Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Abstract

Stijfheid van de extracellulaire matrix bestaat uit een van de meerdere milieu mechanische stimuli die zijn goed-gekend om te beïnvloeden cellulaire gedrag, functie en lot in het algemeen. Hoewel steeds meer aanhangend celtypes reacties op matrix stijfheid hebben gekenmerkt, hoe aanhanger cellen gevoeligheid voor bacteriële infectie is afhankelijk van stijfheid van de matrix is grotendeels onbekend, als is het effect van bacteriële infectie op de biomechanica van de cellen van de gastheer. We veronderstellen dat de gevoeligheid van de endotheliale cellen van de gastheer voor een bacteriële infectie is afhankelijk van de stijfheid van de matrix waarop deze cellen zich bevinden, en dat de infectie van de ontvangende met bacteriën cellen hun biomechanica veranderen zal. Om te testen deze twee hypothesen, werden endotheliale cellen gebruikt als model hosts en Listeria monocytogenes als een model ziekteverwekker. Door het ontwikkelen van een nieuwe multi goed formaat assay, laten we zien dat het effect van matrix stijfheid op infectie van endotheliale cellen door L. monocytogenes kwantitatief kan worden beoordeeld door middel van stroom cytometry en immunokleuring gevolgd door microscopie. Daarnaast kan gebruikt tractie kracht microscopie, het effect van L. monocytogenes infectie op host endothelial cel biomechanica worden bestudeerd. De voorgestelde methode geschikt is voor de analyse van het effect van weefsel-relevante mechanica op bacteriële infectie van Adherente cellen, die een essentiële stap naar het begrip van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix, en pathogene bacteriën. Deze methode geldt ook voor een grote verscheidenheid van andere types van studies inzake cel biomechanica en reactie op substraat stijfheid waar het is belangrijk om te kunnen vervullen vele replicatieonderzoeken parallel in elk experiment.

Introduction

Cellen in de meest dierlijke weefsels zijn meestal aanhangend, zowel naar naburige cellen en hun extracellulaire matrix (ECM). De ankerplaats van cellen aan hun ECM is essentieel voor veel cellulaire processen, variërend van de beweeglijkheid van cel naar cel proliferatie en survival1,2. Cellulaire bevestigingspunt aan de ECM, is afhankelijk van zowel de samenstelling van de ECM en de stijfheid. Cellen reageren op veranderingen in de laatste door dynamisch herschikken hun cytoskelet, cel-cel en cel-ECM verklevingen, die op zijn beurt kritisch cel biomechanica en functies3,4,5,6 wijzigen . ECM stijfheid kan variëren in de ruimte (dat wil zeggen, anatomische locatie) tijdig (dat wil zeggen, veroudering), en in de pathofysiologische processen (b.v., arteriosclerose, kanker, infecties, enz.). Bijvoorbeeld, het is algemeen aanvaard dat endotheliale cellen op stijver-in vergelijking met zachtere-matrices uitoefenen van grotere krachten aan hun ECM en met elkaar en vertonen verhoogde beweeglijkheid en proliferatie7,8. Evenzo fibroblasten woonachtig op stijver matrices geven hoge contractiele krachten aan hun ECM en Toon meer proliferatie, beweeglijkheid en ECM productie9,10,11. Hoewel cel mechanica en reactie op ECM stijfheid zijn uitvoerig bestudeerd voor verschillende soorten cellen, de relatie tussen aanhangend gastheer cellen, is de stijfheid van hun ECM, en bacteriële infecties nog grotendeels onbekend.

De rol van ECM stijfheid in bacteriën-gastheer interacties van de cel studeren, werd L. monocytogenes (Lm) gekozen als het model pathogeen. LM is een alomtegenwoordige voedsel bacterie die leiden systemische infectie in een breed scala aan zoogdieren hosts tot kan. Deze facultatief intracellulaire pathogenen kunt verplaatsen van het intestinaal epitheel tot verre organen door het doorlopen van de verschillende soorten vasculaire endothelia. Als het schendt de bloed - hersen barrière, Lm meningitis kan veroorzaken, en wanneer deze de placenta kruist, het kan leiden tot spontane abortus12,13. LM kan infecteren andere host celtypes en kunt doen met behulp van verschillende pathogene strategieën. LM-infectie is meestal in het kader van epitheliale cellen, onderzocht, terwijl is veel minder bekend over hoe Lm kan infecteren en rondweg endotheliale cellen voering de lumen van bloedvaten14,15,16. Bovendien, het is nog grotendeels onbekend hoe de stijfheid van de ECM waar endotheliale cellen woont moduleert Lm de mogelijkheid om te vallen van deze cellen van de gastheer en vervolgens verspreiden. LM- en verschillende extra bacteriesoorten (d.w.z., Rickettsia parkeri) te profiteren van het actine cytoskelet van de ontvangende cellen ze beide besmetten binnenvallen in hun cytoplasma en vergemakkelijken van cel naar cel verspreiding17 , 18 , 19. zij bereiken dat door middel van de expressie van eiwitten waarmee ze interfereren met host actine polymerisatie trajecten en produceren van actine komeet staarten die hun voorwaartse voortstuwing16,20te vergemakkelijken. Als gevolg van infectie moet van de gastheercel actine cytoskelet dynamisch opnieuw rangschikken op een manier die nog niet volledig wordt gekenmerkt, potentieel beïnvloeden de biomechanica van de cellen van de gastheer met inbegrip van de fysieke krachten die zij op hun ECM en op elk uitoefenen andere. Om te onderzoeken van deze processen, menselijke microvasculaire endotheliale cellen (HMEC-1) werden gekozen als model gastheer cellen om drie redenen: 1. endotheliale cellen zitten bekend voor zitten zeer mechanosensitive als ze worden voortdurend blootgesteld aan variërende fysieke signalen21; 2. de strategieën die LM hanteert ter endotheliale cellen infecteren zijn nog grotendeels onbekend22; en 3. HMEC-1 kan een vereeuwigd cellijn zijn en daarom worden gemakkelijk gekweekt en onderworpen aan genetische manipulatie.

