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Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

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DOI:

10.3791/57349

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29. Juni 2018

 ,  , 
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung der optogenetik und elektrophysiologische Aufnahmen für gezielte Manipulationen der hippocampal Theta Schwingungen (5 bis 10 Hz) im Verhalten Mäuse. Die Wirksamkeit von Rhythmus mitreißen wird mit lokalen Feldes Potenzial überwacht. Eine Kombination von Opto und pharmakogenetischen Hemmung befasst sich mit das ableitenden Auslesen der hippocampalen Synchronisation.

Zusammenfassung

Umfangreiche Daten über Beziehungen des neuronalen Netzes Schwingungen zu Verhalten und Organisation der neuronalen Entlastung über Gehirnregionen fordern neue Tools zum Gehirn Rhythmen gezielt zu manipulieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz Projektion-spezifische optogenetik mit extrazellulären Elektrophysiologie für High-Fidelity-Kontrolle der hippocampalen Theta Schwingungen (5 bis 10 Hz) im Verhalten Mäuse kombinieren. Die Besonderheit des optogenetische Entrainment wird erreicht durch gezielte Channelrhodopsin-2 (ChR2) der Gabaergen Bevölkerung von medialen septal Zellen, entscheidend in die Generation der hippocampalen Theta Schwingungen, und eine lokale Aktivierung synchronisiert eine Teilmenge von hemmenden septal afferenzen im Hippocampus. Die Wirksamkeit des Kontrollstreifens optogenetische Rhythmus wird durch eine gleichzeitige Überwachung des lokalen Feldes potenzielle (LFP) über Lamina der CA1-Region und/oder neuronale Entladung überprüft. Anhand dieser leicht umsetzbare Vorbereitung zeigen wir Wirksamkeit verschiedener optogenetische Stimulation-Protokolle für die Induktion von Theta-Schwingungen und für die Manipulation von deren Häufigkeit und Regelmäßigkeit. Schließlich spricht eine Kombination der Theta-Rhythmus Steuerung mit Projektion-spezifischen Hemmung das Auslesen einzelner Aspekte der hippocampalen Synchronisation von ableitenden Regionen.

Einleitung

Neuronaler Aktivität bei Säugetieren wird vom Netzwerk Schwingungen, koordiniert die Informationsübertragung innerhalb und zwischen Gehirn Regionen1,2,3,4zu unterstützen. Gehirn Rhythmen sind Schwingungen von sehr langsam (< 0,8 Hz) bis zu ultraschnellen (> 200 Hz) Frequenzen. Ein großer Körper des Beweises unterstützt Beteiligung der Netzwerk-Schwingungen in unterschiedlichen Gehirnfunktionen, einschließlich Kognition5,6,7,8,9,10 , angeborene Verhaltensweisen11,12 , sowie neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Parkinson und Epilepsie13,14,15. Selektive und zeitlich präzise Methoden zur experimentellen Manipulation Netzwerk Schwingungen sind daher unabdingbar für die Entwicklung der physiologisch plausible Modelle der Synchronisation und für die kausale Verbindung mit Verhalten.

Netzwerksynchronisation wird durch vielfältige biologische Substrate und Prozesse, Molekulare Identität von Ionenkanälen und deren Kinetik bis hin zu Neuromodulation der Erregbarkeit und Netzwerkkonnektivität vermittelt. Die biologische Gestaltung der Rhythmus, die Generatoren, die16 offenbart worden ist für viele Gehirn Rhythmen, unterschiedliche Aspekte von denen (z.B.Frequenz, Amplitude) oft sind herbeigeführt durch Dynamik der unterschiedlichen Zelltypen und Netzwerke. Zum Beispiel sind hemmende Interneurone, die gezielt die Somata der wichtigsten Zellen die wichtigsten Akteure in Frequenzbänder und Gehirn Regionen17,18, einschließlich Theta19,20, Gamma20 , 21und22 Schwingungen Welligkeit (140 – 200 Hz). Im Gegenzug wird Phase Synchronisation von weit entfernten Zellen durch robuste feedforward Signalisierung von Pyramidenzellen, die den Abschuss von Interneuronen zurückgesetzt gewährleistet. Ein entscheidender Parameter der Schwingungen, die synchronisierte neuronale Bevölkerungszahl ist eng verwandt mit der gemessenen LFP Oszillation Amplitude und mindestens für schnelle Schwingungen hängt der exzitatorischen befahren Interneuronen2. Im Gegensatz dazu langsamere Schwingungen, wie Delta und Theta Rhythmen entstehen durch weiträumige reentrant Loops, gebildet von Cortico-thalamische23,24 und hippocampal Medial septal Projektionen25, 26,27, beziehungsweise. Schwingungen in solche Schaltungen sind durch Wechselwirkungen zwischen Ausbreitung signalverzögerungen, erregbar Antworten und ihre Häufigkeit Vorliebe in teilnehmenden Zellen28,29,30, herbeigeführt 31 , 32. hemmende Projektionen von Gabaergen Parvalbumin (PV)-positiven Zellen der medialen Nasenscheidewand (MS) zu Interneuronen in den Hippocampus25,33, Parahippocampal Regionen und entorhinalen Kortex26 wesentlich für die Erzeugung von Theta-Schwingungen in den medialen Temporallappen. So können physiologische Mechanismen der Netzwerk-Schwingungen und neuronale Synchronisation mit optogenetik mit einer Echtzeit-Präzision manipuliert werden.

