Summary
组织工程的肾脏结构提供了解决的器官短缺和有害影响的透析。在这里, 我们描述了一个小鼠肾脏的显微解剖的协议, 以隔离皮质髓质段。这些片段植入无支架细胞结构, 形成肾 organoids。
Abstract
肾脏移植现在是治疗终末期肾脏疾病的主流疗法。然而, 约有9.6万人在等待名单上, 只有1/4 的患者实现移植, 迫切需要为那些器官衰竭者提供替代品。为了减少透析带来的有害后果, 以及它所招致的整体医疗费用, 正在积极调查寻找移植器官的替代办法。植入性组织工程的肾细胞结构是一种替代失去的肾脏功能的可行方法。这里, 第一次被描述, 是小鼠肾脏的显微解剖为分离生活皮质髓质肾脏片断。这些片段能够迅速纳入无支架的内皮纤维细胞结构, 这可能使与宿主血管的快速连接一旦植入。成年小鼠肾脏是从活体捐献者那里获得的, 其次是立体镜显微解剖, 得到 200-300 µm 直径的肾段。多肾结构是用从一肾中收获的原发性肾段制作而成。该方法证明了一种可以从器官中抢救功能性肾组织的程序, 否则将被丢弃。
Introduction
慢性肾脏疾病 (CKD) 是当前全球主要的公共卫生挑战之一1。在美国, CKD 患病率超过总人口的 14%, 超过60万的美国人患有最严重的疾病, 终末期肾病 (ESRD)2。目前的治疗方案可供那些 ESRD 包括透析和肾移植。虽然每年约有2.5万名患者接受肾移植, 但每年有大量患者被增加, 导致等待救生器官和接受移植的人之间的巨大差距3。除了对长寿和生活质量造成严重的负面影响外, 透析还带来了惊人的经济负担。在 2014年, 医疗保险支付的索赔总额超过300亿美元的 ESRD 患者2。由于器官供应有限, 需要透析的患者没有明显的下降趋势, 因此, 旨在确定透析和移植的替代解决方案的研究工作一直是重要的。即使是相对较短的延迟, 透析的需要增加了病人的质量调整生活年限和生产力的大量, 而推迟透析相关费用4,5,6。
在组织工程和再生医学实验室中, ESRD 的功能性组织丧失的解决方案目前正在研究中, 从脚手架为基础的 organoid 制造到整个器官工程都有广泛多样的方法。瓣膜细胞植入的器官结构7,8,9,10,11。综述复杂的肾脏结构从边缘或被放弃的肾脏仅部份地被调查了。事实上, 为移植而采购的肾脏的近20% 因各种原因被丢弃,12,13。这些假定的移植物的功能性肾脏组织可以被利用并纳入一个或多个组织工程结构。先前的研究表明, 与这些被丢弃的器官合作的可行性, 利用肾脏为组织工程目的的额外细胞矩阵14,15。然而, 很少有使用健康肾脏的主要 nephronal 组织为组织工程目的16,17,18。
Kim et以前描述的一种方法是将肾脏 "段" 从健康的大鼠肾脏中分离出来, 然后在羟基酸 (PGA) 支架上播种, 用于构造制造16。然而, 关于精确解剖方法的信息很少, 从精细切碎和过滤的结合中得到了部分。我们描述了这个协议的修改, 这同样产生了离散的肾段与完整的 nephronal 体系结构, 而是依靠显微切割技术。切除是对活体成年小鼠进行的, 然后将肾脏转移到切除肾囊的解剖显微镜, 并进一步解剖组织。小孔 30½ G 针作为切割仪器, 也作为辅助解剖辅助, 因为针直径等于肾段的靶直径。这种孤立的, 在这种情况下, 小鼠, 肾部分保持在培养的生存能力, 并纳入无支架内皮细胞成纤维细胞结构19。这些构造以前被用来设计其他器官, 包括生物人工胰腺20。
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Protocol
所有的动物外科手术程序都是在南卡罗来纳州医科大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的, 然后再进行任何动物手术或任何动物组织的使用。
1. 小鼠肾切除术
- 不要用手术面罩和蓬松帽来减少污染的风险。在手术区的设置中保持不孕。
- 将非 fenestrated 的手术窗帘放在手术台上。
- 在无菌窗帘上打开一包蒸压仪器。肾切除术所需的器械包括3小止血剂、牙精钳、无牙精钳、直虹膜剪刀。
- 将另一种非 fenestrated 的手术悬垂放在手术台的中心。