Bacteriële infectie van cellen van de gastheer is meestal studeerde in vitro door het zaaien van de cellen op glas of polystyreen substraten die aanzienlijk stijver dan de fysiologische ECM van de meeste cellen12,14,23. De infectie van cellen zaadjes op een matrix waarvan stijfheid fysiologisch relevante is bestuderen en toelichten van de rol van ECM stijfheid op de infectie van cellen door bacteriële pathogenen, we gevolgd een innovatieve aanpak gebaseerd op het fabriceren van dun microbead-embedded polyacrylamide hydrogels afstembare stijfheid op multi goed platen. De nieuwheid van de voorgestelde aanpak ligt in die zin dat het zorgt voor de opvolging van meerdere voorwaarden gelijktijdig als gevolg van de multi goed formaat en in dat deze compatibel is met meerdere technieken als gevolg van de bijzondere manier die de substraten zijn gebouwd. HMEC-1 cellen waren ontpit op deze eiwitten-bedekt hydrogels en dan besmet met verschillende Lm-stammen die TL op internalisering geworden zijn of constitutively tl. De rol van ECM stijfheid op infectie gevoeligheid van gastheer HMEC-1 cellen werd door stroom cytometry beoordeeld. Daarnaast immunokleuring en fluorescentie microscopie werden gebruikt om de daaraan vastzittende en verinnerlijkte bacteriën van elkaar onderscheiden. Ten slotte, tractie Force microscopie (TFM) werd met succes uitgevoerd karakteriseren van het effect van Lm infectie op de tractie benadrukt dat endotheliale cellen van de gastheer uitoefenen op hun matrices tijdens infectie. De voorgestelde bepaling kan eenvoudig worden aangepast zodat verdere studies over het effect van ECM stijfheid op infectie gevoeligheid van Adherente cellen met behulp van verschillende cellijnen of ziekteverwekkers.

Protocol

1. vervaardiging van dunne twee lagen Polyacrylamide (PA) Hydrogels op multi goed platen

  1. Ontbinden ammonium persulfate (APS) in gedestilleerd ultrazuiver water om een eindconcentratie van 10 g/mL. Aliquot en winkel de oplossing bij 4 ° C voor tijdelijk gebruik (3 weken).
    Opmerking: De bovenstaande oplossing kan bereid worden voorafgaand aan de fabricage van de hydrogel.
  2. Glas activering van 24-well gerechten
    1. 24-goed bodem glasplaten met 13 mm-diameter wells (Zie Tabel of Materials) voor 1 h met 500 µL van 2 M NaOH per putje bij kamertemperatuur incuberen.
    2. Spoel de putjes 1 x met ultrazuiver water en voeg vervolgens 500 µL van 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (Zie Tabel van materialen) in ethanol van 95% aan elk goed voor 5 min.
    3. Spoel de putjes 1 x weer met water en voeg 500 µL van 0,5% Glutaaraldehyde aan elk putje voor 30 min. spoelen de putjes 1 x met water en droog ze op 60 ˚C met het deksel af.

