Summary
وقد وضعنا مقايسة المستندة إلى بولياكريلاميدي تنسيق متعدد جيدا لسبر تأثير صلابة المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة. هذا التحليل متوافق مع التدفق الخلوي، وإيمونوستينينج، ومجهر القوة الجر، مما يسمح للقياسات الكمية للنشاط الحيوي تفاعلات بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية، والبكتيريا المسببة للأمراض.
Abstract
تصلب المصفوفة خارج الخلية تضم واحداً من المحفزات الميكانيكية البيئية متعددة معروفة جيدا للتأثير على السلوك الخلوية، ومهام، ومصير عموما. على الرغم من أن تتسم متزايدة أكثر من خلية ملتصقة أنواع الردود على صلابة مصفوفة، كيف تمسكا الخلايا التعرض للعدوى البكتيرية يعتمد على صلابة مصفوفة مجهولة إلى حد كبير، كما هو أثر العدوى البكتيرية على الميكانيكا الحيوية للخلايا المضيفة. نحن افترض أن قابلية خلايا المضيف بطانية لعدوى بكتيرية يعتمد على صلابة المصفوفة التي تتواجد هذه الخلايا، وأن انتقال العدوى إلى المضيف الخلايا مع البكتيريا ستتغير الميكانيكا الحيوية. لاختبار هذه الفرضيات اثنين، ممرض نموذجي خلايا بطانية كنموذج المضيفين و الليستريه المستوحدة . النامية تحليل رواية تنسيق متعدد جيدا، نظهر أن أثر صلابة مصفوفة على عدوى خلايا البطانية لام الليستريه يمكن تقييمها كمياً عن طريق التدفق الخلوي و immunostaining متبوعاً بالفحص المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مجهر القوة الجر، أثر العدوى الليستريه L. في الميكانيكا الحيوية غشائي خلية المضيف يمكن دراستها. تسمح الطريقة المقترحة لتحليل تأثير ميكانيكا النسيج ذات الصلة على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة، الذي يعد خطوة حاسمة نحو فهم التفاعلات النشاط الحيوي بين الخلايا، وهذه المصفوفة خارج الخلية، و البكتيريا المسببة للأمراض. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع أخرى من الدراسات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية في الخلية واستجابة لتصلّب الركيزة حيث من المهم أن تكون قادرة على أداء replicates عديدة في نفس الوقت في كل تجربة.
Introduction
الخلايا في الأنسجة الحيوانية الأكثر عادة ملتصقة، إرفاق كل من الخلايا المجاورة وهذه المصفوفة خارج الخلية (ECM). مرسى الخلايا لإدارة المحتوى في المؤسسة أمر بالغ الأهمية للعديد من العمليات الخلوية التي تتراوح من حركية خلية خلية الانتشار والبقاء على قيد الحياة1،2. مرسى الخلوية لإدارة المحتوى في المؤسسة يعتمد على كل من تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة وصلابة. الخلايا التي تستجيب للتغيرات في هذا الأخير بإعادة ترتيب بشكل حيوي على سيتوسكيليتون، والالتصاقات ECM خلية وخلية خلية، مما يغير بدوره حاسمة خلية الميكانيكا الحيوية ووظائف3،،من45،6 . يمكن أن تختلف صلابة ECM في الفضاء (أيموقع التشريحية)، في الوقت المناسب (أي، الشيخوخة)، وفي العمليات الفيزيولوجية المرضية (مثلاً، وتصلب الشرايين، والسرطان، والعدوى، إلخ). على سبيل المثال، من المقبول على نطاق واسع أن غشائي الخلايا الموجودة على تشديد-بالمقارنة مع ليونة مصفوفات بذل زيادة القوات إدارة المحتوى في المؤسسة وبعضها البعض ويحمل زيادة حركية وانتشار7،من8. وبالمثل، الليفية المقيمين في مصفوفات أغلظ نقل قوات الهوس عالية لإدارة المحتوى في المؤسسة على وإظهار زيادة انتشار وحركية، وإدارة المحتوى في المؤسسة إنتاج9،،من1011. على الرغم من أن ميكانيكا الخلية واستجابة لتصلّب إدارة المحتوى في المؤسسة وقد درست على نطاق واسع لمختلف أنواع الخلايا، العلاقة بين الخلايا المضيفة ملتصقة، تصلب إدارة المحتوى في المؤسسة، والعدوى البكتيرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.
لدراسة دور صلابة ECM في تفاعلات الخلية البكتيريا المضيفة، اختير لام الليستريه (Lm) الممرض النموذجي. لم هو بكتيريا تنقلها الأغذية في كل مكان يمكن أن تسبب العدوى المجموعية في مجموعة متنوعة واسعة من المضيفين الثدييات. يمكن نقل هذا الممرض داخل الخلايا اختياري من ظهارة الأمعاء إلى الأجهزة البعيدة بمروره بأنواع مختلفة من الجهاز الوعائي. إذا أنها تخرق حاجز الدم في الدماغ، لم يمكن أن يسبب التهاب السحايا، وعندما يعبر المشيمة، فإنه يمكن أن يسبب الإجهاض العفوي12،13. يمكن أن تصيب مضيف مختلف أنواع الخلايا Lm ويمكن القيام بذلك باستخدام استراتيجيات متميزة المسببة للأمراض. ودرست العدوى Lm معظمها في سياق الخلايا الظهارية، بينما يعرف أقل بكثير عن كيف يمكن أن تصيب Lm وتجاوز خلايا بطانية بطانة التجويف الأوعية الدموية14،،من1516. وعلاوة على ذلك، أنها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير كيف ينظم صلابة لإدارة المحتوى في المؤسسة التي يقيم فيها خلايا بطانية Lm للقدرة على غزو هذه الخلايا المضيفة وانتشرت بعد ذلك. Lm وعدة أنواع بكتيرية إضافية (أي، باركيري الريكتسية) الاستفادة من cytoskeleton أكتين المضيفة غزو في السيتوبلازم الخلايا أنها تصيب على حد سواء وتيسير نشر خلية إلى17 , 18 , 19. أنها تحقيق ذلك من خلال التعبير عن البروتينات التي تمكنهم من التدخل في مسارات بلمرة الأكتين المضيف وإنتاج أكتين ذيول المذنبات التي تيسر على الدفع إلى الأمام16،20. نتيجة للإصابة، أكتين سيتوسكيليتون للخلية المضيفة يحتاج إلى إعادة ترتيبها بشكل حيوي بطريقة لا تزال غير كاملة تتسم، يحتمل أن تؤثر على الميكانيكا الحيوية الخلايا المضيفة بما في ذلك القوات المادية التي يبذلونها إدارة المحتوى في المؤسسة وعلى كل الأخرى. لدراسة هذه العمليات، اختيرت البشرية خلايا بطانية microvascular (هميك-1) نموذج الخلايا المضيفة لثلاثة أسباب: 1-تعرف خلايا بطانية لتكون الغاية ميتشانوسينسيتيفي كما أنهم يتعرضون باستمرار لاختلاف21من الرموز المادية؛ 2-استراتيجيات Lm توظف لتصيب خلايا بطانية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير22؛ و 3. هميك-1 هي خط خلية مخلدة ويمكن، لذلك، بسهولة مثقف وتعرض للتلاعب بالجينات.
وقد العدوى البكتيرية من الخلايا المضيفة معظمهم درس في المختبر بزرع الخلايا على الزجاج أو البوليستيرين الركازات التي أشد كثيرا مما ECM الفسيولوجية لمعظم الخلايا12،،من1423. دراسة عدوى الخلايا المصنفة في مصفوفة التي تصلب من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة، وتوضيح دور صلابة ECM على عدوى الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية، اتبعنا نهج مبتكر يستند إلى اختﻻق رقيقة الهلاميات المائية جزءا لا يتجزأ من ميكروبيد polyacrylamide من تيبس الانضباطي في لوحات متعددة جيدا. تكمن جدة النهج المقترح يسمح رصد ظروف متعددة في وقت واحد بسبب شكلها متعددة جيدا، وفي هذا ومتوافق مع تقنيات متعددة بسبب طريقة خاصة مبنية ركائز. هميك-1 الخلايا المصنفة في هذه الهلاميات المائية المغلفة بالبروتين وثم المصابين بسلالات مختلفة لم تصبح الفلورسنت عند تدخيل أو أنها مؤثرا الفلورسنت. وتم تقييم دور صلابة ECM على قابلية الإصابة بالخلايا المضيفة هميك-1 بالتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت الفحص المجهري إيمونوستينينج والأسفار للتفريق بين البكتيريا المنضمة والمدخلة. أخيرا، أجرى الفحص المجهري قوة الجر (ينص) بنجاح لتميز أثر العدوى Lm في الجر وتشدد على أن تمارس خلايا المضيف بطانية على تلك المصفوفات أثناء الإصابة. يمكن بسهولة تعديل المقايسة المقدمة لتمكين مزيد من دراسات بشأن تأثير صلابة ECM على قابلية العدوى من الخلايا ملتصقة باستخدام خطوط مختلفة الخلية أو مسببات الأمراض.
Protocol
1-تصنيع الهلاميات المائية Polyacrylamide اثنان طبقات رقيقة (السلطة الفلسطينية) على لوحات متعددة جيدا
- تذوب فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) في الماء المقطر عالي النقاوة لتحقيق تركيز نهائي 10 جرام/مل. قاسمة ومخزن الحل عند 4 درجة مئوية للاستخدام القصير الأجل (3 أسابيع).