- 用钙和镁制备5毫升的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS), 在15毫升无菌圆锥管中补充1% 青霉素/链霉素。将此解决方案放在操作表旁边的冰上。
- 从动物住房综合体获得 8-12 周大的 C57BL/6 鼠 (男性或女性)。
- 将鼠标放在麻醉感应腔内, 并诱导3.5% 吸入异氟醚。在鼠标上放置一个鼻锥, 使用2% 异氟醚进行维护麻醉。
- 通过评估踏板反射 (牢固的脚趾捏), 在整个手术过程中周期性地监测足够的麻醉深度。
- 使用脱毛膏去除腹侧躯干的所有毛发。用蒸馏水冲洗这个区域, 以确保所有的毛发都已从腹部取出。
- 在顶部非 fenestrated 悬垂下, 将鼠标转移到仰卧位的无菌手术台上。切出一个 2 x 2 厘米2开窗, 在刚刚覆盖鼠标腹部的褶皱。
- 应用聚维酮碘后, 70% 乙醇的腹部使用无菌纱布或棉花球。
- 使用牙和虹膜剪刀精钳, 使 3-4 厘米垂直腹部皮肤切口平行的中线, 0.5 厘米到左中线
注意:如果试图删除右肾, 这将是一个切口0.5 厘米右侧的中线。- 用细钳无牙抓腹膜, 用虹膜剪刀切割进入腹腔。将止血剂应用于皮肤和腹膜的上、下侧边缘 , 以横向放置张力 , 增露。
- 将肠道内容微妙地移到腹部右侧, 以暴露左肾。轻轻地把牵引放在肾脏上, 把它从腹部抬高。
- 在左肾的脐处放置一个止血。用虹膜剪刀对输尿管和肾血管进行横断面。
- 在冰上放置左肾1% 青霉素/链霉素 DPBS 溶液。
- 将含有肾脏的管转移到无菌组织培养罩中。将肾脏从15毫升锥形管转移到60毫米培养皿 (图 1)。用5毫升 DPBS 与钙和镁冲洗两次。保持肾脏悬浮在5毫升 DPBS 在60毫米菜。
- 准备一个额外的60毫米培养皿与5毫升 DPBS 将用于在显微解剖协议。
- 根据批准的 IACUC 动物协议, 弄死通过开胸和放血后的肾脏的采购。
2. 小鼠肾脏显微切割分离肾段
- 继续使用无菌技术的这一部分的协议, 包括无菌手套, 手术面罩, 蓬松, 以减少污染风险。
- 将无菌窗帘放在立体声显微镜平台上, 以及在显微镜的左侧和右侧的区域有一个无菌的领域为仪器。将塑料粘合剂片放在显微镜聚焦旋钮上, 喷雾70% 乙醇。打开双鹅颈灯照明舞台。
- 开放式消毒器械 (无牙精钳, 手术刀柄, #15 手术刀刀片, 两个直止血剂, 两个30½口径空心孔针) 到无菌窗帘。现在将 #15 刀片放到手术刀手柄上, 并将一个止血连接到每个针适配器/轮毂, 以创建用于以后使用的针式解剖仪器, 如图 1所示。
- 移动60毫米培养皿, 一个包含肾脏在 DPBS 和其他仅 DPBS, 从组织培养敞篷到显微镜区域。
- 将60毫米培养皿置于目标下, 取出盖子露出肾脏。将含有 DPBS 的盘子留在不育的田地旁, 供日后使用。
- 移动的菜, 以便只有前或后表面的肾脏是在视图 (即, 大平脸的肾脏, 与另一张脸接触底部的菜)。缩放到 3.2 4X 的过程的这一部分。使用非显性手, 使用无牙的细钳刺穿和针在肾脏的下和上两极附近的盘子。
- 保持不占支配地位的手固定肾脏。用主导的手, 使用 #15 刀片从暴露的表面去除半透明纤维囊层。从肾脏外露表面刮出最浅的0.5 毫米, 除去胶囊的其余部分。
- 使用 #15 刀片从 decapsulated 区域解剖组织的倒置金字塔, 大小约为2毫米3 。检索60毫米的菜只含有 DPBS, 并将组织金字塔放到干净的盘子里。丢弃肾脏的其余部分。
- 在解剖的其余部分减少 1.5-2.0X 的放大倍数。使用两个止血针仪器作为切割仪器, 切片的组织片段成逐渐小的片断, 直到组织段小于或等于针尖的直径。肾脏组织2毫米3的大小将产生超过50段, 一旦完全解剖。
- 将60毫米的菜与肾段移至组织培养罩。用1000µL 吸管去除 DPBS。添加5毫升 DMEM, 辅以10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素/链霉素。
- 培养3天在37°c 在孵化器或植入细胞结构立即。
3. 肾段细胞结构制作
