase in den transparenten Schlauch über die Nadel sichtbar ist.
6. Die Maus mit 1,5-3 % Isofluran in Sauerstoff zu betäuben. Warten Sie ca. 2 – 3 min., dann bestätigen Sie, dass die Maus vollständig betäubt ist, durch die Bewertung ihrer Antwort auf eine Zehe Prise. Während der Operation überwachen Sie des Tieres atmen und passen Sie Isofluran Konzentration bei Bedarf an.
7. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Stereotaktische Rahmen mit nicht-traumatische Ohr Haltern.
8. Schützen Sie die Augen der Maus mit einem Lipid-Gel.
9. Injizieren Sie 0,1 mL Lidocain mikrodialysemembranen unter der Kopfhaut mit einer 0,01-1 mL Spritze und ein 26G Injektionskanüle.
10. Rasieren Sie und Desinfizieren Sie die Maus-Kopf mit Ethanol-Lösung. Dann abwechselnd dreimal 2 % Chlorhexidin mit Ethanol der Operationsstelle zu desinfizieren.
11. Führen Sie einen Mittellinie Schnitt mit feinen und scharfen Schere zwischen der Rückseite der Ohren auf das Niveau der Augen gehen, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind.
12. Den Schädel durch die Anwendung ca. 50 µL NaCl mit einer Spritze reinigen und Trocknen mit einem Papiertaschentuch und ein Luftstoß.
13. Positionieren Sie den Maus-Kopf die dorsal-Ventral-Ebene der Nase Klammer so angepasst, dass die Bregma und Lambda auf Augenhöhe dorsal-Ventral sind (± 0,3 mm).
14. Bohren Sie ein Loch oben MS (AP 0,98 und L 0,5 mm in Bezug auf die Bregma).
15. An dieser Stelle tauen Sie ein Aliquot des Virus (sollte mindestens 2 µL des AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40enthalten) für ca. 5 min bei Raumtemperatur (RT auf).
16. Zentrifugieren Sie die aliquoten bei etwa 4.000 x g bei RT für 1 min.
17. Pipette 2 µL des Virus auf ein Stück Parafilm; Verwenden Sie die zuvor geschützte Seite.
18. Die Spitze der Spritze in die Flüssigkeit eintauchen und sorgfältig mit etwa 500 nL/min unter Beachtung der Flüssigkeitsspiegel zurückziehen. Um zu verhindern, Luft absaugen, Rückzug zu stoppen, bevor das Virus vollständig aufgenommen wird. Die zurückziehen-Rate nach der Lösungsviskosität anpassen; schneller kann Abzug eines Virus mit höherer Viskosität erleichtern.
19. Reinigen Sie die Nadel mit einem Papiertaschentuch.
20. Überprüfen Sie, dass das Virus sich in der Röhre befindet und der Virus und Öl durch eine Luftblase getrennt sind. Markieren Sie die Ebene des Virus auf das Rohr, um Steuern, ob Virus erfolgreich während der Injektion durchdrungen ist.
21. Positionieren Sie die Nadel über die Kraniotomie und einfügen Sie langsam in das Gehirn bei der ersten Injektion (AP 0.98, L 0,5 V-5.2, 5,5 ° Lateral).
22. Injizieren von 450 nL des Virus mit einer Rate von 100-150 nL/min Wartezeit für 10 min. vorsichtig bewegen die Nadel bis 0,1 mm und weitere 5 Minuten warten.
    1. Bewegen Sie die Nadel auf den zweiten Punkt der Injektion (AP 0.98, L 0,5 V-4.6) und injizieren ein weiteres 450 nL bei 100-150 nL/min.
    2. Vor dem Umzug der Nadel bis 0,1 mm. warten weitere 5 min vor dem Entfernen der Nadelöhrs wieder für 10 min warten.
23. Naht der Schnitt mit Seide geflochten schwarz Naht mit Quadrat Knoten. Wärmen Sie das Tier mit einer roten Lampe, um die Erholung zu beschleunigen. Verwaltung von Antibiotika (0,3 mL Erycinum (1:4 in sterilen NaCl)) und Carprofen i.p täglich ca. 2-3 Tage nach der Operation.
24. Schneiden Sie das Rohr über die Marke, die das Niveau des Virus angegeben. Das Rohr kann für weitere Injektionen verwendet werden. Bereiten Sie eine frische Injektionsnadel vor jeder Injektion.
    Hinweis: Diese Operation dauert ca. 1-1,5 h. Das Tier wacht in der Regel innerhalb von 5 min nach der Operation. Warten Sie mindestens 6 Wochen für ausreichende axonalen Ausdruck Zeit aber nicht länger als 5 Monate vor der Durchführung Stereotaktische Implantationen als Ausdruck Ebenen beginnen um ca. 6 Monate nach der Injektion des Virus zu verringern.