Zelle typspezifischen optogenetische Manipulationen wurden bei Untersuchungen der Hippokampus und kortikalen Schwingungen in-vitro-34,35,36,37,38 und angewendet in-vivo30,39,40,41,42,43,44,45, einschließlich funktioneller Untersuchungen von Gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 und welligkeit Schwingungen40,53,54 und Schlaf Spindeln55,56. Vor kurzem haben wir einen Cre-abhängige ChR2-Virus in den Mitgliedstaaten eine Schlüsselregion für die Generation des Hippokampus Theta-Rhythmus von PV-Cre-Mäusen. Mit Hilfe dieses Präparat, waren optogenetische Stimulation der hemmende Projektionen der MS in der Hippocampus-11Funktionen der hippocampalen Theta Schwingungen (Häufigkeit und zeitliche Stabilität) gesteuert. Darüber hinaus evoziert Theta-Frequenz optogenetische Stimulation der hemmenden Septo-hippocampal Projektionen Theta-Rhythmus während wach Immobilität. Die Optogenetically mitgerissen Theta-Rhythmus angezeigt Eigenschaften des spontanen Theta Schwingungen in der Maus bei LFP und neuronale Aktivität.

Wichtige Merkmale dieses Protokolls sind: (1) Nutzung von einem hemmenden Weg, das physiologisch wichtig für spontane Theta Schwingungen ist unter Vermeidung unspezifische Effekte auf hippocampal Erregbarkeit; (2) axonalen, d. h., Projektion-spezifische Stimulation, einen direkten Einfluss auf nicht-hippocampal MS Efferents; zu minimieren (3) lokale Theta-rhythmische Lichtstimulation, gewährleistet einen minimalen direkten Eingriff in Theta-rhythmische Septo-hippocampal Dynamik und einer globalen bilateralen Entrainment Theta Schwingungen; (4) parametrische Kontrolle der Theta-Schwingungen-Häufigkeit und Regelmäßigkeit; und (5) Quantifizierung der Entrainment Treue mit hoher zeitlicher Auflösung mit LFP um quantitative Kausalität Analyse im Verhalten der Tiere zu ermöglichen. Da dieses Präparat im Wesentlichen auf eine bekannte Rolle der Septo-hippocampal Enthemmung in Theta Generation25,30nutzt, ermöglicht es robuste Kontrolle über verschiedene Parameter der Theta-Schwingungen im Verhalten Mäuse. Wo andere weniger untersuchten Signalwege und Zelltypen der Septo-hippocampal Schaltung wurden Studien manipuliert38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 offenbaren weitere Mechanismen des Theta-Rhythmus.

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Protokoll

PV-Cre Knock-in männlichen Mäusen59, 10-25 Wochen alt, wurden verwendet. Mäusen waren unter normalen Bedingungen in der Tierstation untergebracht und auf einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt und wurden von den örtlichen Gesundheitsbehörden (Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt Und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen) genehmigt.