Figure 1
Figuur 1 : Bacteriële infectie kwantitatieve analyse van de cellen van de gastheer op dunne lagen twee fluorescerende kraal-embedded polyacrylamide (PA) hydrogels verschillende stijfheid. A. glas coverslips zijn chemisch gewijzigd zodat hydrogel bijlage. B. 3.6 µL van PA mengsels worden afgezet op de bodem van het glas. C. het mengsel is bedekt met een dekglaasje 12-mm circulaire glas aan om polymerisatie. D. het dekglaasje aan met een naald-spuit wordt verwijderd. E. 2.4 µL van een PA-oplossing met microbeads wordt toegevoegd op de top van de onderste laag en afgetopt met een dekglaasje circulaire glas aan. F. een buffer wordt toegevoegd in de put en het dekglaasje aan wordt verwijderd. G. UV bestraling voor 1 h zorgt voor sterilisatie. H. een Sulfo-SANPAH-bevattende oplossing is toegevoegd op de gels, die vervolgens worden geplaatst onder UV-licht voor 10 min. ik. De hydrogels zijn gewassen met een buffer en vervolgens geïncubeerd 's nachts met collageen I. J. De hydrogel is geëquilibreerd met cel media. K. de gastheer cellen worden overgeënt. L. LM bacteriën worden toegevoegd aan de oplossing en de infectie wordt gesynchroniseerd via centrifugeren. M. 1 h na infectie bacteriën in de oplossing zijn weggewassen en media, aangevuld met een antibioticum wordt toegevoegd. N. Lm (JAT985) begint 4 uur na infectie, oplichtende. O. HMEC-1 cellen losgekoppeld van hun matrix en de oplossingen worden overgedragen aan buizen stroom cytometry metingen uit te voeren. Merk op dat de dagen en geschatte tijden voor elke stap van de bepaling ook worden aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd in Bastounis en Theriot €59. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Polyacrylamide hydrogel fabricage
    Opmerking: Zie Figuur 1.
    1. Bereiden van waterige oplossingen dat 3-10% van 40% voorraad acrylamide-oplossing bevatten (Zie Tabel van materialen) en 0,06 - 0.6% van 2% BIB-acrylamide stockoplossing (Zie Tabel of Materials) voor de vervaardiging van de hydrogels afstembare stijfheid variërend van 0,6 kPa naar 70 kPa. Zie tabel 1.
      1. Meng 3% acrylamide met 0.045% BIB-acrylamide voor 0.6 kPa hydrogels. Meng 5% acrylamide met 0.074% BIB-acrylamide voor 3 kPa hydrogels. Voor 10 kPa hydrogels, meng 10% acrylamide met 0,075% BIB-acrylamide. Meng voor 20 kPa hydrogels, 8% acrylamide met 0.195% BIB-acrylamide. Voor 70 kPa hydrogels, meng 10% acrylamide met 0,45% BIB-acrylamide.
        Opmerking: Nadere gegevens over de verwezenlijking van de wenselijke PA hydrogel stijfheid kunnen worden gevonden elders24,25,26,27.
    2. Bereiden twee waterige oplossingen voor elk wenselijk hydrogel stijfheid. Bereiden oplossing 1 kraal-vrije en oplossing 2 bevatten van 0,03% 0.1-µm diameter fluorescerende micro-beads (Zie Tabel van materialen).
    3. Degas oplossingen 1 en 2 door vacuüm voor 15 min te elimineren zuurstof dat bekend is voor de remming van de polymerisatie van de oplossingen.
    4. 0,6% van de 10 g/mL materieel APS oplossing en 0,43% tetramethylethylenediamine (TEMED) toevoegen aan oplossing 1 om een polymerisatie-initiatie. Snel handelen.
    5. 3.6 µL van oplossing 1 naar het midden van elk putje van de 24-well schotel toevoegen (Zie stap 1.2 voor de voorbereiding).
    6. Onmiddellijk dekken de putjes met 12-mm onbehandeld circulaire coverslips en laat gedurende 20 minuten zitten zodat het volledig polymerizes van de oplossing 1.
    7. Tik zachtjes op een naald van de spuit op een oppervlak te maken van een kleine haak op de tip om de opheffing vergemakkelijkt van de coverslips. Til de coverslips met behulp van de naald van de spuit.
    8. Toevoegen van 0,6% van de 10 g/mL stockoplossing APS en 0,43% TEMED naar oplossing 2. 2.4 µL van het mengsel op de top van de eerste laag in elk putje van de 24-well schotel deponeren.
    9. Oplossing 2 dekken met 12 mm ronde glazen coverslips, zachtjes persen naar beneden met behulp van een paar pincet om de dikte van de tweede laag is minimaal. Oplossing 2 polymeriseren voor 20 min te laat.
    10. Voeg toe 500 µL van 50 mM HEPES pH 7.5 aan elk van de putten en verwijder vervolgens het glas-coverslips met de spuit-naald en pincet.
  2. Sterilisatie, collageen-coating en evenwichtsinstelling van polyacrylamide hydrogels
    1. UV-en bloot de hydrogels gedurende 1 uur in de weefselkweek kap toe sterilisatie.
    2. Bereiden een mengsel van 0,5% gewicht/volume sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, Zie Tabel van materialen) in 1% DMSO en 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Voeg toe 200 µL van deze oplossing aan de bovenkant van de hydrogels. Handelen snel en hen blootstellen aan UV (302 nm) gedurende 10 minuten om ze te activeren.
    4. Wassen van de hydrogels tweemaal met 1 mL 50 mM HEPES pH = 7,5. Herhaal wordt indien nodig ervoor te zorgen dat eventuele overtollige crosslinker verwijderd.
    5. Eiwit-coat de hydrogels met 200 µL van 0,25 mg/mL rat staart collageen ik (Zie Tabel van materialen) in 50 mM van HEPES. Incubeer de hydrogels, met de collageen-oplossing op de top, 's nachts bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Voorkom uitdroging/verdamping en plaats van de multi goed platen in een secundaire insluiting en voeg laboratorium schoonmaken weefsels geweekt in water in de binnenste rand van de inperking.
    6. Gebruik een epifluorescence of confocal microscoop met een 40 X doelstelling voor het meten van de dikte van de hydrogels. Dit doen door het lokaliseren van de posities van de z van de bodem (waar het glasoppervlak is) en top vliegtuigen de hydrogel (waar de fluorescerende kralen intensiteit is maximale). Dan aftrekken van de z-posities om te bepalen van de hoogte.
      Opmerking: Wij gebruikten een omgekeerde epifluorescence Microscoop en een 40 X doelstelling met numerieke diafragma 0,65 voor het meten van de dikte van de hydrogels. Atomic Force microscopie metingen (AFM) kunnen ook op dit punt worden uitgevoerd om te bevestigen de exacte stijfheid van de hydrogels (Zie Figuur 2).
    7. Vóór het zaaien van de cellen van de rente over de hydrogels, voeg 1 mL van de media op de hydrogels en hen Incubeer bij 37 ˚C voor 30 min tot 1 h om evenwichtsinstelling.
      Opmerking: We toegevoegd MCDB-131 volledige media, want dat is de media waar het model gastheer cellen (HMEC-1) werden gekweekt in (Zie stap 2.1 voor details).