ملاحظة: يمكن إعداد الحل أعلاه قبل تلفيق المائية. -
تنشيط الزجاج من الأطباق 24-جيدا
- احتضان لوحات أسفل الزجاج 24-جيدا مع 13 بئرا مم (انظر الجدول للمواد) على ح 1 مع 500 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 2 الواحدة وكذلك في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الآبار 1 x مع الماء عالي النقاوة وقم بإضافة 500 ميليلتر من تريثوكسيسيلاني 2% (3-أمينوبروبيل) (انظر الجدول للمواد) في الإيثانول 95% لكل منهما جيدا لمدة 5 دقائق.
- شطف الآبار 1 x مرة أخرى مع الماء وإضافة 500 ميليلتر من glutaraldehyde 0.5% لكل بئر للحد الأدنى 30 شطف الآبار 1 x بالماء وتجفيفها في ˚C 60 مع الغطاء.
الشكل 1 : فحص العدوى البكتيرية من الخلايا المضيفة المقيمين في الهلاميات المائية رقيقة الطبقات اثنين الفلورسنت جزءا لا يتجزأ من حبة polyacrylamide (السلطة الفلسطينية) من صلابة متفاوتة. ألف يتم تعديل كوفيرسليبس الزجاج كيميائيا لتمكين المرفق المائية. ب-تودع 3.6 ميليلتر من الخلائط السلطة الفلسطينية في قيعان الزجاج. ج-الخليط مغطى ساترة زجاجية دائرية 12 ملم لتمكين البلمرة. د. تتم إزالة ساترة بحقنه إبرة. ه-إضافة مقدمة الطبقة السفلي ميليلتر 2.4 إلى حل السلطة الفلسطينية مع ميكروبيدس وتوج مع ساترة زجاجية دائرية. و-يتم إضافة مخزن مؤقت في البئر وهو إزالتها ساترة. ز-يضمن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية ح 1 التعقيم. ح-إضافة حل سالفو سانبة-المحتوية على المواد الهلامية، التي توضع ثم تحت الأشعة فوق البنفسجية للحد الأدنى 10 أنا. الهلاميات المائية غسلها مع مخزن مؤقت وثم المحتضنة بين عشية وضحاها مع الكولاجين أولاً ي. هو اكويليبراتيد المائية مع الوسائط المحمولة. ك-هي المصنفة الخلايا المضيفة. ل. البكتيريا Lm يتم إضافتها إلى الحل وتتم مزامنة العدوى عن طريق الطرد المركزي. م. ح 1 ما بعد الإصابة بالبكتيريا في الحل هي جرف ويتم إضافة الوسائط وتستكمل مع المضادات الحيوية. ن. ح 4 ما بعد الإصابة، يبدأ Lm (JAT985) الاستشعاع. س. يتم فصل الخلايا هميك-1 من هذه المصفوفة، والحلول التي يتم نقلها إلى أنابيب لإجراء قياسات التدفق الخلوي. علما بأن يشار إليها أيضا الأيام والأوقات التقريبية لكل خطوة التحليل. وقد تم تعديل هذا الرقم من باستونيس وثيريوت59. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
-
تصنيع هيدروجيل polyacrylamide
ملاحظة: انظر 1 الشكل.- تحضير المحاليل التي تحتوي على 3-10% حل الاكريلاميد الأسهم 40% (انظر الجدول للمواد) و 0.06-0.6% 2% الأسهم الحل مكررا-اكريلاميد (انظر الجدول للمواد) لتصنيع الهلاميات المائية صلابة الانضباطي تتراوح بين 0.6 الجيش الشعبي الكوري إلى 70 كيلو باسكال. انظر الجدول 1.
- ل 0.6 الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية، مزيج من الاكريلاميد 3% مع 0.045% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 3 الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 5% 0.074% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 10 كيلو باسكال الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 10% 0.075% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 20 كيلوباسكال الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 8% 0.195% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 70 كيلو باسكال الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 10% 0.45 في المائة مكررا-مادة اكريلاميد.
ملاحظة: تفاصيل إضافية بشأن تحقيق صلابة هيدروجيل السلطة الفلسطينية المرغوب فيه ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى24،25،،من2627.
- ل 0.6 الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية، مزيج من الاكريلاميد 3% مع 0.045% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 3 الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 5% 0.074% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 10 كيلو باسكال الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 10% 0.075% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 20 كيلوباسكال الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 8% 0.195% مكررا-مادة اكريلاميد. ل 70 كيلو باسكال الهلاميات المائية، يخلط الاكريلاميد 10% 0.45 في المائة مكررا-مادة اكريلاميد.
- إعداد المحاليل اثنين لكل صلابة المائية المرغوب فيه. إعداد 1 الحل أن تكون خالية من حبة و 2 الحل لاحتواء 0.03% 0.1 ميكرومتر القطر الفلورسنت الصغيرة-الخرز (انظر الجدول للمواد).
- ديغا حلول 1 و 2 بفراغ لمدة 15 دقيقة للقضاء على الأوكسجين التي من المعروف أن تمنع بلمرة الحلول.
- إضافة 0.6 في المائة من الأسهم 10 جرام/مل الحل APS و 0.43% تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) إلى 1 الحل لتمكين بدء بلمرة. التصرف بسرعة.
- إضافة ميليلتر 3.6 1 الحل إلى المركز من كل بئر للطبق 24-جيدا (راجع الخطوة 1.2 لإعداده).
- فورا تغطية الآبار مع 12 ملم كوفيرسليبس التعميم غير المعالجة وترك حل 1 الجلوس لمدة 20 دقيقة، حيث أن ذلك بوليميريزيس تماما.
- اضغط بلطف إبرة محقن إلى سطح لإنشاء ربط صغيرة في طرفها لتسهيل إزالة كوفيرسليبس. ورفع كوفيرسليبس استخدام الإبرة المحاقن.
- إضافة 0.6 في المائة الحل APS الأسهم 10 جرام/مل و 0.43% تيميد للحل 2. إيداع ميليلتر 2.4 من الخليط فوق الطبقة الأولى في كل بئر للطبق 24-جيدا.
- تغطية 2 الحل مع كوفيرسليبس 12 ملم زجاج دائرية، بلطف الضغط أسفل باستخدام زوج من الملقط للتأكد من سمك الطبقة الثانية الحد الأدنى. واسمحوا 2 حل بلمرة لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 500 ميليلتر من 50 مم حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5 إلى كل من الآبار ومن ثم إزالة كوفيرسليبس الزجاج بإبرة المحقن والملقط.
- تحضير المحاليل التي تحتوي على 3-10% حل الاكريلاميد الأسهم 40% (انظر الجدول للمواد) و 0.06-0.6% 2% الأسهم الحل مكررا-اكريلاميد (انظر الجدول للمواد) لتصنيع الهلاميات المائية صلابة الانضباطي تتراوح بين 0.6 الجيش الشعبي الكوري إلى 70 كيلو باسكال. انظر الجدول 1.
-
التعقيم والكولاجين-طلاء والموازنة polyacrylamide الهلاميات المائية
- الأشعة فوق البنفسجية-فضح الهلاميات المائية ح 1 في هود زراعة الأنسجة للسماح للتعقيم.
- إعداد خليط من 0.5% وزن/حجم سولفوسوكسينيميديل 6-(4-أزيدو-2 '--نيتروفينيلامينو) هيكسانواتي (سالفو-سانبة، انظر الجدول للمواد) في حموضة حبيس [دمس] و 50 مم 1% = 7.5.
- إضافة 200 ميليلتر لهذا الحل إلى السطح العلوي من الهلاميات المائية. تعمل بسرعة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية (302 نيوتن متر) لمدة 10 دقائق لتفعيلها.
- أغسل الهلاميات المائية مرتين مع 1 مل حموضة حبيس 50 مم = 7.5. تتم إزالة التكرار إذا لزم الأمر للتأكد من أن أي كروسلينكير الزائدة.
- البروتين-معطف الهلاميات المائية مع 200 ميليلتر من الفئران 0.25 مغ/مل الذيل الكولاجين أنا (انظر الجدول للمواد) في 50 مم حبيس. احتضان الهلاميات المائية، مع أن الحل الكولاجين في الأعلى، بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: لمنع الجفاف/التبخر ووضع لوحات متعددة جيدا في احتواء ثانوي وإضافة مختبر تنظيف الأنسجة غارقة في المياه في المحيط الداخلي للاحتواء. - استخدام ابيفلوريسسينسي أو مجهر [كنفوكل] مع هدف X 40 لقياس سمك الهلاميات المائية. القيام بذلك عن طريق تحديد موقع z ومواقف الجزء السفلي (حيث سطح الزجاج) وأعلى الطائرات المائية (حيث كثافة الخرز نيون الحد الأقصى). ثم طرح مواقف z لتحديد الارتفاع.
ملاحظة: كنا مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي وهدف X 40 مع الفتحة العددية 0.65 قياس سمك الهلاميات المائية. يمكن أيضا إجراء قياسات "مجهر القوة" الذرية (AFM) في هذه المرحلة لتأكيد صلابة الدقيق من الهلاميات المائية (انظر الشكل 2). - قبل البذر الخلايا الفائدة على الهلاميات المائية، إضافة 1 مل من وسائط الإعلام على الهلاميات المائية واحتضانها لهم في ˚C 37 لمدة 30 دقيقة إلى ح 1 لضمان الموازنة.