1. virale Injektion

  1. Folgen Sie während des gesamten Verfahrens biologische Sicherheit Richtlinien60. Tragen Sie einen Laborkittel, einen Mundschutz, ein Haarnetz und zwei Paar Handschuhe.
  2. Schlauch mit einem sterilen Skalpell oder einer Schere ca. 1 m Länge schneiden, legen Sie es in der Spritze Halter Block der Pumpe und befestigen.
    1. Füllen Sie den Schlauch komplett mit Silikonöl mit der Spritze.
    2. Überprüfen Sie, ob Luftblasen im Schlauch erscheinen. Wenn Luftblasen beobachtet werden, füllen Sie den Schlauch wieder mit Öl.
    3. Den Kolben, um die druckblock zu beheben.
    4. Langsam vorwärts den Schieber in Richtung der Spritze Halter Block, bis die Spitze des Kolbens den Schlauch berührt.
    5. Führen Sie die Spitze des Kolbens in den Schlauch und bewegen Sie automatisch den Schieber Block nach vorne mit einer langsamen Geschwindigkeit durch die Auswahl "Infuse" in das Befehlsfenster und eine niedrige Infusionsrate (z.B. 500 nL/min), bis die Spritze-Halter-Block erreicht.
  3. Bereiten Sie die Injektionsnadel (34G).
    1. Entfernen Sie die Nadel-Hub mit einem klaren Schnitt mit einer Präzision Bohrer/Schleifmaschine mit einer Trennscheibe verbunden. Falls erforderlich, verwenden Sie eine Nadel, um Metallrückstände aus frisch geschnittenen Oberfläche zu entfernen.
    2. Kapillare Schläuche (ca. 3-4 cm Länge) durch die Nadel einfädeln.
    3. Kleben Sie die Nadel auf das Rohr mit Superkleber.
    4. Verbinden Sie die Injektionsnadel bis zum Ende der Schläuche, die mit der Microsyringe-Pumpe verbindet.
  4. Legen Sie die Nadel auf der stereotaktischen Inhaber.
  5. Ziehen Sie Luft, bis eine Luftblase in den transparenten Schlauch über die Nadel sichtbar ist.
  6. Die Maus mit 1,5-3 % Isofluran in Sauerstoff zu betäuben. Warten Sie ca. 2 – 3 min., dann bestätigen Sie, dass die Maus vollständig betäubt ist, durch die Bewertung ihrer Antwort auf eine Zehe Prise. Während der Operation überwachen Sie des Tieres atmen und passen Sie Isofluran Konzentration bei Bedarf an.
  7. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Stereotaktische Rahmen mit nicht-traumatische Ohr Haltern.
  8. Schützen Sie die Augen der Maus mit einem Lipid-Gel.
  9. Injizieren Sie 0,1 mL Lidocain mikrodialysemembranen unter der Kopfhaut mit einer 0,01-1 mL Spritze und ein 26G Injektionskanüle.
  10. Rasieren Sie und Desinfizieren Sie die Maus-Kopf mit Ethanol-Lösung. Dann abwechselnd dreimal 2 % Chlorhexidin mit Ethanol der Operationsstelle zu desinfizieren.
  11. Führen Sie einen Mittellinie Schnitt mit feinen und scharfen Schere zwischen der Rückseite der Ohren auf das Niveau der Augen gehen, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind.
  12. Den Schädel durch die Anwendung ca. 50 µL NaCl mit einer Spritze reinigen und Trocknen mit einem Papiertaschentuch und ein Luftstoß.
  13. Positionieren Sie den Maus-Kopf die dorsal-Ventral-Ebene der Nase Klammer so angepasst, dass die Bregma und Lambda auf Augenhöhe dorsal-Ventral sind (± 0,3 mm).
  14. Bohren Sie ein Loch oben MS (AP 0,98 und L 0,5 mm in Bezug auf die Bregma).
  15. An dieser Stelle tauen Sie ein Aliquot des Virus (sollte mindestens 2 µL des AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40enthalten) für ca. 5 min bei Raumtemperatur (RT auf).
  16. Zentrifugieren Sie die aliquoten bei etwa 4.000 x g bei RT für 1 min.
  17. Pipette 2 µL des Virus auf ein Stück Parafilm; Verwenden Sie die zuvor geschützte Seite.
  18. Die Spitze der Spritze in die Flüssigkeit eintauchen und sorgfältig mit etwa 500 nL/min unter Beachtung der Flüssigkeitsspiegel zurückziehen. Um zu verhindern, Luft absaugen, Rückzug zu stoppen, bevor das Virus vollständig aufgenommen wird. Die zurückziehen-Rate nach der Lösungsviskosität anpassen; schneller kann Abzug eines Virus mit höherer Viskosität erleichtern.
  19. Reinigen Sie die Nadel mit einem Papiertaschentuch.
  20. Überprüfen Sie, dass das Virus sich in der Röhre befindet und der Virus und Öl durch eine Luftblase getrennt sind. Markieren Sie die Ebene des Virus auf das Rohr, um Steuern, ob Virus erfolgreich während der Injektion durchdrungen ist.
  21. Positionieren Sie die Nadel über die Kraniotomie und einfügen Sie langsam in das Gehirn bei der ersten Injektion (AP 0.98, L 0,5 V-5.2, 5,5 ° Lateral).
  22. Injizieren von 450 nL des Virus mit einer Rate von 100-150 nL/min Wartezeit für 10 min. vorsichtig bewegen die Nadel bis 0,1 mm und weitere 5 Minuten warten.
    1. Bewegen Sie die Nadel auf den zweiten Punkt der Injektion (AP 0.98, L 0,5 V-4.6) und injizieren ein weiteres 450 nL bei 100-150 nL/min.
    2. Vor dem Umzug der Nadel bis 0,1 mm. warten weitere 5 min vor dem Entfernen der Nadelöhrs wieder für 10 min warten.
  23. Naht der Schnitt mit Seide geflochten schwarz Naht mit Quadrat Knoten. Wärmen Sie das Tier mit einer roten Lampe, um die Erholung zu beschleunigen. Verwaltung von Antibiotika (0,3 mL Erycinum (1:4 in sterilen NaCl)) und Carprofen i.p täglich ca. 2-3 Tage nach der Operation.
  24. Schneiden Sie das Rohr über die Marke, die das Niveau des Virus angegeben. Das Rohr kann für weitere Injektionen verwendet werden. Bereiten Sie eine frische Injektionsnadel vor jeder Injektion.
    Hinweis: Diese Operation dauert ca. 1-1,5 h. Das Tier wacht in der Regel innerhalb von 5 min nach der Operation. Warten Sie mindestens 6 Wochen für ausreichende axonalen Ausdruck Zeit aber nicht länger als 5 Monate vor der Durchführung Stereotaktische Implantationen als Ausdruck Ebenen beginnen um ca. 6 Monate nach der Injektion des Virus zu verringern.