Figure 2
Figuur 2: AFM metingen van PA hydrogel stijfheid en kralen distributie. A. gegevens blijkt de verwachte Youngs modulus (maatregel van stijfheid) van de PA, hydrogels, gezien de hoeveelheid acrylamide en bis-acrylamide gebruikt versus de Youngs modulus gemeten door de AFM (N = 5-6). De horizontale balken verbeelden het gemiddelde. De stijfheid van de 0.6 kPa hydrogels kon niet gemeten worden omdat de hydrogels zeer zacht en zelfklevend naar het uiteinde van de AFM waren. B. Dit is een beeld van de fase van confluente HMEC-1 cellen en de bijbehorende afbeelding van de kralen ingebed op de bovenste oppervlakte een hydrogel zachte 3 kPa-PA. De HMEC-1 waren bezaaid gedurende 24 uur bij een concentratie van 4 x 105 cellen per putje. C. dit beeld is hetzelfde als Figuur 2B maar voor cellen die zich bevinden op een stijve 70-kPa PA hydrogel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. menselijke microvasculaire Endothelial celcultuur en zaaien op Hydrogels

  1. Cultuur HMEC-1 (menselijke, microvasculaire endothelial) cellen in MCDB-131 volledige media met MCDB-131 media aangevuld met 10% foetale runderserum, 10 ng/mL van de epidermale groeifactor, 1 µg/mL hydrocortison en 2 mM van L-glutamine (Zie tabel van materialen ).
  2. Splits de confluente culturen 1:6 elke 3-4 dagen en houden van de cellen tot doorgang 40.
  3. Een dag voorafgaand aan het experiment, loskoppelen de cellen van hun vaartuig van de cultuur met behulp van 0,25% trypsine/EDTA. Eerst was de cellen en hun cultuur vaartuig 1 x met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en voegt u vervolgens de juiste hoeveelheid 0,25% trypsine/EDTA (2 mL per schotel van 100 mm of 75 cm kolf, 1 mL per schotel van 60 mm of maatkolf van 25 cm), het broeden van de kolf bij 37 ° C gedurende 5-10 min dat de onthechting van de cellen van hun substraat.
  4. De trypsine neutraliseren door toevoeging van het gewenste volume voor MCDB-131 volledige media, pipet zachtjes te breken van de bosjes van cellen, en plaats dan de oplossing in een conische centrifugebuis.
  5. Zachtjes swirl van de oplossing van cellen om ervoor te zorgen dat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld en vervolgens 20 µL van de oplossing nemen en heel voorzichtig de twee kamers onder het dekglaasje aan van een glazen hemocytometer in te vullen.
  6. Pellet beneden de oplossing van cellen in de conische centrifugebuis gebruik van centrifugeren voor 10 min bij 500 x g.
  7. Tijdens de periode van 10 min te wachten, met behulp van een hemocytometer cellen te tellen. Gebruik van een Microscoop, concentreren op de rasterlijnen van de hemocytometer met een 10 X doelstelling, en gebruik vervolgens een hand tally teller te tellen van het aantal cellen in een 1 x 1 mm vierkante.
  8. Verplaats de hemocytometer naar een ander 1 mm x 1 mm vierkant, de cellen er tellen en herhaal het proces nog tweemaal. Berekenen van het gemiddelde van de vier metingen en vervolgens het gemiddelde te vermenigvuldigen met 104. De eindwaarde is het aantal levensvatbare cellen/mL in de celsuspensie die wordt gecentrifugeerd.
  9. Verwijder de vloeistof uit de conische centrifugebuis terwijl ervoor te zorgen dat de cel pellet hierdoor niet wordt verstoord. Resuspendeer de cellen in de MCDB-131 volledige media bij een concentratie van 4 x 105 cellen/mL.
  10. Zaad de cellen in suspensie op de hydrogels door eerst het verwijderen van de media waarmee de hydrogels werden geïncubeerd en vervolgens toe te voegen 1 mL celsuspensie op elke hydrogel.