2. Vorbereitung des optischen Fasern (Abbildung 1A)

1. Verwenden Sie multimode-Glasfaser (105 µm Core, Glas verkleidet mit Kieselsäure Kern, 0,22 NA). Streifen 125 µm Verkleidung des faserkerns mit Mikro-Stripperin, während die Faser noch die Faser Spule beigefügt ist.
2. Schneiden Sie die Faser auf eine Länge von ca. 2-3 cm mit einem Diamant-Messer.
3. Legen Sie die Faser in ein Zirkonia Keramik Stick zwinge (ID: 126 µm). Ca. 0,5-1 mm von der optischen Faser sollte ragen aus der konvexen Seite der zwinge.
4. Gelten Sie mit Hilfe einer Nadel, einen Tropfen Epoxy-Kleber für beide Enden der zwinge aber nicht auf den Seiten der zwinge. Alternativ können Sie Superkleber.
5. Lassen Sie den Kleber für mindestens 30 Minuten trocknen lassen.
6. Polieren Sie die konvexe Seite der zwinge mit Diamant Läppen Polieren Film (3 µm Körnungen) Faser.
7. Testen Sie die Treue der leichte Übertragung mittels eine optische Leistungsmesser.
   1. Legen Sie die Wellenlänge auf das Powermeter auf der gleichen Wellenlänge wie der Laser verwendet wird.
   2. Positionieren Sie die Patch-Kabel mit der Spitze mit Blick auf die Mitte des Sensors. Schalten Sie den Laser und gelesen Sie die Lichtleistung von den Leistungsmesser. Notieren Sie den Wert.
   3. Verbinden Sie die Glasfaser Patchkabel über eine Paarung Hülse und positionieren Sie es mit der Spitze der Faser mit Blick auf die Mitte des Sensors. Schalten Sie den Laser und gelesen Sie die Lichtleistung von den Leistungsmesser. Notieren Sie den Wert.
   4. Berechnen Sie die Übertragungsrate: Teilen Sie den zweiten Wert durch den ersten Wert. Wenn die Übertragungsrate unter 0,5 liegt, die Faser zu verwerfen, sonst für die Implantation verwenden.
   5. Testen Sie die Übertragungsrate für jede Faser vor der Implantation.
   6. Für spätere Experimente, passen Sie die Lichtintensität Ausgabe des Lasers auf die Übertragungsrate der optischen Faser: 5-15 geteilt durch die Übertragungsrate zu eine endgültigen Lichtleistung der Faserspitze von 5-15 mW erreichen die Lichtleistung von der Patchkabel Spitze gesetzt.
      Hinweis: Siehe auch Nr. ⁶¹ für die Herstellung von optischen Fasern.

3. Vorbereitung der Wolframdraht Arrays für LFP Aufnahmen (Abbildung 1 b)

1. Kleben Sie mehrere (z. B. 6) 100 µm Kieselsäure Rohr Führungen parallel zu der Klebeseite ein Stück Klebeband. Schneiden Sie ein Stück, ca. 4-6 mm, für ein Wire Array Versammlung.
2. Fädeln Sie Formvar isoliert 45 µm wolframdrähte durch die Führungsröhrchen mit Pinzette.
3. Streifen 6 Emaille-isolierte feine Kupfer Verklebung Drähte (ca. 5 mm lang) und eine Masseverbindung (ca. 2-3 cm lang) mit einem Skalpell entfernt die Isolierung an beiden Enden zu kratzen. Mit den Nanoconnector-Pins zu löten.
4. Ein wolframdraht mit einem Tropfen leitfähigen Silberfarbe, bzw. herstellen Sie jede Bonddraht. Lassen Sie für mindestens 30 Minuten trocknen.
5. Gilt einen Mindestbetrag von Zement um die Drähte zu decken. Gelten Sie nicht Zement auf die wolframdrähte, die in das Hirngewebe oder auf den oberen Teil der Nanoconnector eingefügt werden. Lassen Sie den Zement trocken für mindestens 30 Minuten.
6. Führen Sie einen eckigen Schnitt (5-20°) von der wolframdrähte mit stumpfen Edelstahl-Schere ermöglichen zuverlässige Implantation von Drähten unter oder oberhalb der Zone ventral angrenzend an das Stratum Pyramidale, wo Theta Amplitude zu niedrig für die Schätzung der ist dem Entrainment Treue.
7. Deinsulate die Spitze (ca. 2 mm) an den Schutzleiter mit einem Skalpell entfernt die Isolierung zu kratzen. Behandeln Sie es mit Flussmittel und Presolder.
8. Überprüfung möglicher Kreuz-Gespräche zwischen Elektroden, die mit einem digitalen multimeter. Dazu schließen Sie die Steckerstifte an das Multimeter, die in den Messmodus Widerstand eingestellt werden muss. Paarweise Kombinationen von Kanälen zu überprüfen; eine Lesung auf das Multimeter unter 5 MΩ zeigt deutliche Übersprechen.
9. Überprüfen Sie die Impedanz jeder Draht-Elektrode in Kochsalzlösung mit einer Impedanz-Messgerät. Typische Impedanzwerte liegen unter 100 kΩ.
10. Zur Erleichterung der Einnistung kleben Sie eine Glasfaser in der Draht-Array, so dass die Spitze der Faser auf der Ebene der kürzeste Draht ist und der Faserspitze ist in unmittelbarer Nähe, aber nicht berühren die wolframdrähte. Halten Sie den Winkel der Faser so klein wie möglich, um Gewebeschäden bei der Implantation zu verhindern.
    Hinweis: Siehe auch Ref. ⁶² für die Herstellung von Wolfram-Draht-Arrays.