ملاحظة: نحن إضافة مكدب-131 كامل وسائل الإعلام بسبب أن وسائل الإعلام حيث كانت مثقف الخلايا المضيفة النموذجي (هميك-1) في (راجع الخطوة 2، 1 لمزيد من التفاصيل).
الشكل 2: فؤاد قياسات صلابة هيدروجيل السلطة الفلسطينية وتوزيع حبات. أ-تظهر البيانات معامل التحويل المتوقعة للشباب (مقياس لصلابة) التابعة للسلطة الفلسطينية الهلاميات المائية، نظراً للكمية من مادة اكريلاميد ومكررا-الاكريلاميد تستخدم مقابل معامل يونغ يقاس من خلال فؤاد (N = 5-6). تصوير أشرطة أفقية يعني. لا يمكن قياسها تصلب الهلاميات المائية الجيش الشعبي الكوري 0.6 سبب الهلاميات المائية كانت لينة جداً ويلتزم نصيحة فؤاد. ب. هذا صورة مرحلة المتلاقية هميك-1 الخلايا والصورة المقابلة من الخرز المضمنة على السطح العلوي للمائية الجيش الشعبي الكوري 3 لينة-السلطة الفلسطينية. كانت تبذر هميك-1 ح 24 بتركيز 4 × 105 خلايا كل بئر. ج. هذه الصورة هو نفس الرقم 2ب لكن للخلايا المقيمة على المائية السلطة الفلسطينية شديدة 70-الجيش الشعبي الكوري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
2. البشرية الخلية البطانية Microvascular الثقافة والبذر في الهلاميات المائية
- الثقافة هميك-1 (الإنسان، microvascular بطانية) خلايا في مكدب-131 كامل الوسائط التي تحتوي على وسائط الإعلام مكدب-131 وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 10 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة، 1 ميكروغرام/مل من الهيدروكورتيزون، ومم 2 للأم الجلوتامين (انظر "الجدول للمواد" ).
- تقسيم الثقافات المتلاقية 1:6 كل 3-4 أيام وتبقى الخلايا حتى سن 40.
- يوم واحد قبل التجربة، فصل الخلايا من سفينتهم ثقافة استخدام 0.25% التربسين/يدتا. أولاً تغسل الخلايا وسفينتهم الثقافة 1 x مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، ثم قم بإضافة المقدار المناسب من 0.25% التربسين/يدتا (2 مل كل طبق 100 ملم أو قارورة 75 سم، 1 مل كل طبق 60 ملم أو قارورة 25 سم)، حضانة قارورة في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة للسماح لمفرزة الخلايا من هذه الركيزة.
- تحييد التربسين بإضافة وحدة التخزين المطلوبة مكدب-131 كامل وسائل الإعلام، بيبيت بلطف تفتيت كتل الخلايا، ومن ثم ضع الحل في أنبوب مخروطي أجهزة الطرد مركزي.
- بلطف دوامة الحل للخلايا للتأكد من أن الخلايا وتوزع بالتساوي، وثم تأخذ بها 20 ميليلتر من الحل وملء بلطف جداً الدائرتين تحت ساترة من هيموسيتوميتير الزجاج.
- بيليه أسفل حل الخلايا الموجودة في الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي باستخدام الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 500 x ز.
- خلال فترة الانتظار 10 دقائق، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. استخدام مجهر والتركيز على خطوط الشبكة من هيموسيتوميتير مع هدف X 10، ومن ثم استخدام عداد حصيلة مباشرة لحساب عدد الخلايا في أحد 1 مم × 1 مم مربع.
- الانتقال هيموسيتوميتير إلى آخر 1 مم × 1 مم مربع، عد الخلايا هناك وثم كرر هذه العملية مرتين أخريين. حساب متوسط القياسات الأربعة وثم ضرب المتوسط 104. القيمة النهائية هو عدد خلايا/مل قابلة للاستمرار في تعليق الخلية التي يتم يتم تثفيل.
- إزالة السائل خارج الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي مع ضمان أن لا تتعطل بيليه الخلية. ريسوسبيند الخلايا في وسائط الإعلام كامل مكدب-131 بتركيز 4 × 105 خلايا/مل.
- بذور الخلايا في تعليق على الهلاميات المائية أولاً إزالة الوسائط التي كانت المحتضنة الهلاميات المائية وثم إضافة 1 مل تعليق خلية في كل المائية.
3-العدوى البشرية خلايا بطانية Microvascular مع الليستريه ل.
- الإعداد المسبق
ملاحظة: إعداد الحلول التالية مقدما.-
ستربتوميسين، كلورامفينيكول، والجنتاميسين الأرصدة
- إعداد 50 ملغ/مل ستربتوميسين الحلول المخزون حسب وزنها 0.5 جم كبريتات ستربتوميسين وحلها تماما في 10 مل الماء عالي النقاوة.
- إعداد حلول الأسهم 7.5 ملغ/مل الكلورامفينيكول وزنها 75 ملغ الكلورامفينيكول وحلها تماما في 10 مل إيثانول 100%.
- إعداد 20 ملغ/مل جنتاميسين حلول الأسهم التي تزن 0.2 جم كبريتات الجنتاميسين وحلها تماما في 10 مل الماء عالي النقاوة.
- تصفية تعقيم جميع الحلول الأسهم مع فلتر 0.2 ميكرون المحاقن وتخزينها في-20 درجة مئوية لاستخدامه على المدى الطويل (1-2 أشهر).
-
الدماغ القلب ضخ (بهي) وسائط الإعلام واجار لوحات
- موقع اثنين 1-L قوارير وإضافة شريط إثارة مغناطيسية داخل كل قارورة.
- لوسائط الإعلام، وبهي إضافة 37 جم مسحوق بهي في قارورة واحدة وإضافة الماء عالي النقاوة حتى 1 ل. مزيج الحل بقوة عن طريق وضع في قارورة على طبق من إثارة مغناطيسية حتى يذوب المسحوق.
- لوحات أجار بهي، إضافة 37 ز مسحوق بهي و 15 غرام من حبيبات أجار (انظر الجدول للمواد) في قارورة ثانية وإضافة الماء عالي النقاوة حتى 1 ل. مزيج الحل بقوة عن طريق وضع في قارورة على طبق من إثارة مغناطيسية حتى يذوب المسحوق.
- برغي الأغطية قوارير لا مسرف والاوتوكلاف الحلول استخدام السائل الإعداد أو وفقا للمواصفات اﻷوتوكﻻف.
- إزالة الحل من اﻷوتوكﻻف، ثم يبرد الحل أجار-بهي إلى 55 درجة مئوية. إذا كان يتم الاحتفاظ الوسائط بهي في قارورة 1 لتر عقيمة، يمكن استخدامه لتصل إلى شهر.
- إعداد البكتيريا لوحات بهي أجار، أولاً بإضافة المضادات الحيوية، إذا كان ذلك مناسباً، أن قارورة تحتوي على بهي واجار (اعتماداً على السلالات البكتيرية زراعتها). بإيجاز وضع في قارورة على صفيحة إثارة مغناطيسية للسماح بالاختلاط سريعة.
ملاحظة: المضادات الحيوية المستخدمة هنا محددة على سلالات Lm المستخدمة، ولكن يمكن استخدام أي المضادات الحيوية اللازمة في لوحات بهي-أجار. أضفنا ستربتوميسين بتركيز 200 ميكروغرام/مل والكلورامفينيكول بتركيز 7.5 ميكروغرام/مل لأن 10403S Lm سلالات مقاومة والستربتوميسين. وكانت هذه السلالات مترافق مع بلازميد يحتوي الكلورامفينيكول أسيتيلترانسفيراسي القراءة فتح الإطار، ومن ثم مقاومة الكلورامفينيكول. - صب الخليط في 10 سم البكتيريا البوليستيرين الثقافة اللوحات (حوالي 20 مل للوحة الواحدة). للتخلص من الفقاعات، شعلة السطح العلوي من اللوحات بإيجاز. لوحات باردة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- وفي اليوم التالي ختم لوحات جافة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
-
ستربتوميسين، كلورامفينيكول، والجنتاميسين الأرصدة
- العدوى البشرية خلايا غشائي microvascular مع الليستريه ل.
- ثلاثة أيام قبل الإصابة، سلالة الانتصارات خارجاً Lm ليتم استخدامها من مخزون والغليسيرول (المخزنة في-80 درجة مئوية) على طبق أجار بهي يحتوي على 7.5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 200 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين، إذا كان ذلك مناسباً.
ملاحظة: الضغط أن السنة اللهب أثناء الخروج يمكن أن يكون البرية من نوع أو متحولة، مؤثرا معربا عن الأسفار (بالنسبة إيمونوستينينج واستخدمت JAT1045) أو التعبير عن الأسفار تحت المروج ActA (للتدفق الخلوي أو الجر مجهر القوة JAT983 أو JAT985 واستخدمت)22. - احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية حتى يتم تشكيل مستعمرات منفصلة (1-2 أيام).
- في اليوم قبل الإصابة، تنمو إلى الضغط المطلوب بين عشية وضحاها، تهتز لها عند 150 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية في وسائل الإعلام بهي مع 7.5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول (إذا كان ذلك مناسباً).