3. infectie van menselijke microvasculaire endotheliale cellen met L. monocytogenes

  1. Voorbereiding
    Opmerking: De volgende oplossingen van tevoren te bereiden.
    1. Streptomycine, chlooramfenicol en gentamicine voorraden
      1. Bereiden van 50 mg/mL streptomycine stamoplossingen door weegt 0,5 g streptomycine sulfaat en het oplossend volledig in 10 mL ultrazuiver water.
      2. Bereiden 7,5 mg/mL chlooramfenicol stamoplossingen door met een gewicht van 75 mg chlooramfenicol en ontbinding van het volledig in 10 mL ethanol 100%.
      3. Bereid 20 mg/mL gentamicine stamoplossingen door met een gewicht van 0.2 g gentamicine sulfaat en het oplossend volledig in 10 mL ultrazuiver water.
      4. Filter-steriliseren alle voorraadoplossingen met een 0,2-µm spuit filter en sla deze op-20 ° C voor langdurig gebruik (1-2 maanden).
    2. Hersenen hart infusie (BHI) media en agar platen
      1. Zoek twee 1-L kolven en toevoegen van een magnetische roer bar binnen elke kolf.
      2. Voor de media BHI, 37 g BHI poeder in een kolf en voeg toe ultrazuiver water tot 1 L. Mix de oplossing krachtig door het plaatsen van de kolf op de plaat van een magnetische roer totdat het poeder wordt opgelost.
      3. Voor de BHI agar platen, voeg 37 g BHI poeder en 15 g gekorrelde agar (Zie Tabel van materialen) in de tweede kolf en voeg ultrazuiver water tot 1 L. Mix de oplossing krachtig door het plaatsen van de kolf op de plaat van een magnetische roer totdat het poeder wordt opgelost.
      4. Schroef de deksels van de kolven niet te strak en autoclaaf de oplossingen met behulp van de vloeistof instellen of volgens de specificaties van de autoclaaf.
      5. De oplossing van de autoclaaf verwijderen en vervolgens afkoelen van de agar-BHI oplossing tot 55 ° C. Als de BHI media in de maatkolf van 1 L steriel gehouden wordt, kan het worden gebruikt voor maximaal een maand.
      6. Ter voorbereiding van de bacteriën agar-BHI platen, eerst toevoegen antibiotica, zo nodig, aan de maatkolf met BHI en agar (afhankelijk van de bacteriestammen te worden gekweekt). Kort zetten de kolf een magnetische roer plaat toe snel mengen.
        Opmerking: De hier gebruikte antibiotica zijn specifiek voor de stammen van de Lm gebruikt, maar nodig antibiotica in BHI-agar platen kunnen worden gebruikt. We streptomycine toegevoegd tot een concentratie van 200 µg/mL en chlooramfenicol tot een concentratie van 7,5 µg/mL omdat 10403S Lm stammen zijn resistent tegen streptomycine. Deze stammen zijn geconjugeerd met een plasmide waarin het chlooramfenicol acetyltransferase open leesraam, vandaar de weerstand tegen chlooramfenicol.
      7. Giet het mengsel in 10 cm polystyreen bacteriën cultuur platen (ongeveer 20 mL per plaat). Om zich te ontdoen van bubbels, vlam de hogere oppervlakte van de platen kort. Cool platen overnachting bij kamertemperatuur.
      8. De volgende dag, verzegelen van de droge platen en hen bewaren bij 4 ° C.
  2. Infectie van menselijke microvasculaire endotheliale cellen met L. monocytogenes
    1. Drie dagen voordat de infectie, streak uit de Lm stam worden gebruikt uit een voorraad van de glycerol (opgeslagen bij-80 ° C) op een bord van BHI-agar waarin 7,5 µg/mL chlooramfenicol en 200 µg/mL streptomycine, indien van toepassing.
      Opmerking: De stam te worden streaked uit kunnen een wild-type of de mutant, constitutively uiten fluorescentie (voor immunokleuring die jat1045 werd gebruikt) of uiting van fluorescentie onder de ActA-promotor (voor stroom cytometry of tractie kracht microscopie JAT983 of JAT985 werden gebruikt)22.
    2. Incubeer de platen bij 37 ° C tot afzonderlijke kolonies zijn gevormd (1-2 dagen).
    3. De dag voordat de infectie, groeien de gewenste spanning 's nachts, schudden bij 150 t/min bij 30 ° C in BHI media met 7,5 µg/mL chlooramfenicol (indien van toepassing).
      1. Plaats 5 mL BHI media in een 15-mL conische centrifugebuis, voeg 7,5 µg/mL chlooramfenicol (indien van toepassing), en vervolgens enten een één kolonie van de agarplaat met behulp van een steriele 10 µL tip.
