Mikromanipulation von Chromosomen in Insekten Spermatozyten

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir die Auswahl und Vorbereitung der entsprechenden Zellen für Mikromanipulation und den Einsatz von piezoelektrischen Mikromanipulator Chromosomen in den Zellen neu zu positionieren.

Zusammenfassung

Die Mikromanipulation Chromosomen hat eine wesentliche Methode zur Beleuchtung des Mechanismus zum Chromosom Congression Spindel Checkpoint und Anaphase Chromosom Bewegungen, und wurde Schlüssel zum Verständnis, was Chromosom Bewegungen steuert während der Zellteilung. Eine erfahrene Biologe können einem Mikromanipulator um Chromosomen von der Spindel, um Chromosomen innerhalb der Zelle neu zu positionieren und Chromosomen mit Hilfe einer kleinen Glas-Nadel mit einer sehr feinen Spitze Kräfte zuweisen zu lösen. Während Störungen an Chromosomen, die mit anderen Methoden wie optische fallen und andere Verwendungen von einem Laser vorgenommen werden können, kann bisher keine andere Methode der Neupositionierung der zellulären Komponenten auf der Skala der Dutzende bis Hunderte von Mikron mit wenig bis keine Beschädigung der Zelle .

Die Auswahl und Vorbereitung der entsprechenden Zellen für die Mikromanipulation der Chromosomen, die Vorbereitung der Heuschrecke und Cricket Spermatocyte Primärkulturen für den Einsatz in live Cell Imaging und Mikromanipulation, genau beschreiben hier beschrieben. Darüber hinaus zeigen wir den Aufbau einer Nadel verwendet werden für das Verschieben von Chromosomen innerhalb der Zelle und die Verwendung von einem Joystick gesteuerte piezoelektrischen Mikromanipulator mit einer glasnadel attached to it. Chromosomen innerhalb teilenden Zellen neu zu positionieren. Ein Beispielergebnis zeigt die Verwendung von einem Mikromanipulator, ein Chromosom von einer Spindel in eine primäre Spermatocyte zu lösen und das Chromosom innerhalb der Zelle neu zu positionieren.

Einleitung

Mikromanipulation hat Teile des Mechanismus für ein Chromosom Congression Spindel Checkpoint und der Anaphase Chromosom Bewegungen ergeben. Die früheste Publikation beschreibt die Ergebnisse der Mikromanipulation Experimente wurde von Robert Chambers¹. Kammern verwendet eine mechanische Mikromanipulator mit einer angehängten glasnadel das Zytoplasma einer Reihe von verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Leider fehlten Kontrastverfahren, die erlaubt die Visualisierung der Chromosomen und viele andere Zellbestandteile in lebenden Zellen zum Zeitpunkt Chambers Experimente zeigen nicht die Auswirkungen der Neupositionierung solche Zellkomponenten.....

Protokoll

1. Vorbereitung der primären Insekt Spermatocyte Zellkultur Mikromanipulation

1. Schieben Sie Vorbereitung
   1. Erhalten Sie einen 75 mm x 25 mm-Objektträger mit einem 20 mm Durchmesser rundes Loch in der Mitte der Folie ausgeschnitten.
      Hinweis: Diese wurden aus einem einzigen Blatt von Fensterglas auf die Größe von einem Objektträger mit einem Loch in der Mitte geschnitten.
   2. Ein 25 x 25 mm #1.5-Deckglas durchlaufen einen Bunsenbrenner Flamme für 2 s.
   3. Vakuum Fett rund um den Rand des Lochs in der gläsernen Objektträger auftragen
   4. Legen Sie das Deckglas auf das Loch wie in Abbildung 1. Drücken si....

Ergebnisse

Abbildung 6 zeigt ein Beispiel Mikromanipulation von 2 benachbarten Grasshopper primären Spermatozyten in mehrere Beispiele für die Einsatzmöglichkeiten der Mikromanipulation. Dieses Experiment wurde durchgeführt mit Hilfe einer inversen, Phasenkontrast-Mikroskop. Die 0:00 (angezeigten Uhrzeiten sind in Min: s) Bild zeigt beide Zellen vor der Manipulation. Ein Chromosom in die untere Zelle zeigt unter Spannung durch die Mikromanipulation Nadel (0:05; schwarze.......

Diskussion

Mit etwas Übung kann die Chromosomen in der Zelle bewegen zweiten Natur geworden. Nadeln, ausreichend steif und ausreichend dünn-Kreissägeblätter sind schwer zu "den Dreh raus zu bekommen" fabrizieren, aber diese Fähigkeit kommt auch mit der Praxis. Nadeln, die so fein sind, dass sie sich verformen, wenn im Öl Halocarbon verschoben werden nicht für den Druck von Chromosomen in der Zelle. Nadeln, die so stumpf, dass ihre Tipps sichtbar sind und so groß wie 1/3 der Breite eines Chromosoms (oder größer) sehr wahrscheinlich .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
VWR Micro Cover Glas	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Mikrodisparierschere, Edelstahl	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 feine	Vorstöße Fine Science Tools	11254-20
0,85 mm Außendurchmesser, 0,65 mm Innendurchmesser Pyrex Glasrohr	Drummond Scientific	Sonderanfertigung - Rufen Sie an, um Anfrage zu stellen
Inverses Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher oder 16-facher Vergrößerung und 60-facher oder 100-facher Vergrößerung Objektiv mit hoher Vergrößerung	Marke
Microforge	entweder Sonderanfertigung oder Narashige	MF-900
Mikromanipulator	entweder Sonderanfertigung oder Burleigh PCS-6000 mit kundenspezifischem Piezo-Steuerjoystick	PCS-6300

Jede