4. stereotaktischen Implantationen

1. Führen Sie Vorbereitungen wie 1,6-1.13 beschrieben.
2. Das Bindegewebe von der Oberseite des Schädels entfernen und drücken nach unten Nackenmuskulatur gründlich von ca. 2 mm zu Muskel Artefakte während der Aufnahme zu vermeiden.
3. Reinigen Sie den Schädel mit einem Wattetupfer Applikator und Kochsalzlösung und Bohrungen Sie 4 (2 vorne und 2) über das Kleinhirn, 0,8 mm Durchmesser Edelstahl-Knochenschrauben (00-96 x 1/16) für Boden und Stabilisierung des Implantats (Abb. 1) platzieren. Positionieren Sie die Erdungsschraube, verbunden mit einem Kupferdraht (ca. 2-3 cm Länge) über das Kleinhirn.
4. Decken Sie die Masseschraube vollständig mit Zement zu Muskel Artefakte bei den elektrophysiologischen Aufnahmen zu vermeiden. Bauen Sie einen Zement-Ring alle Verbindungsschrauben (Abbildung 1E).
5. Führen Sie eine Kraniotomie oberhalb der Implantation Seite (Hippocampus, AP-1.94, L 1,4 V 1.4 in Bezug auf die Bregma). Ca. 5 µL steriler NaCl auf die Oberfläche des Hirngewebes auftragen.
6. Senken Sie langsam die Draht-Array mit Stereotaxis in die Kraniotomie. Für einheitliche Aufnahmen Implantat eine Silikon-Sonde anstelle einer Draht-Array-⁶³; um Handwerkstechnik leichte Artefakte zu vermeiden, Implantat-Glasfaser separat im Hippocampus mit der Faserspitze nicht direkt vor der Sonde (Abbildung 1 -ich). Für die Untersuchung der Koordinierung der Mitnahme zwischen Hemisphären Implantat eine zusätzliche Glasfaser im kontralateralen hippocampalen CA1 Bereich.
7. Gelten Sie etwa 5 µL des warmen flüssigen Wachs/Paraffin-Öl, mit einer Spritze über den Implantationsort Hirngewebe schützen bei 70 ° C vorgewärmt.
8. Zement um das Draht-Array anwenden und den Schädel mit Zement zu decken.
9. Ein Tropfen des Flusses auf die vorgelötet Bezugsmasse/Draht und der presoldered angeschlossen an die Erdungsschraube, beispielsweise mit Hilfe einer Nadel anwenden und die Drähte mit einem Lötanlage verschmelzen.
10. Decken Sie das gesamte Massekabel mit Zement.
11. Verwalten von 0,3 mL Erycinum (1:4 in sterilen NaCl) und Carprofen (5mg/mL) i.p nach der Operation und für mindestens die zwei Tage nach. Die Maus wacht in der Regel innerhalb von 15 Minuten nach der Operation. Wärmen Sie das Tier mit einer roten Lampe, um Erholung zu beschleunigen.
12. Überwachen Sie das Gewicht der Maus täglich für die erste Woche nach der Operation oder bis das Gewicht stabil ist. Gewichtsabnahme sollte 10 % der Maus Gewicht aufgenommen vor der Operation nicht überschreiten. Zur Stabilisierung des Gewichts zu beschleunigen, liefern Sie die Maus mit Nassfutter und Kondensmilch in den ersten Tagen nach der Operation.
13. Zum Aufzeichnen von hippocampal Zellaktivität während Entrainment Implantat eine Silikon-Sonde im Hippocampus (AP-1.94, 1.4 L, V 1, mit anschließenden absenken) wie unter Nr. ⁶² (Abbildung 1 -ich). Implantat-Glasfaser im Hippocampus bei AP-3 L 1,4 V 1.6, 39 ° kaudalen rostral. Implantat eine zusätzliche Glasfaser in MS (AP +0.98, L 1 V 3.9, 15° seitlich) Wenn Stimulation der Zelle Somata gewünscht wird.

5. Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Datenerfassung

1. Gewöhnen Sie die Maus, um die Aufnahme-Setup(z. B.15 Minuten Sitzungen, 1-2 Sitzungen pro Tag für 3 Tage). Untersuchen Sie das Tier Verhalten, bevor Sie mit den ersten Experimenten. Wenn sich die Maus in der Kammer bewegt Erkundung der Umgebung, schnüffeln, Rearings, etc.die Durchführung, beginnen Sie die erste experimentellen Sitzung.
2. Platzieren Sie den Mauszeiger in einer vertrauten Kammer in Ermangelung anderer Tiere im selben Raum.
3. Legen Sie eine LED auf der Leiter-Bühne mit Klebeband um die Position des Tieres zu verfolgen. Stellen Sie sicher, dass das LED-Licht von der Kamera über den gesamten Zeitraum erfasst werden, dass das Tier die Aufnahme Kammer erforschen ist, vor Beginn der Experimente. Nehmen Sie auf, in der Dunkelheit um das LED-Licht zu verfolgen. Positionieren Sie eine Kamera, über die Aufnahme-Kammer.
4. Überprüfen Sie die Lichtleistung von Patch-Kabel. Schätzen Sie die Lichtleistung der Faserspitze nach Verbindung je nach Übertragungsrate der Faser implantiert. Sicherstellen Sie, dass die Lichtleistung von der Spitze der Faser zwischen 5-15 mW, um zuverlässige Mitnahme zu ermöglichen.
5. Der Headstage-Vorverstärker an die chronisch implantierten Stecker anschließen. LWL-Patchkabel an die chronisch implantierten hippocampal Faser für optogenetische Stimulation Experimente anschließen. Lichtstimulation Experimente verbinden Sie die Glasfaser an einem dummy zwinge an die Kopfhörer angeschlossen.
6. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Aufnahme-Kammer.
7. Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Impuls-Generators um die Stimulation Protokoll zu generieren.
8. Wählen Sie den Kanal, der die 473 nm DPSS Laser kontrolliert. In der ersten Zeile geben Sie 3.000 mV (1. Spalte), mal 30 ms (2. Spalte), Wert 0 mV (3. Spalte), 112 ms Zeit (4. Spalte), Zeile wiederholen 840 und Gruppe wiederholen Sie 1, um ein Protokoll für 2 min 7 Hz Stimulation mit 30 ms lange Impulse zu generieren. Passen Sie die Zeitdauer in der 4. Spalte und Anzahl der Wiederholungen der Zeile, wenn die Stimulation auf einer anderen Frequenz oder eine andere Dauer erforderlich ist. In der zweiten Zeile wählen Sie 0 mW (1. Spalte), mal 500 h (2. Spalte), Zeile wiederholen 1 und Gruppe wiederholen Sie 1, um sicherzustellen, dass der Laser abgeschaltet ist nach der Stimulation Protokoll beendet wird.
9. Klicken Sie auf "Datei > Speichern unter" und speichern Sie die Datei mit dem gewünschten Namen.
10. Versichern, dass der Stimulator TTL-Ausgang auslösen des Lasers in den digitalen Lynx analoge Eingabe Vorstand, den Erwerb von elektrophysiologischen synchronisieren verbunden ist und optogenetische Daten.
11. Alternativ, um die Variabilität der Theta Schwingungsfrequenz parametrisch zu regulieren, gelten Sie Züge der Lichtimpulse in unterschiedlichen Inter Puls Intervalle mit Perioden nach eine Gauß-Verteilung. Die Dispersion der Inter Puls Intervalle für verschiedene Protokolle, z. B.aus Schritt 3.2, 15.1 ms²zu ändern. Gelten Sie diese Protokolle um Theta Epochen mit unterschiedlichen Variabilität der Theta-Frequenz (Abbildung 6) zu generieren.
12. Öffnen Sie die Software von der Recording-System. Klicken Sie auf "ACQ" erwerben und "REC" aufzunehmen. Warten Sie vor der Einleitung von Lichtstimulation die Grundlinie Verhalten (z.B., 2 min zum Abrufen von Baseline Geschwindigkeit oder 30 min an der Grundlinie Ort Felder extrahieren) aufzeichnen.
13. Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Impuls-Generators. Klicken Sie auf "Datei > Öffnen" und wählen Sie die Protokolldatei der Wahl. Klicken Sie auf "Herunterladen und starten" um die Lichtstimulation zu initiieren.
    Hinweis: Das Experiment kann begutachtet und die Stimulation über Fernbedienung gestartet; Dies schließt den Einfluss der Anwesenheit von der Experimentator auf das Tier Verhalten. Je nach Ziel der Studie kann Stimulation initiiert und beendet während bestimmte Verhaltensweisen.