    4. De volgende dag, vlak voor infectie, meet de extinctie van de oplossing van de bacteriën bij 600 nm (OD600) door verdunning van het monster 1:5; Gebruik een cuvet met BHI om te dienen als een leeg.
    5. Verdun de overnachting cultuur tot een OD600 van 0,1 en incubeer, schudden 2 h bij 30 ° C, in BHI media met 7,5 µg/mL chlooramfenicol (indien van toepassing) zodat de bacteriën te log-fase groei bereiken.
    6. Meten van de OD600 van de bacteriële oplossing, die naar verwachting worden rond 0,2 - 0,3. Als het OD600 hoger is, Verdun het tot 0,2 - 0,3 met BHI alleen.
    7. Neem 1 mL van bacteriële oplossing in een buis van microcentrifuge. Draai het naar beneden voor 4 min bij 2.000 x g centrifugeren gebruik bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 mL PBS weefselkweek-grade, in de weefselkweek kap. Wassen van de bacteriën tweemaal meer door het draaien van hen naar beneden voor 4 min bij 2.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriën in 1 mL PBS.
    8. Bereid de mix van infectie door het mengen van 10 of 50 µL van de geresuspendeerde in PBS met 1 mL van de volledige media MCDB-131 voor een veelheid aan infectie (MOI; bacteriën dat wil zeggen, het aantal bacteriën per gastheercel) van ongeveer 50 bacteriën per gastheercel of 10 bacteriën per gastheercel.
    9. Verwijder het medium van de putten van de 24-Wells-platen, voorzichtig niet te verstoren de hydrogels of de cellen. Wassen van de cellen 1 x met 1 mL MCDB-131 volledige media en voeg vervolgens 1 mL van de bacteriën toe aan elk putje.
    10. Houden van sommige infectie mix (ten minste 100 µL) voor de bepaling van de MOI (Zie stap 3.3).
    11. De afdekplaat met het deksel en wikkel de platen met polyethyleen voedsel wrap om te voorkomen lekkage. Plaats de platen in de centrifuge en draaien van de monsters gedurende 10 minuten bij 200 x g voor het synchroniseren van de invasie. Bewegen van de platen in de weefselkweek incubator en broeden ze gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    12. Wassen van de monsters 4 x met MCDB-131 volledige media en verplaatsen in de weefselkweek incubator. Na een extra 30 min, door de media te vervangen door media aangevuld met 20 µg/mL gentamicine.
  3. Bepaling van de veelheid van infectie (MOI)
    1. Maak tijdens de eerste 30-min incubatie van de cellen van de gastheer met de bacteriën, 10-fold seriële verdunningen van de infectie mix om te bepalen van de MOI. 10-fold verdunningen maken door het mengen van 100 µL van het mengsel van infectie met 900 µL van 1 x PBS (10-1 verdunning). Meng 100 µL van de 10-1 verdunning met 900 µL van PBS (10-2 verdunning).
    2. Ga verder tot een 10-5 -verdunning wordt verkregen.
      Opmerking: Alle oplossingen moeten ruim vóór het verdunnen van hen worden gemengd, en verse schone Pipetteer tips moeten worden gebruikt bij elke stap.
    3. Zodra de verdunningen zijn gemaakt, plaatsen 100 µL van de 10-2 - 10-5 verdunningen in het midden van de BHI/agar/chlooramfenicol/streptomycine platen (indien van toepassing).
    4. Maak een strooier van een glazen pipet met behulp van vuur te buigen de pipet wilt maken van een haak. Dompel de pipet in 100% ethanol voor sterilisatie en dan branden uit de ethanol met een vlam.
    5. Zodra de spreider is afgekoeld, verspreid de bacteriële verdunningen homogeen op de platen vanaf de 10-5 -verdunning en verhuizen naar de geconcentreerder mixen. Incubeer de platen ondersteboven bij 37 ° C gedurende 2 dagen.
    6. Afhankelijk van de dichtheid van de kolonie, het aantal kolonies van de 10-3 en 10-4 of de 10-4 en 10-5 verdunning platen te bepalen. De MOI wordt als volgt berekend:
      aantal kolonies × factor ÷ verdunningsvolume eerste toegevoegd = aantal KVE per µL
      aantal KVE per µL × volume bacteriën mix per putje = aantal KVE per putje
      aantal KVE per goed × volume van cellen per putje = aantal bacteriën per cel
      Opmerking: CFU staat voor de kolonie-vormende eenheden.
    7. Gemiddelde de MOIs uit twee platen te verkrijgen van de laatste MOIs.