2. Vorbereitung des optischen Fasern (Abbildung 1A)

  1. Verwenden Sie multimode-Glasfaser (105 µm Core, Glas verkleidet mit Kieselsäure Kern, 0,22 NA). Streifen 125 µm Verkleidung des faserkerns mit Mikro-Stripperin, während die Faser noch die Faser Spule beigefügt ist.
  2. Schneiden Sie die Faser auf eine Länge von ca. 2-3 cm mit einem Diamant-Messer.
  3. Legen Sie die Faser in ein Zirkonia Keramik Stick zwinge (ID: 126 µm). Ca. 0,5-1 mm von der optischen Faser sollte ragen aus der konvexen Seite der zwinge.
  4. Gelten Sie mit Hilfe einer Nadel, einen Tropfen Epoxy-Kleber für beide Enden der zwinge aber nicht auf den Seiten der zwinge. Alternativ können Sie Superkleber.
  5. Lassen Sie den Kleber für mindestens 30 Minuten trocknen lassen.
  6. Polieren Sie die konvexe Seite der zwinge mit Diamant Läppen Polieren Film (3 µm Körnungen) Faser.
  7. Testen Sie die Treue der leichte Übertragung mittels eine optische Leistungsmesser.
    1. Legen Sie die Wellenlänge auf das Powermeter auf der gleichen Wellenlänge wie der Laser verwendet wird.
    2. Positionieren Sie die Patch-Kabel mit der Spitze mit Blick auf die Mitte des Sensors. Schalten Sie den Laser und gelesen Sie die Lichtleistung von den Leistungsmesser. Notieren Sie den Wert.
    3. Verbinden Sie die Glasfaser Patchkabel über eine Paarung Hülse und positionieren Sie es mit der Spitze der Faser mit Blick auf die Mitte des Sensors. Schalten Sie den Laser und gelesen Sie die Lichtleistung von den Leistungsmesser. Notieren Sie den Wert.
    4. Berechnen Sie die Übertragungsrate: Teilen Sie den zweiten Wert durch den ersten Wert. Wenn die Übertragungsrate unter 0,5 liegt, die Faser zu verwerfen, sonst für die Implantation verwenden.
    5. Testen Sie die Übertragungsrate für jede Faser vor der Implantation.
    6. Für spätere Experimente, passen Sie die Lichtintensität Ausgabe des Lasers auf die Übertragungsrate der optischen Faser: 5-15 geteilt durch die Übertragungsrate zu eine endgültigen Lichtleistung der Faserspitze von 5-15 mW erreichen die Lichtleistung von der Patchkabel Spitze gesetzt.
      Hinweis: Siehe auch Nr. 61 für die Herstellung von optischen Fasern.

3. Vorbereitung der Wolframdraht Arrays für LFP Aufnahmen (Abbildung 1 b)

  1. Kleben Sie mehrere (z. B. 6) 100 µm Kieselsäure Rohr Führungen parallel zu der Klebeseite ein Stück Klebeband. Schneiden Sie ein Stück, ca. 4-6 mm, für ein Wire Array Versammlung.
  2. Fädeln Sie Formvar isoliert 45 µm wolframdrähte durch die Führungsröhrchen mit Pinzette.
  3. Streifen 6 Emaille-isolierte feine Kupfer Verklebung Drähte (ca. 5 mm lang) und eine Masseverbindung (ca. 2-3 cm lang) mit einem Skalpell entfernt die Isolierung an beiden Enden zu kratzen. Mit den Nanoconnector-Pins zu löten.
  4. Ein wolframdraht mit einem Tropfen leitfähigen Silberfarbe, bzw. herstellen Sie jede Bonddraht. Lassen Sie für mindestens 30 Minuten trocknen.
  5. Gilt einen Mindestbetrag von Zement um die Drähte zu decken. Gelten Sie nicht Zement auf die wolframdrähte, die in das Hirngewebe oder auf den oberen Teil der Nanoconnector eingefügt werden. Lassen Sie den Zement trocken für mindestens 30 Minuten.
  6. Führen Sie einen eckigen Schnitt (5-20°) von der wolframdrähte mit stumpfen Edelstahl-Schere ermöglichen zuverlässige Implantation von Drähten unter oder oberhalb der Zone ventral angrenzend an das Stratum Pyramidale, wo Theta Amplitude zu niedrig für die Schätzung der ist dem Entrainment Treue.
  7. Deinsulate die Spitze (ca. 2 mm) an den Schutzleiter mit einem Skalpell entfernt die Isolierung zu kratzen. Behandeln Sie es mit Flussmittel und Presolder.
  8. Überprüfung möglicher Kreuz-Gespräche zwischen Elektroden, die mit einem digitalen multimeter. Dazu schließen Sie die Steckerstifte an das Multimeter, die in den Messmodus Widerstand eingestellt werden muss. Paarweise Kombinationen von Kanälen zu überprüfen; eine Lesung auf das Multimeter unter 5 MΩ zeigt deutliche Übersprechen.
  9. Überprüfen Sie die Impedanz jeder Draht-Elektrode in Kochsalzlösung mit einer Impedanz-Messgerät. Typische Impedanzwerte liegen unter 100 kΩ.
  10. Zur Erleichterung der Einnistung kleben Sie eine Glasfaser in der Draht-Array, so dass die Spitze der Faser auf der Ebene der kürzeste Draht ist und der Faserspitze ist in unmittelbarer Nähe, aber nicht berühren die wolframdrähte. Halten Sie den Winkel der Faser so klein wie möglich, um Gewebeschäden bei der Implantation zu verhindern.
    Hinweis: Siehe auch Ref. 62 für die Herstellung von Wolfram-Draht-Arrays.