6. ein kombinierter Ansatz für Optogenetische Entrainment und Projektion-spezifischen Hemmung der Hippocampal Ausgang

1. Drücken Sie ChR2 in MS GABAergic Zellen des PV-Cre Mäuse, aus, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
2. Darüber hinaus Spritzen Sie insgesamt 2,4 µL CamKIIα abhängigen Halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) in beiden dorsalen hippocampalen Hemisphären (AP -1,7; L ± 1,05; V-2.05 und -1,4 mm; AP -1,7; L ± 1,7; V-2.05 und -1,55 mm; AP -2,3; L ± 1,5; V-2.2 und -1,3 mm; AP -2,3; L ± 2,2; V-1.65 und -2,45 mm).
3. 6 Wochen hinweg Ausdruck zu ermöglichen.
4. Implantat-eine Wolfram-Draht-Array mit Glasfaser in der hippocampalen CA1-Region, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Darüber hinaus Implantat bilateral optische Fasern in das laterale Septum (LS, AP 0,1, L 0,25 V-2,250 mm und AP 0.5, L -0,3, V-2,70 mm).
5. Durchführen Sie optogenetische Theta Entrainment Experimente wie 5.4 5.5 beschrieben.
   1. Für die gleichzeitige Hemmung der hippocampalen Ausgabe auf der LS, erzeugen eine Protokoll-Reiz-Generation: z.B., Trigger das Auftreten von den Ausgabekanal verbunden, 593 nm DPSS Laser 15 s mit einem kontinuierlichen Impuls nachhaltig in insgesamt 45 s vor Auslösung die Impulse-Ausgabe, 473 nm DPSS Laser.
   2. Schließen Sie beide Fasern im LS per Patchkabel mit ein multimode-Faser optische Koppler, 593 nm DPSS Laser.
   3. Starten Sie die Aufzeichnung herunterladen Sie und lösen Sie das Protokoll zur Steuerung der Impulse-Generation aus.

7. Datenverarbeitung

1. Wandeln Sie die elektrophysiologische Signale und positionieren Sie die Tracking-Daten mit neurophysiologischen Daten (ND)-Manager, um DAT und haben.POS Formate, bzw.⁶⁴.
2. Erhalten Sie die LFP durch Tiefpass-Filterung und Down-Probenahme von Breitband-Signal auf 1.250 Hz mit ND Manager⁶⁶.
3. Wählen Sie in jeder Aufnahme den Kanal mit der maximalen Amplitude von Theta Schwingungen (mit Neuroscope)¹⁹.
4. Erkennen Sie die Zeitstempel der Laserpulse und der Stimulation Epochen mit einer Schwelle Erkennung Algorithmus (mit MATLAB-Funktion findpeaks.m o.ä.)¹¹.
5. Um die DAT-Datei in eine multi-Channel-Daten-Analyse-Software zu importieren, klicken Sie auf "Datei > Importieren", wählen Sie "binäre-Dateien" als Datentyp und die DAT-Datei. Geben Sie im Konfigurationsdialog die richtige Anzahl von Kanälen und einer Abtastrate von 1.250 Hz, klicken Sie auf "ok" und speichern Sie als .smr Datei. Plotten Sie Leistungsspektren, wählen Sie "Analyse > neue Ergebnis Ansicht > PowerSpectrum". In den Einstellungen wählen Sie den Kanal mit der höchsten Theta-Amplitude und 16.384 FFT-Größe, klicken Sie auf "Neu", definiert als "Startzeit" Beginn der Stimulation Epoche und als "Endzeit" Ende der Stimulation Epoche, und klicken Sie auf "Prozess".
6. Berechnen Sie die Mitnahme Treue als das Verhältnis der kumulierten spektrale Leistungsdichte (PSD) innerhalb des Frequenzbereichs optogenetische Stimulation (Stimulation Frequenz ± 0,5 Hz), die kumulative PSD im Theta (5-12 Hz) Band mit der multitaper-Methode (NW = 3, Fenstergröße 8.192) für 10 s Epochen (z.B., Toolkit < Http://chronux.org/>).
7. Ausschließen, Aufnahme Epochen wo der dominanten PSD-Gipfel ≤ ist 5 Hz aus der Analyse (nicht-Theta Epochen, mit MATLAB-Funktion find.m).
8. Zeichnen Sie das Raster der LFP Leistungsspektren für alle aufgezeichneten Epochen entsprechend der berechneten Entrainment Treue (mit MATLAB Funktionen sortrows.m und pcolor.m). Laden Sie die Leistungsspektren und Mitnahme Treue durch Klicken auf "Datei > Öffnen" gespeicherten Variablen Zoll Typ Leistung = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:End)).