4. Stroom Cytometry te kwantificeren van de extracellulaire matrix-stijfheid afhankelijke gevoeligheid van Host cellen voor infectie

  1. Weeg 5 mg collagenase en plaats deze in een centrifugebuis 15 mL kegelvormig. Voeg 10 mL van 0,25% trypsine-EDTA en meng ze goed.
  2. 8 h na infectie, verwijder het medium van de putjes van de plaat 24-well en was de putjes goed 1 x met weefselkweek PBS. Verwijder de PBS uit de putten en voeg 200 µL van de trypsine-EDTA/collagenase mix aan elk putje. Plaats deze in de weefselkweek incubator voor 10 min. zodat volledige detachement van de cellen.
  3. Gebruik een verse pipet voor elk goed en Pipetteer de mix op en neer de 8 x. Te zacht zodat de cellen niet te beschadigen. Voeg 200 µL van volledige media aan elk putje te neutraliseren de trypsine.
  4. Breng de 400-µL cell oplossing van elk putje in een buis 5 mL polystyreen met een 35-µm cel zeef cap (Zie Tabel van materialen).
  5. 10.000-20.000 cellen per monster door stroom cytometry analyseren. Het uitvoeren van data-acquisitie via stroom cytometry en bepalen van het percentage van geïnfecteerde cellen per putje met behulp van een relevante verkrijgbare software. Gebruik de voorwaartse scatter versus kant scatter percelen aan de poort van het grootste deel van de distributie van de graven van de cel.
    Opmerking: Dit zal zorgen voor analyse van afzonderlijke cellen en elimineren puin of cel paren of drieling.
    1. Meten van het signaal van de fluorescentie van controle-niet-geïnfecteerde cellen en de bevolking van geïnfecteerde cellen met uitzondering van de autofluorescence poort.

5. immunokleuring van de extracellulaire bacteriën, microscopie en beeldverwerking

Opmerking: Deze aanpak wordt gevolgd om te differentiëren tussen ECM-stijfheid afhankelijke bacteriële hechting op het celoppervlak host versus bacteriële internalisering (invasie) binnen de hosts.