4. stereotaktischen Implantationen

  1. Führen Sie Vorbereitungen wie 1,6-1.13 beschrieben.
  2. Das Bindegewebe von der Oberseite des Schädels entfernen und drücken nach unten Nackenmuskulatur gründlich von ca. 2 mm zu Muskel Artefakte während der Aufnahme zu vermeiden.
  3. Reinigen Sie den Schädel mit einem Wattetupfer Applikator und Kochsalzlösung und Bohrungen Sie 4 (2 vorne und 2) über das Kleinhirn, 0,8 mm Durchmesser Edelstahl-Knochenschrauben (00-96 x 1/16) für Boden und Stabilisierung des Implantats (Abb. 1) platzieren. Positionieren Sie die Erdungsschraube, verbunden mit einem Kupferdraht (ca. 2-3 cm Länge) über das Kleinhirn.
  4. Decken Sie die Masseschraube vollständig mit Zement zu Muskel Artefakte bei den elektrophysiologischen Aufnahmen zu vermeiden. Bauen Sie einen Zement-Ring alle Verbindungsschrauben (Abbildung 1E).
  5. Führen Sie eine Kraniotomie oberhalb der Implantation Seite (Hippocampus, AP-1.94, L 1,4 V 1.4 in Bezug auf die Bregma). Ca. 5 µL steriler NaCl auf die Oberfläche des Hirngewebes auftragen.
  6. Senken Sie langsam die Draht-Array mit Stereotaxis in die Kraniotomie. Für einheitliche Aufnahmen Implantat eine Silikon-Sonde anstelle einer Draht-Array-63; um Handwerkstechnik leichte Artefakte zu vermeiden, Implantat-Glasfaser separat im Hippocampus mit der Faserspitze nicht direkt vor der Sonde (Abbildung 1 -ich). Für die Untersuchung der Koordinierung der Mitnahme zwischen Hemisphären Implantat eine zusätzliche Glasfaser im kontralateralen hippocampalen CA1 Bereich.
  7. Gelten Sie etwa 5 µL des warmen flüssigen Wachs/Paraffin-Öl, mit einer Spritze über den Implantationsort Hirngewebe schützen bei 70 ° C vorgewärmt.
  8. Zement um das Draht-Array anwenden und den Schädel mit Zement zu decken.
  9. Ein Tropfen des Flusses auf die vorgelötet Bezugsmasse/Draht und der presoldered angeschlossen an die Erdungsschraube, beispielsweise mit Hilfe einer Nadel anwenden und die Drähte mit einem Lötanlage verschmelzen.
  10. Decken Sie das gesamte Massekabel mit Zement.
  11. Verwalten von 0,3 mL Erycinum (1:4 in sterilen NaCl) und Carprofen (5mg/mL) i.p nach der Operation und für mindestens die zwei Tage nach. Die Maus wacht in der Regel innerhalb von 15 Minuten nach der Operation. Wärmen Sie das Tier mit einer roten Lampe, um Erholung zu beschleunigen.
  12. Überwachen Sie das Gewicht der Maus täglich für die erste Woche nach der Operation oder bis das Gewicht stabil ist. Gewichtsabnahme sollte 10 % der Maus Gewicht aufgenommen vor der Operation nicht überschreiten. Zur Stabilisierung des Gewichts zu beschleunigen, liefern Sie die Maus mit Nassfutter und Kondensmilch in den ersten Tagen nach der Operation.
  13. Zum Aufzeichnen von hippocampal Zellaktivität während Entrainment Implantat eine Silikon-Sonde im Hippocampus (AP-1.94, 1.4 L, V 1, mit anschließenden absenken) wie unter Nr. 62 (Abbildung 1 -ich). Implantat-Glasfaser im Hippocampus bei AP-3 L 1,4 V 1.6, 39 ° kaudalen rostral. Implantat eine zusätzliche Glasfaser in MS (AP +0.98, L 1 V 3.9, 15° seitlich) Wenn Stimulation der Zelle Somata gewünscht wird.

5. Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Datenerfassung

  1. Gewöhnen Sie die Maus, um die Aufnahme-Setup(z. B.15 Minuten Sitzungen, 1-2 Sitzungen pro Tag für 3 Tage). Untersuchen Sie das Tier Verhalten, bevor Sie mit den ersten Experimenten. Wenn sich die Maus in der Kammer bewegt Erkundung der Umgebung, schnüffeln, Rearings, etc.die Durchführung, beginnen Sie die erste experimentellen Sitzung.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger in einer vertrauten Kammer in Ermangelung anderer Tiere im selben Raum.
  3. Legen Sie eine LED auf der Leiter-Bühne mit Klebeband um die Position des Tieres zu verfolgen. Stellen Sie sicher, dass das LED-Licht von der Kamera über den gesamten Zeitraum erfasst werden, dass das Tier die Aufnahme Kammer erforschen ist, vor Beginn der Experimente. Nehmen Sie auf, in der Dunkelheit um das LED-Licht zu verfolgen. Positionieren Sie eine Kamera, über die Aufnahme-Kammer.
  4. Überprüfen Sie die Lichtleistung von Patch-Kabel. Schätzen Sie die Lichtleistung der Faserspitze nach Verbindung je nach Übertragungsrate der Faser implantiert. Sicherstellen Sie, dass die Lichtleistung von der Spitze der Faser zwischen 5-15 mW, um zuverlässige Mitnahme zu ermöglichen.
  5. Der Headstage-Vorverstärker an die chronisch implantierten Stecker anschließen. LWL-Patchkabel an die chronisch implantierten hippocampal Faser für optogenetische Stimulation Experimente anschließen. Lichtstimulation Experimente verbinden Sie die Glasfaser an einem dummy zwinge an die Kopfhörer angeschlossen.
  6. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Aufnahme-Kammer.
  7. Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Impuls-Generators um die Stimulation Protokoll zu generieren.
  8. Wählen Sie den Kanal, der die 473 nm DPSS Laser kontrolliert. In der ersten Zeile geben Sie 3.000 mV (1. Spalte), mal 30 ms (2. Spalte), Wert 0 mV (3. Spalte), 112 ms Zeit (4. Spalte), Zeile wiederholen 840 und Gruppe wiederholen Sie 1, um ein Protokoll für 2 min 7 Hz Stimulation mit 30 ms lange Impulse zu generieren. Passen Sie die Zeitdauer in der 4. Spalte und Anzahl der Wiederholungen der Zeile, wenn die Stimulation auf einer anderen Frequenz oder eine andere Dauer erforderlich ist. In der zweiten Zeile wählen Sie 0 mW (1. Spalte), mal 500 h (2. Spalte), Zeile wiederholen 1 und Gruppe wiederholen Sie 1, um sicherzustellen, dass der Laser abgeschaltet ist nach der Stimulation Protokoll beendet wird.
  9. Klicken Sie auf "Datei > Speichern unter" und speichern Sie die Datei mit dem gewünschten Namen.
  10. Versichern, dass der Stimulator TTL-Ausgang auslösen des Lasers in den digitalen Lynx analoge Eingabe Vorstand, den Erwerb von elektrophysiologischen synchronisieren verbunden ist und optogenetische Daten.
  11. Alternativ, um die Variabilität der Theta Schwingungsfrequenz parametrisch zu regulieren, gelten Sie Züge der Lichtimpulse in unterschiedlichen Inter Puls Intervalle mit Perioden nach eine Gauß-Verteilung. Die Dispersion der Inter Puls Intervalle für verschiedene Protokolle, z. B.aus Schritt 3.2, 15.1 ms2zu ändern. Gelten Sie diese Protokolle um Theta Epochen mit unterschiedlichen Variabilität der Theta-Frequenz (Abbildung 6) zu generieren.
  12. Öffnen Sie die Software von der Recording-System. Klicken Sie auf "ACQ" erwerben und "REC" aufzunehmen. Warten Sie vor der Einleitung von Lichtstimulation die Grundlinie Verhalten (z.B., 2 min zum Abrufen von Baseline Geschwindigkeit oder 30 min an der Grundlinie Ort Felder extrahieren) aufzeichnen.
  13. Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Impuls-Generators. Klicken Sie auf "Datei > Öffnen" und wählen Sie die Protokolldatei der Wahl. Klicken Sie auf "Herunterladen und starten" um die Lichtstimulation zu initiieren.
    Hinweis: Das Experiment kann begutachtet und die Stimulation über Fernbedienung gestartet; Dies schließt den Einfluss der Anwesenheit von der Experimentator auf das Tier Verhalten. Je nach Ziel der Studie kann Stimulation initiiert und beendet während bestimmte Verhaltensweisen.

6. ein kombinierter Ansatz für Optogenetische Entrainment und Projektion-spezifischen Hemmung der Hippocampal Ausgang

  1. Drücken Sie ChR2 in MS GABAergic Zellen des PV-Cre Mäuse, aus, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
  2. Darüber hinaus Spritzen Sie insgesamt 2,4 µL CamKIIα abhängigen Halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) in beiden dorsalen hippocampalen Hemisphären (AP -1,7; L ± 1,05; V-2.05 und -1,4 mm; AP -1,7; L ± 1,7; V-2.05 und -1,55 mm; AP -2,3; L ± 1,5; V-2.2 und -1,3 mm; AP -2,3; L ± 2,2; V-1.65 und -2,45 mm).
  3. 6 Wochen hinweg Ausdruck zu ermöglichen.
  4. Implantat-eine Wolfram-Draht-Array mit Glasfaser in der hippocampalen CA1-Region, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Darüber hinaus Implantat bilateral optische Fasern in das laterale Septum (LS, AP 0,1, L 0,25 V-2,250 mm und AP 0.5, L -0,3, V-2,70 mm).
  5. Durchführen Sie optogenetische Theta Entrainment Experimente wie 5.4 5.5 beschrieben.
    1. Für die gleichzeitige Hemmung der hippocampalen Ausgabe auf der LS, erzeugen eine Protokoll-Reiz-Generation: z.B., Trigger das Auftreten von den Ausgabekanal verbunden, 593 nm DPSS Laser 15 s mit einem kontinuierlichen Impuls nachhaltig in insgesamt 45 s vor Auslösung die Impulse-Ausgabe, 473 nm DPSS Laser.
    2. Schließen Sie beide Fasern im LS per Patchkabel mit ein multimode-Faser optische Koppler, 593 nm DPSS Laser.
    3. Starten Sie die Aufzeichnung herunterladen Sie und lösen Sie das Protokoll zur Steuerung der Impulse-Generation aus.