- مل 5 مكان وسائط بهي في أنبوب 15 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي, إضافة 7.5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول (إذا كان ذلك مناسباً)، وتطعيم ثم مستعمرة واحدة من لوحة أجار استخدام تلميح 10 ميليلتر عقيمة.
- وفي اليوم التالي قبل الإصابة، قياس الكثافة الضوئية للحل البكتيريا في 600 نانومتر (OD600) بتمييع عينة 1:5؛ استخدام ومبومو تتضمن بهي وحدها لتكون بمثابة قرص فارغ.
- تمييع الثقافة بين عشية وضحاها إلى OD600 0.1 واحتضانها، تهتز ح 2 في 30 درجة مئوية، وفي وسائل الإعلام بهي مع 7.5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول (إذا كان ذلك مناسباً) للسماح للبكتيريا للوصول إلى سجل--مرحلة النمو.
- قياس OD600 الحل البكتيرية، التي من المتوقع أن يكون حوالي 0.2-0.3. إذا كان OD600 أعلى، تمييع إلى 0.2-0.3 مع بهي وحدها.
- تأخذ 1 مل من محلول البكتيرية في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تدور إلى الأسفل لمدة دقيقة 4 في العاشر 2,000 ز استخدام الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 1 مل من برنامج تلفزيوني الصف زراعة الأنسجة، في هود زراعة الأنسجة. يغسل البكتيريا أكثر من مرتين خلال الغزل عليهم لمدة دقيقة 4 في 2,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية وريسوسبيند البكتيريا في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- إعداد مزيج العدوى عن طريق خلط 10 أو 50 ميليلتر من البكتيريا حراكه في برنامج تلفزيوني مع 1 مل الإعلام مكدب-131 كامل لعدد وافر عدوى (وزارة الداخلية؛ أي، العدد من البكتيريا كل خلية المضيف) من البكتيريا 50 تقريبا كل خلية المضيف أو البكتيريا 10 كل خلية المضيف.
- قم بإزالة الوسائط من آبار لوحات 24-جيدا، والحرص على عدم الإخلال الهلاميات المائية أو الخلايا. تغسل الخلايا 1 x مع 1 مل 131 مكدب كامل وسائل الإعلام ثم قم بإضافة 1 مل البكتيريا لكل بئر.
- الاحتفاظ ببعض المزيج العدوى (على الأقل 100 ميليلتر) لتحديد موي (راجع الخطوة 3، 3).
- تغطية اللوحة مع غطاء لها والتفاف اللوحات مع البولي إثيلين الغذائي التفاف لتجنب تسرب. وضع اللوحات في أجهزة الطرد المركزي وتدور العينات لمدة 10 دقيقة في 200 غ س لمزامنة الغزو. نقل اللوحات إلى حاضنة استنبات الأنسجة واحتضانها لهم لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تغسل العينات 4 x مع مكدب-131 كامل الوسائط ونقلها إلى حاضنة استنبات الأنسجة. بعد 30 دقيقة إضافية، تحل محل وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام وتستكمل مع 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين.
- ثلاثة أيام قبل الإصابة، سلالة الانتصارات خارجاً Lm ليتم استخدامها من مخزون والغليسيرول (المخزنة في-80 درجة مئوية) على طبق أجار بهي يحتوي على 7.5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 200 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين، إذا كان ذلك مناسباً.
- تصميم لتعدد العدوى (وزارة الداخلية)
- أثناء الاحتضان 30 دقيقة الأولى للخلايا المضيفة بالبكتيريا، إعداد الوقت تخفيف المسلسل من مزيج العدوى لتحديد وزارة الداخلية. جعل تخفيف إذ بخلط 100 ميليلتر من مزيج العدوى مع 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (التخفيف 10-1 ). ثم، مزيج 100 ميليلتر من التخفيف 10-1 مع 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (تمييع 10-2 ).
- تستمر حتى يتم الحصول على 10-5 إضعاف.
ملاحظة: جميع الحلول بحاجة إلى أن تكون مختلطة قبل تمييع لهم، وينبغي أن تستخدم نصائح ماصة نظيفة جديدة في كل خطوة. - حالما تتم تخفيف، ضع 100 ميليلتر من 10-2 -10-5 تخفيف على المركز لوحات بهي/أجار/الكلورامفينيكول/ستربتوميسين (إذا كان ذلك مناسباً).
- جعل الناشرة من ماصة زجاجية باستخدام النار لثني ماصة لإنشاء ربط. تراجع الماصة في الإيثانول 100% للتعقيم ويحرق ثم الإيثانول بلهب.
- مرة واحدة قد بردت الناشرة، انتشرت تخفيف البكتيرية البلوتينيوم على لوحات اعتبارا من تمييع 10-5 ونقل إلى يمزج أكثر تركيزاً. احتضان لوحات رأسا على عقب في 37 درجة مئوية لمدة يومين.
- اعتماداً على كثافة مستعمرة، تحديد عدد المستعمرات من أما 10-3 و 10-4 أو 10-4 و 10-5 إضعاف لوحات. حساب وزارة الداخلية على النحو التالي:
عدد المستعمرات × إضعاف عامل ÷ حجم الأولى أضيف = عدد من زيمبابوي كل ميليلتر
عدد زيمبابوي كل ميليلتر × حجم البكتيريا ميكس كل بئر = عدد زيمبابوي في بئر
عدد زيمبابوي الواحدة وكذلك × حجم الخلايا في البئر = عدد من البكتيريا كل خلية
ملاحظة: تقف زيمبابوي مستعمرة تشكيل وحدات. - متوسط أشهر من لوحات اثنين للحصول على أشهر الأخيرة.
4-التدفق الخلوي لقياس صلابة المصفوفة خارج الخلية تعتمد قابلية الخلايا المضيفة للإصابة
- تزن 5 ملغ كولاجيناز ووضعه في أنبوب 15 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. أضف 10 مل من 0.25% التربسين-يدتا ومزجها جيدا.
- ح 8 ما بعد الإصابة، قم بإزالة الوسائط من الآبار التي بليت 24-جيدا وغسل الآبار 1 x مع زراعة الأنسجة PBS. إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة 200 ميليلتر من مزيج التربسين-يدتا/كولاجيناز لكل بئر. ضع هذا في الحاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقيقة للسماح لكتيبة كاملة من الخلايا.
- استخدام ماصة جديدة لكل بئر وبيبيت مزيج صعودا وهبوطاً 8 x. أن يكون لطيف كي لا تلحق الضرر الخلايا. إضافة 200 ميليلتر لوسائل الإعلام الكامل لكل بئر لتحييد التربسين.
- نقل الحل خلية 400 ميليلتر من كل بئر في أنبوب البوليستيرين 5 مل مع غطاء مصفاة خلية 35 ميكرون (انظر الجدول للمواد).
- تحليل الخلايا 10,000 20,000 كل عينة بالتدفق الخلوي. قم بالحصول على البيانات من خلال التدفق الخلوي وتحديد النسبة المئوية للخلايا المصابة الواحدة وكذلك استخدام برمجيات متاحة تجارياً ذات صلة. استخدام مبعثر الأمام مقابل الجانب التبعثر مؤامرات لبوابة الجزء الأكبر توزيع التهم الخلية.
ملاحظة: هذا سوف تضمن تحليلاً للخلايا المفردة وإزالة الحطام أو doublets الخلية أو ثلاثة توائم.- قياس إشارة الأسفار من وقاية مراقبة الخلايا وبوابة سكان الخلايا المصابة باستثناء أوتوفلوريسسينسي.
5-إيمونوستينينج البكتيريا خارج الخلية، والفحص المجهري ومعالجة الصور
ملاحظة: يتم اتباع هذا النهج للتفريق بين صلابة ECM التصاق البكتيرية تعتمد على سطح الخلايا المضيفة مقابل استيعاب البكتيرية (الغزو) داخل المضيفين.
الشكل 4 : Immunostaining المصابة Lm هميك-1 الخلايا المقيمين في الهلاميات المائية صلابة متفاوتة للتفريق بين البكتيريا الالتصاق مقابل الغزو. وتظهر هذه الصور مثال ممثل immunostaining تفاضلي عرض A. نواة الخلية (DAPI)، ب. جميع البكتيريا (التجارة والنقل)، وج. البكتيريا خارج (أليكسا-546). الخلايا هميك-1 يقيمون في المائية ناعمة 3-الجيش الشعبي الكوري. وتشير الأسهم البكتيريا التي قد تم استيعابه، حتى تظهر على قناة الأخضر فقط. تشير البيانات في د-و إلى N = 20 من الصور التي تم التقاطها للخلايا المصابة هميك-1 المقيمة على الناعمة 3-الجيش الشعبي الكوري والهلاميات المائية الشديدة 70-الجيش الشعبي الكوري وتبين د. البكتيريا مجموع كل النوى؛ ﻫ-البكتيريا المدخلة كل النوى؛ و و-كفاءة الغزو (نسبة البكتيريا المدخلة إلى مجموع البكتيريا). تصوير أشرطة أفقية يعني للبيانات. فحسبت القيمة مع اختبار "مجموع الدرجة الرتبي" غير حدودي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- 30 دقيقة بعد الإصابة، أغسل هميك-1 الخلايا المصابة مع JAT1045 (Lm مؤثرا يعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)) x 4 مع وسائل الإعلام.