Ausrichtung der ChR2 Gabaergen Zellen in den Mitgliedstaaten wie in Abschnitt 1 beschrieben ist in Abbildung 2Adargestellt. Optogenetische Stimulation der Axone der MS GABAergic Zellen im dorsalen Hippocampus über eine optische Faser und oberhalb der CA1-Region implantiert koppelt Theta Schwingungen mit der Frequenz des Reizes in der ipsilateralen (Abb. 2 b) sowie kontralateralen Hemisphäre (Abbildung 2). Theta-Schwingungen konnte mehr oder weniger effizient durch die optogenetische Stimulation (Abbildung 3A), mitgerissen werden, die Wirksamkeit von denen für jede Aufnahme Epoche als eine relative Theta LFP macht um die stimulationsfrequenz d.h.berechnet wurde, Entrainment Treue (Abb. 3 b). Entrainment Treue über 0,3, d. h.höher als in den spontanen anspringen-Aufnahmen wurde in ca. 80 % der Aufnahme Epochen beobachtet. Optostimulation bei-Theta Frequenzen war weniger wirksam (Abbildung 3).

Explizite d.h., parametrische Manipulation der Theta-Schwingungen, die Frequenz wird von emergent Änderungen der Theta Regelmäßigkeit begleitet: die zeitliche Regelmäßigkeit der Amplitude und Frequenz der Theta-Schwingungen wurde erhöht, während Epochen mit hoher Entrainment Treue. Die Stabilität der Schwingungen kann auch parametrisch geregelt werden, durch die Anwendung von Zügen der Lichtimpulse, die Perioden der Gaußsche Verteilungen mit verschiedenen Dispersionen (Abbildung 4) folgen.

Optogenetische Kontrolle über die Frequenz der Schwingungen eliminiert die Korrelation zwischen Theta Frequenz und Laufgeschwindigkeit, im Einvernehmen mit dem Frequency-Regler über die MS durch aufsteigende afferenzen während der Bewegung (Abbildung 5A). Optostimulation induzierte Theta-Schwingungen auch bei Immobilität (Abb. 5 b). Die bevorzugte feuern Phasen aufgezeichnet im Bereich CA1 im vermeintlichen Pyramidenzellen und Interneurone blieben unverändert im Vergleich zu den Optogenetically mitgerissen Theta Schwingungen im Vergleich zu spontanen Theta (Abbildung 6).

Den Beitrag des Hippocampus zu den seitlichen Septum Weg in Theta-vermittelte Regulation der Fortbewegung, studieren wir Optogenetically diesem Stoffwechselweg gehemmt. Halorhodopsin (eNpHR3.0) äußerte bilateral hippocampalen Pyramidenzellen (Abb. 7A), während ChR2 sich in MS GABAergic Zellen als oben drückte und Theta Schwingungen Optogenetically mitgerissen (Abb. 7 b waren). Die Theta-Entrainment reduziert Variabilität der laufenden Geschwindigkeit aber nicht wann der Hippocampus zu den LS Weg gehemmt wurde (Abbildung 7).