7. Datenverarbeitung

  1. Wandeln Sie die elektrophysiologische Signale und positionieren Sie die Tracking-Daten mit neurophysiologischen Daten (ND)-Manager, um DAT und haben.POS Formate, bzw.64.
  2. Erhalten Sie die LFP durch Tiefpass-Filterung und Down-Probenahme von Breitband-Signal auf 1.250 Hz mit ND Manager66.
  3. Wählen Sie in jeder Aufnahme den Kanal mit der maximalen Amplitude von Theta Schwingungen (mit Neuroscope)19.
  4. Erkennen Sie die Zeitstempel der Laserpulse und der Stimulation Epochen mit einer Schwelle Erkennung Algorithmus (mit MATLAB-Funktion findpeaks.m o.ä.)11.
  5. Um die DAT-Datei in eine multi-Channel-Daten-Analyse-Software zu importieren, klicken Sie auf "Datei > Importieren", wählen Sie "binäre-Dateien" als Datentyp und die DAT-Datei. Geben Sie im Konfigurationsdialog die richtige Anzahl von Kanälen und einer Abtastrate von 1.250 Hz, klicken Sie auf "ok" und speichern Sie als .smr Datei. Plotten Sie Leistungsspektren, wählen Sie "Analyse > neue Ergebnis Ansicht > PowerSpectrum". In den Einstellungen wählen Sie den Kanal mit der höchsten Theta-Amplitude und 16.384 FFT-Größe, klicken Sie auf "Neu", definiert als "Startzeit" Beginn der Stimulation Epoche und als "Endzeit" Ende der Stimulation Epoche, und klicken Sie auf "Prozess".
  6. Berechnen Sie die Mitnahme Treue als das Verhältnis der kumulierten spektrale Leistungsdichte (PSD) innerhalb des Frequenzbereichs optogenetische Stimulation (Stimulation Frequenz ± 0,5 Hz), die kumulative PSD im Theta (5-12 Hz) Band mit der multitaper-Methode (NW = 3, Fenstergröße 8.192) für 10 s Epochen (z.B., Toolkit < Http://chronux.org/>).
  7. Ausschließen, Aufnahme Epochen wo der dominanten PSD-Gipfel ≤ ist 5 Hz aus der Analyse (nicht-Theta Epochen, mit MATLAB-Funktion find.m).
  8. Zeichnen Sie das Raster der LFP Leistungsspektren für alle aufgezeichneten Epochen entsprechend der berechneten Entrainment Treue (mit MATLAB Funktionen sortrows.m und pcolor.m). Laden Sie die Leistungsspektren und Mitnahme Treue durch Klicken auf "Datei > Öffnen" gespeicherten Variablen Zoll Typ Leistung = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:End)).

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Ergebnisse

Ausrichtung der ChR2 Gabaergen Zellen in den Mitgliedstaaten wie in Abschnitt 1 beschrieben ist in Abbildung 2Adargestellt. Optogenetische Stimulation der Axone der MS GABAergic Zellen im dorsalen Hippocampus über eine optische Faser und oberhalb der CA1-Region implantiert koppelt Theta Schwingungen mit der Frequenz des Reizes in der ipsilateralen (Abb. 2 b) sowie kontralateralen Hemisphäre (Abbildung 2