- بعد الغسيل الرابعة، مزيج 1 ميليلتر من 1 ملغ/مل صبغ هويشت مع 1 مل الإعلام كامل مكدب-131 وإضافته لكل بئر وصمة عار نويات الخلايا. وضع الخلايا في الحاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق.
- تغسل الخلايا 1 x مع برنامج تلفزيوني. إصلاح لهم مع مثبت غير بيرميبيليزينج إيمونوستينينج التفاضلية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة28.
ملاحظة: يتضمن مثبت 0.32 م السكروز، الأس الهيدروجيني 10 ملم مس 6.1، 138 مم بوكل، 3 مم مجكل2, 2 مم عطا، و 4% فورمالدهايد (الميكروسكوب الإلكتروني الصف). - تغسل الخلايا 1 x مع برنامج تلفزيوني. كتلة العينات لمدة 30 دقيقة مع ألبومين المصل البقري 5 في المائة (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني.
- احتضان العينات ح 1 مع مكافحة--لمجسم الأولية (انظر الجدول للمواد) المخفف 1: 100 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% جيش صرب البوسنة.
- تغسل العينات في برنامج تلفزيوني 3 x واحتضانها لهم ثم ح 1 مع اليكسافلور-546 جسم الماعز-مكافحة-أرنب ثانوية (انظر الجدول للمواد) المخفف 1: 250 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% جيش صرب البوسنة. تغسل العينات 3 x في برنامج تلفزيوني. تخزين العينات في 1 مل من برنامج تلفزيوني للتصوير.
- صورة وتحليل الخلايا 1,000 أكثر من كل شرط.
- للتصوير، استخدم مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي مع كاميرا CCD (انظر الجدول للمواد) و 40 × الهدف الجوي فلوريت الخطة الجوية مع الفتحة العددية 0.6 (غ).
ملاحظة: يتم تعيين السلطة إلى 25% ووقت التعرض للسيدة 100 مجهر عوامل التصفية المستخدمة مشري هي 470/525 نانومتر، "بروتينات فلورية خضراء" 530/645 شمال البحر الأبيض المتوسط، و DAPI 395/460 نانومتر، للإثارة والانبعاثات على التوالي. المجهر استخدمنا تسيطر مصدر مفتوح مجهرية برمجيات حزمة29. - ل immunostaining التفاضلية، عد جميع البكتيريا 'الأخضر' المرتبطة بالخلايا الفردية ملتصقة. عد البكتيريا الموجودة سواء 'الأخضر' و 'الأحمر' (بسبب ربط جسم) كغير مستوعبة.
ملاحظة: حددنا عدد الأنوية بتشغيل البرنامج نصي مصنوعة خصيصا والبرمجيات سيلك (انظر الجدول للمواد) لتعداد البكتيريا30.
- للتصوير، استخدم مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي مع كاميرا CCD (انظر الجدول للمواد) و 40 × الهدف الجوي فلوريت الخطة الجوية مع الفتحة العددية 0.6 (غ).
6-مجهر القوة الجر متعددة جيدا وأحادي الطبقة الإجهاد مجهرية
الشكل 5: الخلايا المصابة Lm هميك-1 تقليل حجم قوي الجر التي يبذلونها في ECM بهم خلال العدوى. تظهر اللوحة الصورة، والمرحلة ب يظهر حقل تشوه، ج يظهر حقل الإجهاد الجر، ويظهر د مجال التوتر داخل الخلايا الخلايا هميك-1 مصابة المقيمة على المائية 20-الجيش الشعبي الكوري. أشرطة الألوان من التشوه الخرائط (ميكرومتر) وخرائط الإجهاد للجر (السلطة الفلسطينية) والتوتر داخل الخلايا تظهر الخرائط (nNµm-1) في الجزء العلوي من خرائط الحرارة. إظهار الأعمدة الثلاث النقاط الزمنية الممثل: العدوى بعد ح 3 و 8 و 18. ه-ح. نفس الألواح A-D ولكن للخلايا المصابة مع Lm في وزارة الداخلية 300. صور البكتيريا (القناة الحمراء) يتم فرضه على الصور المرحلة من الخلايا. وأجريت التسجيلات ينص بتصوير الآبار متعددة في وقت واحد. وكان حجم الإطار ل PIV 32 بكسل مع وجود تداخل 16. شريط مقياس هو 32 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من باستونيس وثيريوت59. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- تعد الهلاميات المائية السلطة الفلسطينية على طبق من 24-جيدا (راجع الخطوة 1). البذور هميك-1 الخلايا (راجع الخطوة 2) وتصيب منهم مع JAT983 كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 3).
- تعد وسيلة مجهرية تعيش بتكميل L-15 ليبوفيتش مع 10% مصل بقرى الجنين و 10 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة 1 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون.
ملاحظة: L-15 يحتوي بالفعل على 2 مم ل الجلوتامين، حيث أنه ليس من الضروري إضافة إضافية كما في حالة وسائل الإعلام مكدب-131. - مزيج ميكروليتر 1 1 ملغ/مل صبغ هويشت مع 1 مل الإعلام كامل L-15 ح 4 بعد الإصابة (عندما يبدأ JAT983 المدخلة الاستشعاع)، وإضافته لكل بئر وصمة عار نويات الخلايا. وضع الخلايا في الحاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق ثم قم باستبدال في كل بئر L-15 وسائل الإعلام الكامل مع 1 مل الإعلام الكامل L-15 وتستكمل مع 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين.
- غطاء لوحة بغطاء ومكان في الدائرة البيئية في المجهر (انظر الجدول للمواد) اكويليبراتيد إلى 37 ˚C.
ملاحظة: للتصوير، استخدم مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي مع كاميرا CCD (انظر الجدول للمواد) و 40 × الهدف الجوي فلوريت الخطة الجوية مع 0.6 na. - الحصول على صور متعددة القنوات الوقت الفاصل بين الخرز الفلورسنت والبكتيريا الفلورسنت، ومرحلة التباين الصور الخلايا المضيفة، كل 10 دقيقة ح 4 إلى 12.
ملاحظة: للتصوير، أنشئت السلطة إلى 25% ووقت التعرض للسيدة 100 مرشحات المجهر (الإثارة/الانبعاثات) المستخدمة مشري والتجارة والنقل هي 470/525 نانومتر و 530/645 نانومتر على التوالي. - في نهاية التسجيل، إضافة 500 ميليلتر من 10% الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في المياه في كل من الآبار.
ملاحظة: سيتم فصل الخلايا من المائية والمائية ستعود إلى حالتها الأولية أونديفورميد نظراً لأنها مرنة. - تأخذ صورة المائية واستخدامها كمرجع الصورة أونديفورميد.
- تحديد الأبعاد تشوه المائية في كل لحظة من الوقت باستخدام الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV)31، مقارنة كل صورة من سلسلة الوقت الفاصل مع صورة مرجعية المائية أونديفورميد. استخدام أحجام الإطارات المناسبة وتتداخل تبعاً للتجربة.
ملاحظة: قمنا باستخدام windows 32 بكسل مع وجود تداخل 16 بكسل. - حساب الجر 2D وتشدد على أن الخلايا المائية كما هو موضح في مكان آخر من،من3233.
- حساب التوتر أحادي الطبقة من الجر وتؤكد كما تم وصفه سابقا34 بحل معادلات التوازن الميكانيكي لصفيحة رقيقة مرنة رهنا برد فعل قوي تم إنشاؤها بواسطة هيدروجيل السلطة الفلسطينية في أحادي الطبقة، ومن مقابل علامة للجر المقاسة وتؤكد.
ملاحظة: انظر المواد التكميلية 1.
7-كمية مجهرية الوقت الفاصل لتقييم Extracellular-ماتريكس-صلابة التابعة لام الليستريه "نشرها من خلال خلايا بطانية"
الشكل 6: مجهرية كمية الوقت الفاصل بين بيانات عن طريق مونولاييرس هميك-1 نشر Lm المصنف على ركائز مع تصلب 3-الجيش الشعبي الكوري و 70-الجيش الشعبي الكوري. ألف يظهر هذا الفريق لا تزال الصور من بؤر العدوى الممثل اثنين في 0 و 200، 400 و 600 دقيقة. قناة المرحلة يصور مونولاييرس خلية هميك-1، والقناة الحمراء يصور Lm داخل الخلايا (راجع الخطوة 7 من البروتوكول). ب. يظهر هذا الفريق منطقة هال محدب يشمل التركيز العدوى المرسومة كدالة للزمن. مجال التركيز للشرط 3-الجيش الشعبي الكوري (أحمر) تنمو أسرع من 70-الجيش الشعبي الكوري (أخضر). جيم هذا الفريق يظهر المسافة شعاعي من المركز إلى الحافة من التركيز العدوى المرسومة كدالة للزمن للممثل بؤر الإصابة المتزايدة في مونولاييرس هميك-1 المصنف على ركائز السلطة الفلسطينية 3-كيلوباسكال (أحمر) وصلابة 70-الجيش الشعبي الكوري (أخضر). سرعة شعاعية (الدكتور/dt) ثابت للشرط 3-الجيش الشعبي الكوري، لكن ثنائية الطور للشرط 70-الجيش الشعبي الكوري. د. تظهر هذه البيانات سرعة شعاعي لأول 200 دقيقة من بؤر العدوى المستقلة عشرة. الأحمر (3-الجيش الشعبي الكوري) والأخضر (70-الجيش الشعبي الكوري) نقاط البيانات تصور منحدرات البؤر اثنين الموصوفة في الأفرقة السابقة. تصوير أشرطة أفقية يعني للبيانات. فحسبت القيمة مع اختبار "مجموع الدرجة الرتبي" غير حدودي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- تعد الهلاميات المائية السلطة الفلسطينية على طبق من 24-جيدا (راجع الخطوة 1)، بذور الخلايا هميك-1 (راجع الخطوة 2)، وتنمو بين عشية وضحاها JAT983 الثقافات كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 3).