Abbildung 1: Darstellung der Lichtwellenleiter, Elektroden und Chirurgie. (A) Abbildung einer optischen Faser. (B) Darstellung der eine Draht-Array auf eine Glasfaser für die Aufnahme des Hippokampus LFP bei Mitnahme der hippocampalen Theta Schwingungen geklebt. (C) für die Aufnahme der hippocampalen zelluläre Aktivität, eine Silikon-Sonde auf einem Microdrive montiert ist. (D) Miniatur Schrauben befinden sich auf den Schädel. Leitungen aus Kupfer sind auf den Boden und Referenz Schraube vorgelötet, bevor sie über das Kleinhirn Positionierung. (E) Zement wird angewendet, um zu decken und die Schrauben zu verbinden. Der oberen blaue Kreis zeigt an, wo die Kraniotomie für die Implantation der Silikon-Sonde durchgeführt wurde. Unteren blauen Kreis zeigt an, wo die Kraniotomie für die Implantation der Glasfaser im Hippocampus durchgeführt wurde. (F) eine Glasfaser ist in einem kaudalen rostral Winkel zum Ziel der hippocampalen CA1-Region implantiert. Eine zweite Faser kann in das mediale Septum implantiert werden, wenn Stimulation der Zelle Somata (optional) gewünscht wird. (G) die Silikon-Sonde wird abgesenkt, bis knapp über der hippocampalen CA1-Region. (H) die Grenzen des Microdrive und Stecker werden auf das Implantat und Boden zementiert und die Referenz-Kabel gelötet. (ich) Kupfer Netz ist konstruiert, um das Implantat umgibt und dienen als ein faradayscher Käfig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Vorbereitung auf optogenetische hippocampal Theta Entrainment. (A) ChR2 drückte sich in+ mediale septal Fotovoltaikzellen in PV-Cre Mäuse (obere Schema). Helle Fluoreszenz in MS (1, 2) bestätigt erfolgreiche Konstrukt Ausdruck in Somata. MS-Fasern projizieren über Fornix (f) und fimbrientrichter (Fi), Hippocampus (3-6); ACA: vordere Kommissur; vorderen Teil. HDB: Kern des horizontalen Gliedes der diagonalen Band; Oder: Stratum Oriens. Glasfaser für optogenetische Stimulation mit blauem Licht wird über die pyramidale Schicht der hippocampal Region CA1 (untere Scheme) implantiert. Skalieren Sie Bars: 500 µm (Bilder 1, 3, 4) und 50 µm (Bilder 2, 5, 6). (B) Hippocampal LFP während der spontanen Theta-Schwingungen (links) und 7 Hz (Mitte) oder 10 Hz (rechts) optogenetische Entrainment. Blaue Streifen zeigen die Zeitfenster der Lichtanwendung. Beachten Sie die Phase zurücksetzen, indem der Lichtpuls durch einen Pfeil angezeigt. Beachten Sie Gamma Umschläge bei spontanen und mitgerissene Theta, ein Indikator für die physiologische Theta-Rhythmus. Stornierung zwischen Stratum Oriens Phase (str. oder.) und Stratum Radiatum (rad. str.) bleibt auch bei Mitnahme. (C) Mitnahme ist zuverlässig während ipsilateral (obere Grundstücke) sowie kontralateralen (untere Grundstücke) optogenetische Stimulation. Systeme zeigen Positionen der Fasern in Bezug auf Elektroden Positionen. Beispiel-LFP-Spuren bei Theta und Anwendung der Lichtimpulse werden in der Mitte angezeigt. Schalten Sie auf der rechten Seite Spektren der hippocampalen LFP während Ipsi und kontralaterale Stimulation farbcodiert nach stimulationsfrequenz. Diese Zahl wurde vom Ref. 11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Treue optogenetische hippocampal Theta Entrainment. (A) Beispiel hippocampal LFP Spuren bei niedrigen und hohen Entrainment Treue. (B) Energie spektrale Dichte von 10 s Epochen während spontane Theta mit Reihen geordnet nach führenden Theta-Frequenz (links), und 7 Hz (Mitte) und 10 Hz (rechts) optogenetische Stimulation mit Reihen geordnet nach Entrainment Treue. Jeweiligen Beispiel Leistungsspektren (durch einen Pfeil gekennzeichnet) sind oben dargestellt. Beachten Sie zuverlässige Entrainment Treue über Epochen hinweg. Auf der rechten Seite zeigt die kumulative Wahrscheinlichkeit der Treue Entrainment Theta Frequenzen. (C) Entrainment erfordert Theta rhythmischen Stimulation. Hippocampal Netzwerkaktivität kann erfolgreich mit Frequenzen zwischen 6 und 12 Hz mitgerissen werden. Bei niedrigeren Frequenzen (z.B.2 oder 4 Hz) oder höhere Frequenzen (z.B. 20 Hz) Mitnahme ist nicht zuverlässig. Diese Zahl wurde vom Ref. 11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: parametrische Manipulation von Theta Schwingungen Regelmäßigkeit. (A) Stimulation bei unterschiedlichen Frequenzen im Theta-Bereich mit einer durchschnittlichen Frequenz von 7,8 Hz eine Gauß-Verteilung nach angewendet wurde. Die Standardabweichung der Intervalle zwischen Puls stieg über Protokolle von σ = 3.19, σ = 15.09. Insgesamt wurden 11 Protokolle erzeugt und angewandt, jeweils mit einer Gesamtdauer von der Stimulation Epoche von 1 min. Von denen die Wahrscheinlichkeitsverteilung der 5 Protokolle