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Diskussion

Hier präsentierten wir eine allgemein zugängliche Methode zur mitzureißen und hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten Tier zu entlocken. Diese Methode ist nützlich für die Studien der Theta-Rhythmus Funktionen in der Informationsverarbeitung und Verhalten. Kritische Aspekte dieser Methode gehören: (1) Wahl der Opsin und Ausrichtung der ChR2 um Axone der MS Zellen im Hippocampus, (2) robust optischen und elektrischen Eigenschaften der implantierten optische Faser-Draht Array Assemblys, die kontinuierliche Stimulation ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten das Manuskript Maria Gorbati kompetente Hilfe bei der Datenanalyse und Jennifer Kupferman für Kommentare bedanken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; EXC 257 NeuroCure, TK und AP; Schwerpunktprogramm 1665, 1799/1-1(2), Heisenberg-Programm, 1799/2-1, AP), die deutsch-israelische Stiftung für wissenschaftliche Forschung und Entwicklung (GIF; Ich-1326-421.13/2015, TK) und das Human Frontier Science Program (HFSP; RGY0076/2012, TK).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PV-Cre-MäuseDas Jackson LaboratoryB6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
NameCompanyKatalognummer<>strong>Comments
Surgery
StereotaxisDavid Kopf Instruments, Tujunga, CA, USAModell 963Ultrapräzises stereotaktisches Instrument für Kleintiere
Bohrer, 0,8 mmBijoutil, Allschwil, Schweiz49080HM
0,01-1 ml SpritzeBraun, Melsungen, Deutschland9161406V
Sterican KanülenBraun26 G, 0,45x25 mm BL/LB
Feine und scharfe SchereFine Science Tools Inc., Vancouver, Kanada14060-09
PinzetteFine Science Tools Inc.11210-10Dumont AA - Epoxidbeschichtete Pinzette
Stumpfe EdelstahlschereFine Science Tools Inc.14018-14
LötstationWeller Tools GmbH, Besigheim, DeutschlandWSD 81
ErythromycinRotexmedica GmbH, Trittau, DeutschlandPZN: 108239321g Pulver zur Herstellung einer Infusionslösung
NameUnternehmenKatalognummerComments
Optogenetics
Hamilton 5 & micro; L Spritze, 26 GaugePHD Ultra, Harvard ApparaturModell 75 RN SYR
Hamilton 5 µ L KolbenPHD Ultra, Harvard ApparaturModell 75 RN SYR
SchlauchFisher Scientific, Pittsburgh, USAPE 20Innendurchmesser 0,38 mm (.015"), Außendurchmesser 1,09 mm (.043")
Sterican KanülenBraun, Melsungen, Deutschland27 G, 25x0,40 mm, stumpf
Präzisionsbohrer/-schleiferProxxon, Wecker, Luxemburgfbs 240/e
Schneiden ScheibenProxxonNO 28812
Cre-abhängiger KanalrhodopsinPenn Vector Core, Philadelphia, PA, USAAV-1-18917PBauname: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomate, Titer: 1,42x1013 vg/ml
Cam-Kinase-abhängiger HalorhodopsinPenn Vector CoreAV-1-26971PKonstruktname: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, Titer: 2,08_1012 vg/ml
Multimode-GlasfaserThorLabs, Dachau, DeutschlandFG105LCA0,22 NA, Low-OH und Oslash; 105 &Mikro; m Core, 400 - 2400 nm
Keramik-Stab-FerrulePräzisionsfaserprodukte, Milpitas, CA, USACFLC126Keramik LC MM Ferrule, ID 126um
PolierpapierThorlabsLF3D6" x 6" Diamant Läppen (Polieren) Blatt
LeistungsmesserThorlabsPM100DKompakte Leistungs- und Energiezählerkonsole, digitaler 4"
LCD Multimode-GlasfaserkopplerThorlabsFCMM50-50A-FC1x2 MM Kupplung, 50:50 Split-Verhältnis, 50 &Mikro; m GI Fibers, FC/PC
Fiberoptisches PatchkabelThorlabsFG105LCA CUSTOM-MUCSonderanfertigung, 3 m lang, mit Schutzschlauch, Schlauch: FT030, Anschluss 1: FC/PC, Anschluss 2: 1,25 mm (LC) Keramik-Ferrule-Hülse
Präzisionsfaserprodukte, Milpitas, CA, USAADAL1Keramik-Split-Gegenhülse für Ø 1,25 mm (LC/PC) Aderendhülsen
473 nm DPSS-LaserLaserglow Technologies, Toronto, ON, KanadaR471005FXLRS-0473 Serie
593 nm DPSS-LaserLaserglow TechnologiesR591005FXLRS-0594 Serie
MC_Stimulus IIMultichannel Systems, Reutlingen, DeutschlandSTG 4004
ImpedanzkonditionierungsmodulNeural microTargeting weltweit, Bowdoin, USAICM
NameUnternehmenKatalognummer<>Kommentare
Elektrophysiologie
WolframdrähteCalifornia Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USACFW001095440 µ m, 99.95%
KapillarschlauchOptronik1068150020ID: 100.4 µ m
Omnetics NanosteckverbinderOmnetics Connector Corporation, Minneapolis, USAA79038-001
SchraubenBilaney, Dü sseldorf, Deutschland00-96x1/16
Edelstahl-SilikonsondeNeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USAB32
HeadstageNeuralynx, Bozeman, Montana USAHS-8Miniatur Headstage Unity Gain Vorverstärker
Silber leitfähige FarbeConrad electronics, Deutschland530042
Liquid fluxFelder GMBH Lö ttechnik, Oberhausen, DeutschlandLö tö l STDIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LEDNeuralynxHS-LED-Red-omni-10V
Name<>strong>FirmaKatalognummerKommentare<
u>Software
MATLABMathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus SoftwareMultichannel, Systems
Neurophysiological Data ManagerNDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klustershttp://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software des AufzeichnungssystemsNeuralynxCheetahhttps://neuralynx.com/software/cheetah
Mehrkanal-DatenanalysesoftwareCambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GBSpike2
Hamilton Pumpe PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA Modell 703008 PHD Ultra Spritzenpumpe mit Push/Pull-Mechanismus

Referenzen

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mediales SeptumChannelrhodopsin 2lokales FeldpotenzialOptikfaser ImplantatDrahtarraystereotaktische Chirurgievirale TransduktionKontrolle der Theta Oszillation

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