- تعد يوم العدوى، مزيج العدوى بخلط 10 ميليلتر بيليه البكتيرية كل مل مكدب-131 كامل وسائل الإعلام. بعناية قم بإزالة الوسائط من آبار ألواح 24-جيدا، وإضافة 1.9 مل الإعلام كامل مكدب-131 و 0.1 مل من المزيج البكتيرية لكل بئر.
ملاحظة: وزارة الداخلية أقل المستخدمة في هذا التحليل ضروري لتحليل نشر الأحداث التي تبدأ من جرثومة واحدة غزو خلية المضيفة. - تغطية اللوحة مع غطاء لها، وختم ذلك بالتفاف بلاستيك لتجنب تسرب. وضع اللوحات في أجهزة الطرد المركزي وتدور العينات لمدة 10 دقيقة في 200 غ س لمزامنة الغزو.
- نقل اللوحات إلى حاضنة استنبات الأنسجة واحتضانها لهم لمدة 5 دقائق.
- تغسل العينات 4 x مع وسائل الإعلام ونقلها إلى حاضنة استنبات الأنسجة. بعد مين 5-7 إضافية، تحل محل وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام وتستكمل مع 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين.
- احتضان اللوحة في الحاضنة لإضافية ح 5 للسماح بالمروج actA لتشغيل ومحرك التعبير عن متاجرفب فتح قراءة الإطار35.
- تعد وسيلة مجهرية تعيش بتكميل L-15 ليبوفيتش مع 10% مصل بقرى الجنين و 10 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة 1 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون.
ملاحظة: L-15 يحتوي بالفعل على 2 مم ل الجلوتامين، حيث أنه ليس من الضروري إضافة إضافية كما في حالة وسائل الإعلام مكدب-131. - ميكروليتر 1 ميكس 1 ملغ/مل هويشت صبغ مع 1 مل الإعلام الكامل L-15 وإضافته لكل بئر وصمة عار نويات الخلايا. وضع الخلايا في الحاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق ثم قم باستبدال في كل بئر L-15 وسائل الإعلام الكامل مع 1 مل الإعلام الكامل L-15 وتستكمل مع 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين. غطاء لوحة بغطاء ومكان في الدائرة البيئية في المجهر (انظر الجدول للمواد) اكويليبراتيد إلى 37 ˚C.
ملاحظة: للتصوير، واستخدمت مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي مع كاميرا CCD (انظر الجدول للمواد) و 20 X الهدف الجوي فلوريت الخطة الجوية مع 0.75 na. تم تعيين السلطة إلى 50% ووقت التعرض للسيدة 50 مجهر عوامل التصفية المستخدمة مشري هي 470/525 نانومتر للإثارة والانبعاثات على التوالي. - صورة مواقف متعددة كل 5 دقائق باستخدام ميزة ضبط تلقائي لرصد كيفية انتشار Lm من خلال مونولاييرس هميك-1 المصنف على اختلاف صلابة الهلاميات المائية.
ملاحظة: L-15 مخزنة مع حبيس، حيث أنه ليس من الضروري استخدام CO2 أثناء التصوير.
Representative Results
إدارة المحتوى في المؤسسة قابلية الخلايا هميك-1 تعتمد على صلابة للعدوى Lm:
السلطة الفلسطينية الهلاميات المائية من صلابة متفاوتة، كل سطح المغلفة مع الكولاجين أنا، بنيت على لوحات أسفل الزجاج متعدد جيدا كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول (انظر الشكل 1). وأجريت قياسات فؤاد لتأكيد صلابة الدقيق من الهلاميات المائية، كما هو موضح سابقا26،27 (انظر الشكل 2). وقد أظهرت الدراسات السابقة أن امتثال الغشاء الطابق السفلي لخلايا بطانية المحلية يمكن أن تتراوح بين 1 كيلو باسكال (مثلاً، أنسجة المخ) 70 كيلو باسكال (مثلاً، الشريان الاورطي)36،،من3738، 39 , 40-ولذلك، اخترنا لاختبار عدوى الخلايا هميك-1 يقيمون في مصفوفات مع تصلب التالية: 0.6 الجيش الشعبي الكوري الكوري 3، 20 كيلوباسكال و 70 كيلو باسكال. لكل صلابة المائية، كانت ملفقة الهلاميات المائية الستة لتقييم إمكانية تكرار نتائج نتائج.
كان يستخدم التدفق الخلوي لتقييم قابلية تعتمد على صلابة ECM هميك-1 الخلايا للإصابة Lm (انظر الشكل 3). هميك-1 الخلايا كانوا مصابين بسلالة Lm (JAT985) الذي يعبر عن علامة نيون بعد استيعاب (actAp::mTagRFP)، مما يتيح الكشف عن البكتيريا داخل الخلايا فقط (انظر الأرقام 1 لتر - 1N). كما يفتقر JAT985 ActA، تعطيل البكتيريا من الانتشار من خلية إلى أخرى، حيث ActA ضروري لتشكيل ذيول المذنب أكتين ونشر البكتيريا اللاحقة. 7-وكان تقييم ح 8 بعد انتهاء العدوى، عدوى الخلايا هميك-1 باستخدام التدفق الخلوي. لضمان تحليل الخلايا المفردة، الجزء الأكبر توزيع عدد خلايا كانت بوابات استخدام الأمام مقابل الجانب مبعثر مؤامرة، وثم أنجزت خطوة ثانية النابضة باستبعاد الخلايا التي يحمل أوتوفلوريسسينسي (انظر الأرقام 3A - ج 3 ). وتظهر النتائج الأولية المبينة في الشكل 3 أن العدوى هميك-1 مع Lm من شقين هما أكبر لخلايا هميك-1 يقيمون في الهلاميات المائية الجيش الشعبي الكوري 70 شديدة بالمقارنة مع الخلايا الموجودة على 0.6 لينة، الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية (انظر أرقام 3B - 3D). يمكن أن تكون زيادة قابلية الإصابة Lm هميك-1 الخلايا المقيمة على شديدة بالمقارنة مع المصفوفات لينة المقرر أن: 1. زيادة التصاق Lm على هميك-1؛ 2-زيادة Lm الاجتياح هميك-1؛ أو 3. كلا أعلاه اشترك تحدث. لاختبار الذي يحمل فرضية، الخلايا هميك-1 كانت تبذر في الناعمة (3 كيلو باسكال) وتصلب الهلاميات المائية (70 كيلو باسكال) والمصابين مؤثرا بروتينات فلورية خضراء معربا عن Lm (انظر الأرقام 4A - 4 ج). العينات التي تم إصلاحها بعد وقت قصير من العدوى والبكتيريا (الانضمام) الخارجية كانت ملطخة بالأجسام المضادة. استخدام كمية مجهرية، وجدنا أن هناك أكثر بكثير من البكتيريا التمسك هميك-1 عندما تتواجد الخلايا المضيفة على شديدة بالمقارنة مع المواد الهلامية الناعمة (انظر الشكل 4د). متسقة مع بيانات التدفق الخلوي، وهناك أكثر بكثير من البكتيريا استيعاب هميك-1 عندما تتواجد الخلايا المضيفة على شديدة بالمقارنة مع المواد الهلامية الناعمة (انظر الشكل 4ه). بيد أن غزو كفاءة (البكتيريا المنضوية إلى مجموع عدد من البكتيريا) Lm في خلايا هميك-1 مماثلة، بغض النظر عن صلابة الركازة (انظر الشكل 4و).
قوة الجر الفحص المجهري للخلايا المصابة Lm هميك-1:
يمكن أن يغير Lm العدوى من الخلايا هميك-1 الميكانيكا الحيوية الخلايا المضيفة المصابة، بما في ذلك قوة مرفق بها إدارة المحتوى في المؤسسة أو لبعضها البعض، التي تؤثر على سلامة الحاجز. سعينا إلى تقييم ما إذا كان يمكن أن يكون الحال باستخدام "مجهر القوة الجر"32 لحساب قوي الجر ECM الخلية و "مجهرية الإجهاد أحادي الطبقة"41 لحساب القوات المتوترة داخل الخلايا. ويصور الشكل 5 خرائط تشوه حقل وحقل الإجهاد الجر، وحقل التوتر داخل الخلايا من الخلايا هميك-1 يقيمون في الهلاميات المائية 20-الجيش الشعبي الكوري في نقاط زمنية مختلفة العدوى بعد. الأرقام 5A - د 5 تشير إلى الخلايا مصابة التحكم هميك-1 بينما 5E الأرقام -- ح 5 تشير إلى هميك-1 الخلايا المصابة مع Lm في تعدد الإصابة يساوي 300 البكتيريا/خلية. هذا العمل الأولية تشير إلى أن الخلايا المصابة هميك-1 تقليل حجم الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة، وتشدد داخل الخلايا أثناء العدوى مع Lm، في حين أنه لم يلاحظ للخلايا التحكم غير مصاب.