werden auf der linken Seite der Abbildung angezeigt. Der spektrale Leistungsdichte innerhalb eines Bereichs von 1-14 Hz der hippocampalen LFP während der Anwendung der jeweiligen Protokolle werden in der Mitte der Figur dargestellt. Die Wahrscheinlichkeiten der Theta Perioden während der Anwendung der jeweiligen Protokolle sind auf der rechten Seite dargestellt. (B) die Varianz der angewendeten Inter Pulse Abständen bestimmt die Varianz der gleichzeitigen Theta-Periode (Pearsons R = 0,94, p = 0,0002). (C) die Beziehung zwischen der Theta Amplitude Variabilität und Inter Puls Intervall (Pearsons R = 0,61, p = 0,08). Diese Zahl wurde von Ref. 70geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Optogenetische Theta rhythmische Entrainment bestimmt hippocampal LFP während Verhaltens. (A) Optogenetische stimulationsfrequenz bestimmt die Theta-Frequenz bei Fortbewegung. Daher drehzahlabhängig afferenzen haben keine Auswirkungen auf hippocampal Theta-Frequenz, und folglich Geschwindigkeit korreliert nicht mit Theta Frequenz (blau) wie bei spontanen Theta (schwarz). Daten werden vorgestellt, da ± s.e.m (B) während der ruhigen Wachzustand bedeuten, hippocampale Theta kann bei fehlender Bewegung ausgelöst werden. Hippocampale LFP Spuren vor und während der erfolgreichen Entrainment werden oben angezeigt, und Beispiel Geschwindigkeit Spuren aufgezeichnet während Entrainment sind unten aufgeführt (die rote Spur entspricht der hippocampal LFP-Ablaufverfolgung, die oben abgebildet). Blaue Streifen markieren die Zeitfenster der Lichtstimulation Impulse. Diese Zahl wurde vom Ref. 11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Hippocampal Zellaktivität während Theta Entrainment. (A) Zellaktivität verzeichnete mit Silikon Sonden (Schema). Einzelne Interneuronen und Pyramidenzellen waren isoliert und nach ihrer jeweiligen Wellenform identifiziert. Hier wird die durchschnittliche Wellenform (Mitte) und Auto-Correlogram ein Beispiel isolierten pyramidenförmige Zelle. (B) Preferred Entladephase der Pyramidenzellen (Pyr) war während der spontanen nicht anders (in schwarz, n = 29 Neuronen) und Optogenetically mitgerissen (in blau, n = 30) Theta (p = 0.79). (C) siehe hier ist die Auto-Correlogram (links) und bevorzugte feuern Phase von einem schnell feuernden konnte während der spontanen und Optogenetically mitgerissen Theta. Unter den entsprechenden hippocampal LFP Rhythmus während der spontanen (links) und mitgerissene Theta (rechts). (D) Preferred Entladephase der schnell feuernden Interneuronen war nicht anders während der spontanen (in schwarz) und Optogenetically mitgerissen (in blau, n = 28 Neuronen) Theta (p = 0,97). Durchschnittliche Auto-Correlogram wird auf der linken Seite angezeigt. (E) durchschnittliche Auto-Correlogram str. Oriens Zellen. (F) Preferred Entladephase der Oriens Interneuronen str. war nicht anders während der spontanen (schwarz) und Optogenetically mitgerissen (blau, n = 10 Neuronen) Theta (p = 0,56). Die Histogramme der bevorzugte Entladung Phasen werden auf der rechten Seite angezeigt. (G) durchschnittliche feuern Preise waren nicht betroffen von Theta Entrainment in Pyramidenzellen (p = 0,98), schnell feuernden Interneuronen (p = 0,96) oder str. Oriens Interneuronen (p = 0,85). Diese Zahl wurde vom Ref. 11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: Kombination der hippocampalen Theta Entrainment und optogenetische Hemmung der der hippocampalen subkortikale Ausgang durch die LS. (A) eNpHR3.0 (Halorhodopsin) drückte sich in hippocampalen Pyramidenzellen (obere Schema). Erfolgreiche Expression des Konstrukts wurde durch helle Fluoreszenz in Somata im Hippocampus (obere Bilder) und Axone im LS (untere Bilder) bestätigt. Optische Fasern wurden bilateral über LS (untere Scheme) implantiert. Skalieren Sie Bars: 500 µm (Bilder links), 50 µm (Bilder rechts). (B) Hippocampal Theta ist erfolgreich bei Hemmung des Hippocampus zu LS Weg mitgerissen. Hier gezeigt werden spektrale Leistungsdichte für 9 Hz blau Lichtstimulation während Ausgabe Hemmung. (C) Hemmung des großen hippocampal subkortikale Ausgabe-Signalwegs verhindert Auswirkungen der hippocampalen Theta Entrainment auf Geschwindigkeit. Hier gezeigt ist Abnahme der Geschwindigkeit Variabilität auf optogenetische Entrainment (weiße bar mit blauen Rändern), mit fehlt bei gleichzeitiger Hemmung der Hippocampus zu LS Weg (gelber Balken mit blauen Rändern). Jeweiligen durchschnittlichen Ausgangswert Geschwindigkeit wird auf der linken Seite angezeigt. Diese Zahl wurde vom Ref. 11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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