- 培养正常的人真皮成纤维细胞 (NHDF) 和人脂肪微血管内皮细胞 (HAMEC) 几个星期, 以获得 7.2 x 105成纤维细胞和 1.8 x 105内皮细胞每个结构所需的。在组织培养罩中, 将成纤维细胞的适当比例 (4:1) 放入琼脂糖模中的棒状井中, 形成无支架的前血管内皮-成纤维细胞结构 (规格), 如前文所述 Czajka et 19。
- 获得灭菌止血, 30½ G 针, 和无菌铲与平端。
- 从含有肾脏片段的60毫米盘子中取出大部分培养基, 小心不要吸入并取出肾部分。
- 配备手术放大镜, 以可视化的片段植入。
- 在60毫米的盘子底部轻轻地刮擦刮刀的末端, 以获得 10-15 段, 沿铲片的尖端均匀分布。把刮刀的尖端尽可能靠近规格的种子的唇口。
- 另一方面, 使用 hemostat-30½的 G 针工具, 将每个部分从铲头移动到井的边缘。用针尖轻轻地将每个段向下移动到井中, 直到在先前播种的细胞悬浮液中略微淹没。
- 培养肾段-规格在 2:1: 1 FGM-2/EGM-2/DMEM 培养基的比例 (2.5 毫升体积总数)。每24小时更改文化媒体3天。从模具中取出 72 h 的构造, 然后进行修复或闪速冻结处理。
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Representative Results
所描述的协议产生大约50个肾脏片段每锥体2毫米3段肾脏组织。已处理和成像的肾段有不同比例的管状和肾小球成分 (请参见图 2)。完整的片段进行了化验, 以确定每24小时的不同片段的生存时间三天。绿色荧光 calcein 是存在的细胞内酯酶活性, 指示的活细胞。红荧光溴 homodimer-1 被认为是由于等离子膜完整性的丧失。虽然这些片段是完整的, 三维结构, 重要的检测穿透是可观的共焦显微镜 (见图 3)。
使用相同的细胞活力测定, 进一步表征了各段的尺寸均匀性。使用带有凹陷的玻璃滑梯, 段被放置在不受机械力放置在线段任何尺寸的盖板下。游离漂浮, 片段被成像30分钟后放置在细胞活力/毒性试验。在整个段中采用了10µm 步长的 z 投影。获得并记录了最大的 "X" 和 "Y" 维数。通过计算从第一个到最后可见荧光的距离, 获得了 "Z" 维数。考虑到各段大致为立方, 得到了一个简单的立方容积测量, 并绘制了一个显微解剖实验来比较10个随机选取的段。目标卷 (300 µm)3 = 0.027 毫米3显示在直方图上的红色标记 (图 4a)。代表的 "X" 和 "Y" 度量显示在图 4B中。虽然有异常点, 但在目标卷附近有许多段。重复实验显示了一致的结果 (n = 20)。原始测量 (这里没有显示) 表明, 在绝大多数的部分, 至少有一个维度测量 200-300 µm。这对扩散限制有重要影响。
肾段嵌在无支架的内皮成纤维细胞结构中, 培养3天。在3天 (参见图 5A) 中, 肾脏片段与细胞结构结合在一起形成完整的结构。该结构维持其前血管内皮网络, 通过标记与冯血友病因子 (图 5E) 显示。然而, 它似乎并没有出现网络侵入肾细胞材料。肾上皮细胞用 Cytokeratin-18 标记 (图 5B, 绿色)。这些构造用 FITC 标记的白蛋白 (图 5C, 灰色) 孵化, 以便测试的体外肾脏功能。虽然有残留的白蛋白从植入肾组织的片段中发现, 但在肾小管上皮细胞的区域有 "热点", 那些被称为 luminally 内的白蛋白。这被认为代表白蛋白摄取在肾部分细胞结构。
图 1: 代表性照片从肾切除和肾部分显微解剖.小鼠肾脏被切除, 冲洗, 并放置在一个60毫米的菜, 并移动到立体镜显微镜阶段。针尖的直径用于指导解剖。止血剂附着在用于解剖器械的针尖上。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: Microdissected 肾段.microdissected 肾段包含不同比例的肾小球 (左下角, 嗜碱性颗粒结构) 和小管 (图像的其余部分) 在他们的本土安排。10X. 显示图像, 缩放栏。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 肾脏段生存能力.microdissected 肾段包含活体和死组织的部分。主要地, 片断是居住的, 并且保持在文化在 72 h. 