إدارة المحتوى في المؤسسة تعتمد على صلابة Lm نشرها عبر مونولاييرس هميك-1:
تم استخدام الوقت الفاصل بين الفحص المجهري للتحقيق في التأثير صلابة مصفوفة قد على Lm نشرها من خلال مونولاييرس هميك-1. كما لم ينتشر عن طريق أحادي الطبقة، البكتيريا خلق بؤرة للعدوى التي تنمو كدالة للزمن (انظر الشكل 6A و الفيديو الأرقام 1 و 2). وتم قياس مجال التركيز العدوى باﻻعتماد هال محدب، أصغر مضلع محدب يشمل مجموعة من النقاط حول البكتيريا42. هناك لا متري قياسية في مجال قياس كفاءة انتشار لام الليستريه خلية إلى خلية عن طريق أحادي الطبقة خلايا المضيفة. لتقييم كفاءة انتشار، بعضها تم إحصاء عدد الخلايا المضيفة في تركيز عدوى41، والبعض الآخر حدود مرسومة يدوياً حول المجموعة من الخلايا المضيفة الإصابة43. لقد اخترنا لرسم مضلع محدب حول البكتيريا، لأنها عملية تلقائية ومتسقة وغير مكلفة حسابياً لقياس كفاءة انتشار لام الليستريه . بالقيام بذلك، وجدنا انخفاضا طفيفا في مجال التركيز العدوى في الخلايا هميك-1 المصنف على 70 كيلو باسكال الهلاميات المائية عند مقارنتها بتلك التي تبذر في 3 مصفوفات كيلوباسكال (انظر الشكل 6ب و الفيديو الأرقام 1 و 2). لتحديد معدل النمو تركز الإصابة، كان رسم المسافة الشعاعية كدالة للزمن بأخذ الجذر التربيعي لمجال التركيز الإصابة بقسمة هذا بي. يفترض هذا التحول الرياضية شكل التركيز الإصابة دائرية تقريبا44. لقياس سرعة نمو التركيز، وتم قياس معدل التغير (أي، المنحدر) المسافة شعاعي للمصفوفات 3 و 70-الجيش الشعبي الكوري على حد سواء. توضيح هذا النهج أن التركيز العدوى نما أسرع وإخفاق في هميك-1 خلايا المصنف على المصفوفات 3-الجيش الشعبي الكوري. ومع ذلك، نمت التركيز أبطأ كثيرا (أول 200 دقيقة)، وأبطأ قليلاً (200 إلى 600 دقيقة) في خلايا المصنف إلى مصفوفات 70-الجيش الشعبي الكوري (انظر الشكل 6ج). وفي الواقع، أكد تحليل مزيدا من البيانات أن التركيز العدوى نما، في المتوسط، شقين أبطأ في مصفوفات 70-الجيش الشعبي الكوري، ولا سيما خلال 200 دقيقة الأولى (انظر الشكل 6د).
الشكل 3 : إدارة المحتوى في المؤسسة تعتمد على صلابة قابلية الخلايا هميك-1 لغزو Lm تقاس باستخدام التدفق الخلوي . كانوا مصابين بالخلايا هميك-1 Lm (JAT985) والعدوى تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي. أ. يظهر هذا الفريق جانب مقابل مؤامرة مبعثر إلى الأمام للممثل هميك-1 خلايا قادمة من بئر واحدة. تم تحديد توزيع الجزء الأكبر من الخلايا عن طريق النابضة لاستبعاد الحطام (يسار) وخلية دوبليتس أو ثلاثة توائم (يمين). ب. يوضح هذا الرسم البياني الرسم بياني لوغاريتم شدة الأسفار Lm كل خلية مطلي هميك-1 في الجيش الشعبي الكوري 0.6 الناعمة. ج-يوضح هذا الرسم البياني الرسم بياني لوغاريتم شدة الأسفار Lm كل خلية هميك-1 مطلي في تصلب الهلاميات المائية الجيش الشعبي الكوري 70. رسوم بيانية لقيم N = 4-6 وترد replicates بألوان مختلفة. مراقبة وقاية الخلايا الرسم البياني الأرجواني. بوابة المستخدمة لتعريف ما هو مصاب يظهر باللون الأحمر. وزارة الداخلية هو 100، والإصابة بالعدوى بعد ح 8 المقررة. د. البيانات تظهر النسبة المئوية للخلايا المصابة هميك-1 مقابل تصلب المائية (N = 5). تصوير أشرطة أفقية يعني للبيانات. فحسبت القيمة مع اختبار "مجموع الدرجة الرتبي" غير حدودي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو رقم 1: نشر Lm داخل الخلايا (القناة الحمراء) عن طريق أحادي الطبقة خلية هميك-1 (المرحلة) المصنف على الركازة 3-الجيش الشعبي الكوري- الخلايا تم تصويرها في وسائط الإعلام L-15 ليبوفيتش في (10% FBS، 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين) داخل دائرة للبيئة اكويليبراتيد إلى 37 ˚C. وجمعت الصور كل 5 دقائق. سرعة الفيلم 15 الإطارات/س. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو رقم 2: نشر Lm داخل الخلايا (القناة الحمراء) عن طريق أحادي الطبقة خلية هميك-1 (المرحلة) المصنف على الركازة 70-الجيش الشعبي الكوري- الخلايا تم تصويرها في وسائط الإعلام L-15 ليبوفيتش في (10% FBS، 20 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين) داخل دائرة للبيئة اكويليبراتيد إلى 37 درجة مئوية. وجمعت الصور كل 5 دقائق. سرعة الفيلم 15 الإطارات/س. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
| معامل يونغ (ه، الجيش الشعبي الكوري) | الاكريلاميد في المائة (من الأسهم 40%) | % بيساكريلاميدي (من الأسهم 2%) |
| 0.6 | 3 | 0.045 |
| 3 | 5 | 0.075 |
| 10 | 10 | 0.075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
الجدول 1. تكوين الهلاميات المائية polyacrylamide (السلطة الفلسطينية) من صلابة متفاوتة. في هذا الجدول، النسبة المئوية للأسهم 40% الاكريلاميد الحل والنسبة المئوية للأسهم 2% مكررا-مادة اكريلاميد حل لتحقيق صلابة معينة (معامل يونغ، ﻫ) ترد في أعمدة مختلفة.
مواد تكميلية 1. عملية حسابية للتوتر داخل الخلايا من تشدد محتسب الجر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
بمعنى خلايا العديد من الإشارات البيئية المادية، التي يمكن أن تؤثر على مورفولوجيا الخلايا ليس فقط، بل أيضا على الجينات النشاط التعبير والبروتين، مما يؤثر على الخلية الحيوية وظائف والسلوكيات45،46. ويقدر متزايد صلابة لإدارة المحتوى في المؤسسة الخلايا المغير هامة حركية الخلوية والتمايز، والانتشار، وفي نهاية المطاف خلية مصير47،،من4849. على الرغم من أن هناك العديد من أوجه التقدم الأخيرة في فهم التفاعل المعقد بين الخلايا وإدارة المحتوى في المؤسسة على النشاط الحيوي، يعرف الكثير عن تصلب البيئة كيف يؤثر على قابلية الخلايا للعدوى البكتيرية. لتسهيل مثل هذه الدراسات، قمنا بتطوير هذا الفحص جيدا متعددة رواية استناداً إلى تلفيق راسخة من الهلاميات المائية polyacrylamide من صلابة الانضباطي الذي يتوافق مع فحوصات العدوى50. تقليديا، درست عدوى بكتيرية من الخلايا في نسيج الثقافة على الزجاج أو البوليستيرين السطوح التي حوالي 1-3 أوامر من حجم أقسى من المحتوى الطبيعي من8،الخلايا الأكثر ملتصقة51. والرزن الموصوفة هنا فتح الطرق الجديدة بتمكين دراسة التفاعلات البكتيريا المضيفة في نظام تصلب بيئية ذات صلة فسيولوجيا.
لإثبات المفهوم للمقايسة المقدمة، تم اختيار الخلايا هميك-1 كنموذج الخلايا المضيفة ملتصقة و Lm ممرض جرثومي نموذج. ومع ذلك، يمكن تمديد المقايسة لإجراء المزيد من الدراسات إذا كان تعديل مناسب. يمكن أن تشمل هذه الدراسات الإصابة بأنواع مختلفة من الثدييات المضيفة ملتصقة الخلية بمسببات إضافية، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات. لهذا التحليل خاصة، المواد الهلامية كانت البروتينات المغلفة مع الكولاجين أنا، ولكن تبعاً لنوع الخلية المضيفة، من الممكن استخدام بروتين ECM مختلفة-طلاء، مثل laminin أو فيبرونيكتين، تيسيرا للمرفق للخلايا المضيفة للفائدة على المائية 52-وهناك اعتبار آخر يعتمد على نوع الخلية المضيفة هو مدى صلابة المائية ينبغي أن تدرس. ينبغي أن يتوقف مدى صلابة على ما هو ذات الصلة الفيزيولوجية لنوع الخلية المضيفة محددة ومدى تعلق التي تستضيف تشكيل أحادي الطبقة في هيدروجيل صلابة معطى. وبالمثل، اعتماداً على الممرض النموذج المطلوب لفحصها، قد تحتاج تعديلات طفيفة سيتم تنفيذها على فحص الإصابة المبينة في هذا التقرير.