注意到不同的段被用于不同的时间点, 因为生存能力化验本身对细胞是有毒的。10X 图像, 缩放条 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 肾段体积均匀。(A)在 mm3中从一个解剖实验 (n = 10) 中分割立方体积。与目标红色点 (目标卷 0.027 mm3) 相比, 各个段由蓝色点表示。(B)代表 X 和 Y 维度测量, 从活死人化验, 10X 图像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 组织工程无支架肾段结构。(A)合并图像, 显示将肾脏段纳入规范. (B) Cytokeratin-18-positive 肾小管上皮细胞 (绿色)。(C) FITC 标记的白蛋白。(D) Hoescht 为原子核着色。(E)血管血友病因子 (vWF) 阳性突出显示 prevascular 网络。10X 图像, 缩放条 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
用于设计活体肾脏组织结构的方法在所使用的细胞类型和生物材料方面差别很大, 在许多情况下, 在文献7中已经过时或没有很好的特征。虽然许多人使用干细胞方法或综述独立的肾脏结构的个别成分, 但从细胞悬浮中人工再造26多个不同分化细胞类型的整个器官的前景是压倒性地考虑21。这很可能是其他人在组织工程应用中使用肾组织片段的方法。如上所述, 以前的工作已经做了分离的肾脏段播种的 PGA 支架16。然而, 用于描述隔离段的方法很少详细说明, 而且在任何一段时间内都没有培养这些段来评估生存能力。这里描述的方法, 连同细胞生存能力的测定, 表明, 在最低限度, 部分的肾部分是维持生存能力的 72 h 标记, 这是以前没有说明。该方法还具有生成具有相当可预测尺寸的线段的优点。此外, 这些方法提供了一个临床可翻译的方法, 以增加肾功能衰竭, 主要是证明了一种可行的方法, 以分离的部分, 从器官, 否则将丢弃。
在开发该方法时, 最大的挑战首先是确定适当大小的无菌对象, 第二, 维持不孕, 因为该过程涉及细胞培养罩之外的许多步骤。30½ G 针提示是有用的测量和解剖装置。不孕是早期实验中的一个挑战, 主要与手术设置和控制小鼠皮毛有关。
手术的局限性与肾组织段的三维性质有关。在显微镜下的一个视图中, 线段的尺寸看起来大概是针径的大小, 0.260 毫米。但是, Z 维度在立体镜上不可见。显微解剖是手工完成的, 这本身就是另一个限制。在未来, 机器人标准化将是理想的。如果在解剖过程中, 肾脏组织的2毫米3锥体部分保持正确的方向, 解剖完整的肾单位不会是深不可测的。最后, 将这些构造与生物人工胰腺进行比较, 其中胰岛细胞被嵌入到规范中, 必须确认密钥差异20。肾脏在功能上和建筑学上是独特的从胰腺和可以说更复杂。此外, 胰岛细胞仅仅是胰腺内功能细胞的一个亚型, 而不是这种方法与肾段分离的功能细胞砾岩。与建筑学和特别方向性扮演如此大角色在肾脏的作用, 并且特别过滤, 缺乏一致的方向的片断在结构之内是这个方法的另外弱点。
目前的研究旨在评估肾部分和肾脏结构的功能, 以澄清白蛋白摄取的程度和评估其他肾功能。未来的动物实验将涉及在膀胱壁内植入肾脏结构。嵌入这个高度血管的身体结构的构造将允许快速吻合, 并避免需要的收集系统, 滤液排泄直接进入膀胱。考虑到肾脏组织的体外功能极其有限,体内测试是至关重要的。文献中目前报告的唯一体外测试是围绕白蛋白摄取和促红细胞生成素表达式17,22。这些完整的肾脏组织在其本土建筑中嵌入的原始内皮网络, 不依赖任何外国生物材料, 显示在移动到功能性的, 可生物相容的肾脏组织置换的生活片段承诺.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
NIH 机构博士后培训补助金, NIH-HL-007260
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
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