ابتكار التحليل مقارنة بالطرق السابقة للتصنيع polyacrylamide الهلاميات المائية24،،من5053 يكمن في بعض ميزات فريدة من نوعها إدماج التحليل المقترح العدوى. أولاً، الهلاميات المائية مبنية على لوحات أسفل الزجاج جيدا المتعددة، الذي يتيح فحص شروط متعددة في وقت واحد، فضلا عن أتمتة إجراءات معينة. رصد ظروف متعددة في نفس الوقت أو دراسة replicates متعددة أمر حاسم نظراً لنتائج مثل هذا النهج يمكن أن يتأثر بعوامل مثل مرور الخلية المضيفة والعدد الدقيق للبكتيريا المضافة لتصيب الأجهزة المضيفة، التي غالباً ما تتغير بين التجارب المستقلة. ميزة إضافية فريدة من نوعها لهذا التحليل أن الهلاميات المائية ارتفاع حوالي 40 ميكرومتر، ورقيقة ما يكفي الصورة باستخدام الفحص المجهري التقليدي. لقد أظهرنا أننا يمكن بنجاح تنفيذ خلية حية مجهرية وتثبيت الخلية، وإيمونوستينينج تليها التصوير، دون الأخذ بالأسفار خلفية عالية. وأخيراً، الهلاميات المائية مصنوعة من طبقتين، مع واحد العلوي بعد المضمنة ميكروبيدس نيون، تقتصر المستوى البؤري واحد. هذه السمة يضمن أنه لن يكون هناك أي ضوء خارج نطاق التركيز التدخل أثناء التصوير. ويتيح وجود الخرز كل دراسة التضاريس السطحية للمواد الهلامية لضمان أن تكون موحدة ويحسن أداء ينص، والرجال الذين يمارسون اللواط24،،من3241. ينص والرجال الذين يمارسون اللواط، من الممكن لحساب قوي ECM خلية وخلية-خلية على التوالي من الخلايا المقيمة على اختلاف مصفوفات صلابة. باستخدام هذا الفحص الرواية، من الممكن جعل هذه القياسات للقوى المادية بمقارنة كل مساهمة من صلابة البيئية والإصابة في وقت واحد. في أعقاب مثل هذا نهج، على أثر العدوى الخلية المضيفة يمكن تحديد ميكانيكا طوال مساره. بالإضافة إلى ذلك، تطور الضغوط داخل الخلية من الخلايا يمكن حسابها باستخدام الرجال الذين يمارسون اللواط ويمكن استخدامها كمقياس لسلامة الحاجز أحادي الطبقة. وأخيراً، نظراً لطبيعة متعددة جيدا التحليل، من الممكن ﻹدخال الاضطرابات الوراثية والدوائية مع عدوى بكتيرية، التحقيق بمزيد من التعمق في التفاعل المعقد بين الميكانيكا الخلية المضيفة والإصابة في وقت واحد.
قد يكون أحد الملازمة للحد من هذه التقنية تكمن في صلابة الركازة تأثير على معدل انتشار الخلايا. عادة، في فحوصات العدوى، نحن بحاجة إلى ضمان أن كثافة الخلايا المضيفة تحت ظروف مختلفة هو نفسه. وهذا نظراً لكثافة الخلية بحد ذاته يمكن أن يكون لها تأثير على قابلية المضيفين للإصابة. عدم إظهار الخلايا هميك-1 التي استخدمت كالخلايا المضيفة اختلافاً كبيرا في عددها عند المصنف ح 24 على الهلاميات المائية. ومع ذلك، أنواع مختلفة من الخلايا قد يحمل الانتشار التفاضلي، اعتماداً على صلابة المائية، التي يمكن أن التحيز دراسات عدوى. وبالمثل، يمكن أن تنشأ التحيز العدوى عند الخلايا لا تشكل مونولاييرس أو لا تقم بإرفاق جيدا في الهلاميات المائية، كما يحدث عند بعض أنواع الخلايا هي تبذر في مصفوفات لينة جداً (مثلاً، والخلايا البطانية البشرية الحبل السري أو مدين-داربي الكلاب الكلي الخلايا الظهارية المصنف على 0.6-الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية54،55.) وبقدر ما يتعلق بمسببات الأمراض، يمكن إرفاق بعض البكتيريا (مثلاً، بوردجورفيري البورليه) على استضافة الخلايا وغزو لهم ولكن يمكن أيضا ترانسميجراتي من خلالهم56. ونحن لم بعد اختبارها إذا سيعمل هذا التحليل لدراسات الهجرة الممرض، ولكن يبدو من الممكن منذ تم توثيق الدراسات السابقة على العَدلات ترانسميجراتينج غشائي الخلايا المصنفة في الهلاميات المائية السلطة الفلسطينية أن تعمل بنجاح من57. وهناك الكثير من الدراسات التي أجريت تبين كيفية صنع الهلاميات المائية polyacrylamide لمعامل معين للشباب عن طريق خلط التركيزات المناسبة من الاكريلاميد ومكررا-مادة اكريلاميد24،25،26 ،27. ومع ذلك، خاصة عند أحد يرغب في القيام بتجارب ينص على الخلايا المقيمين في الهلاميات المائية صلابة متفاوتة، المهم لتأكيد صلابة المتوقعة من الهلاميات المائية عن طريق فؤاد أو سائر تقنيات المسافة البادئة58. انحرافات طفيفة من القيمة المتوقعة يمكن أن تنشأ بسبب مختلف المذيبات المستخدمة أو حلاً أسهم اكريلاميد الذين تتراوح أعمارهم بين، أو بطرق فؤاد القياسات المنجزة (مثلاً، شكل تلميح فؤاد). وأخيراً، يستند النهج المقدمة في هذه الوثيقة البذر الخلايا المضيفة في مصفوفات ثنائية الأبعاد، التي يمكن أن تختلف عن سيناريو ثلاثي الأبعاد أكثر واقعية وفسيولوجيا ذات الصلة. بيد تصنيع المواد الهلامية 3D مع تصلب الانضباطي، بذر منهم مع الخلايا المضيفة وثم يصيب لهم مع مسببات الأمراض، لا يزال يشمل بعض الصعوبات التقنية. ومع ذلك، نحن نتوقع أن في المستقبل القريب ونحن سوف تكون قادرة على توسيع نطاق التحليل الحالي لدراسة الإصابة في أجواء ثلاثية الأبعاد.
خلاصة القول، البروتوكول وصف جنبا إلى جنب مع النتائج الأولية تقديم أدلة على أن هذا التحليل رواية يمكن أن تصبح أداة مفيدة للغاية لدراسة الإصابة بالخلايا المضيفة ملتصقة بالبكتيريا المسببة للمرض بطريقة كمية، وفي كثير ذات الصلة فسيولوجيا البيئة مما سبق فحصها. السلطة من اختﻻق polyacrylamide الهلاميات المائية في إعداد المقترح يكمن في ذلك المقايسة متوافق مع أداء تقنيات متعددة مثل التدفق الخلوي، إيمونوستينينج متبوعاً بالفحص المجهري الخفيفة وقوة الجر مجهرية. التحليل يمكن أن يستخدمها للدراسات المتعلقة بعدوى أنواع الخلايا المضيفة ملتصقة مختلف مسببات الأمراض، التي نتوقع سيكون لها أثر كبير في كشف كل الاستراتيجيات التي تصيب الكائنات الممرضة المضيفين وتيسير تطوير التدخلات العلاجية ضد الالتهابات.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نتقدم بالشكر إلى م. تذييل، R. لاماسون، م. رينجارانجان، وأعضاء مختبر ثيريوت لمناقشاتهم ودعم تجريبية. وأيد هذا العمل R01AI036929 المعاهد الوطنية للصحة (J.A.T.)، HHMI (J.A.T.)، وزمالة غيليام HHMI للدراسة المتقدمة (F.E.O.)، وزمالة خريج جامعة ستانفورد (F.E.O.)، وجمعية القلب الأمريكية (E.E.B.). وأجرى التدفق الخلوي في "مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية المشتركة في جامعة ستانفورد".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
| 25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
| 40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
| Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
| Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
| TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
| Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
| Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
| HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
| Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
| Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
| Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
| DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
| Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
| Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
| BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
| Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
| 0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
| COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
| Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
| Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
| MES powder | Sigma | M3885 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
| MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
| EGTA | Acros | 40991 | |
| Disposable lab equipment | |||
| 12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
| 5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| 15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
| Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
| Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
| Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
| Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
| Razors | VWR | 55411-050 | |
| Syringe needle | BD | 305167 | |
| 0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| 20 ml syringes | BD | 302830 | |
| 0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
| Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
| Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
| Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
| Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
| Cage Incubator | Haison | Custom | |
| Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
| Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
| Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
| pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
| forceps | FST | 11000-12 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
| Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
| Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
| Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
| Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
| Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
| Software | |||
| Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
| Matlab | Matlab Inc | ||
| Flowjo | FlowJo, LLC | ||
| Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
- Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
- Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
- Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
- LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
- Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
- El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
- Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
- Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
- Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
- Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
- Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
- Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
- Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
- Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
- Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
- Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
- Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
- Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
- del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
- Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
- Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
- Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
- Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
- Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
- Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
- Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
- Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
- Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
- Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
- Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
- Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
- Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
- Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
- Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
- Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
- Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).