Figure 4
Figuur 4 : Immunokleuring van HMEC-1 Lm-geïnfecteerde cellen die zich bevinden op hydrogels verschillende stijfheid te onderscheiden van bacteriële hechting versus invasie. Deze beelden tonen een representatief voorbeeld van differentiële immunokleuring Atonen. de celkernen (DAPI), B. alle bacteriën (GFP), en C. de buiten bacterie (Alexa-546). De cellen van de HMEC-1 woonden op een hydrogel zachte 3-kPa. De pijlen wijzen op bacteriën die hebben zijn geïnternaliseerd, dus op het groene kanaal alleen worden weergegeven. Gegevens in D-F verwijzen naar N = 20 afbeeldingen die zijn vastgelegd voor de geïnfecteerde cellen van de HMEC-1 op zachte 3-kPa en stijve 70-kPa hydrogels enToon D. de totale bacteriën per kernen; E. de verinnerlijkte bacteriën per kernen; en F. de invasie efficiëntie (de verhouding tussen de totale bacteriën verinnerlijkte bacteriën). De horizontale balken verbeelden de gegevens betekenen. De P-waarde werd berekend met de niet-parametrische Wilcoxon Rank-Sum test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. 30 min na infectie, wassen de HMEC-1-cellen geïnfecteerd met JAT1045 (Lm die constitutively groen fluorescente proteïne (GFP uitdrukt)) 4 x met media.
  2. Na de vierde wash, meng 1 µL van 1 mg/mL Hoechst kleurstof met 1 mL van de volledige media MCDB-131 en voeg deze toe aan elk putje om vlek de cellen kernen. Plaats de cellen in de weefselkweek incubator voor 10 min.
  3. Wassen van de cellen 1 x met PBS. Corrigeren met een niet-permeabilizing-fixeerspray voor differentiële immunokleuring gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur28.
    Opmerking: De fixeerspray bevat 0.32 M sacharose, 10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA, en 4% formaldehyde (elektronenmicroscopie grade).
  4. Wassen van de cellen 1 x met PBS. Blokkeren van de monsters gedurende 30 minuten met 5% bovien serumalbumine (Zie Tabel van materialen) in PBS.
  5. Incubeer de monsters voor 1 h met een anti-Lmprimair antilichaam (Zie Tabel van materialen) verdund 1:100 in PBS met 2% BSA.
  6. Wassen van de monsters in PBS 3 x en dan hen Incubeer gedurende 1 uur met een AlexaFluor-546 geit-anti-konijn secundair antilichaam 1:250 in PBS met 2% BSA (Zie Tabel van materialen) verdund. Wassen van de monsters 3 x in PBS. Opslag van de monsters in 1 mL PBS voor imaging.
  7. Beeld en analyseren van meer dan 1000 cellen per voorwaarde.
    1. Voor imaging, een omgekeerde epifluorescence Microscoop met een CCD-camera gebruiken (Zie Tabel van materialen) en een 40 X air plan fluoriet lucht doelstelling met 0.6 numerieke diafragma (nvt).
      Opmerking: De macht is ingesteld op 25% en de belichtingstijd aan 100 ms. de Microscoop filters die worden gebruikt voor mCherry zijn 470/525 nm, voor GFP 530/645 nm en DAPI 395/460 nm, voor excitatie en uitstoot respectievelijk. De Microscoop we gebruikten werd gecontroleerd door een opensource microscopie software pakket29.
    2. Voor differentiële immunokleuring, tellen alle 'groene' bacteriën die zijn gekoppeld aan afzonderlijke cellen als aanhangend. Tellen bacteriën die zowel 'groen' en 'rood' (als gevolg van antilichaam-bindende) als niet-geïnternaliseerd.
      Opmerking: We het aantal kernen vastgesteld door een op maat gemaakte script en de CellC-software uit te voeren (Zie Tabel van materialen) opsomming van de bacteriën-30.

6. multi goed tractie Force microscopie en enkelgelaagde Stress microscopie

Figure 5
Figuur 5: HMEC-1 Lm-geïnfecteerde cellen verminderen de grootte van de krachten van de tractie zij op hun ECM tijdens infectie uitoefenen. Deelvenster A toont het beeld van de fase, B bevat de vervorming van het veld, C toont de tractie stress veld, en D toont intracellulaire spanning inzake de niet-geïnfecteerde cellen van de HMEC-1 op een 20-kPa hydrogel. De kleurenbalken van de vervorming kaarten (µm), de tractie stress kaarten (Pa) en van de intracellulaire spanning kaarten (nNµm-1) worden weergegeven op het bovenste gedeelte van de warmte-kaarten. De kolommen geven drie representatieve tijdstippen: 3, 8 en 18 h na infectie. E-H. Zelfde als panelen A-D maar voor cellen geïnfecteerd met Lm bij een MOI van 300. De beelden van de bacteriën (rode kanaal) zijn bovenop de beelden van de fase van de cellen. TFM opnames werden uitgevoerd door imaging gelijktijdig meerdere wells. De grootte van het venster voor PIV was 32 pixels met een overlapping van 16. De bar van de schaal is 32 µm. Dit cijfer is gewijzigd in Bastounis en Theriot €59. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Voorbereiden van de PA hydrogels op een 24-well plaat (Zie stap 1). Zaad HMEC-1 cellen (Zie stap 2) en infecteren hen met JAT983 zoals beschreven hierboven (Zie stap 3).
  2. Bereiden een live-microscopie medium door Leibovitz van L-15 met 10% foetale runderserum, 10 ng/mL van epidermale groeifactor en 1 μg/mL hydrocortison aan te vullen.
    Opmerking: De L-15 bevat al 2 mM L-glutamine, dus het is niet nodig om toe te voegen extra zoals in het geval van MCDB-131 media.
  3. 4 uur na infectie (zodra de verinnerlijkte JAT983 oplichtende), meng 1 μL van 1 mg/mL Hoechst kleurstof met 1 mL L-15 volledige media en toe te voegen aan elk putje om vlek de cellen kernen. Plaats van de cellen in de weefselkweek incubator voor 10 min en vervolgens vervangen in elk putje de L-15 volledige media met 1 mL van de volledige media L-15 aangevuld met 20 µg/mL gentamicine.
  4. Dekking de plaat met de deksel en de plaats in van een Microscoop milieu kamer (Zie Tabel van materialen) geëquilibreerd aan 37 ˚C.
    Opmerking: Voor imaging, gebruikt u een omgekeerde epifluorescence Microscoop met een CCD-camera (Zie Tabel van materialen) en een 40 X air plan fluoriet lucht doelstelling met 0,6 NA.
  5. Meerkanaals time-lapse beelden van de fluorescerende kralen en de fluorescerende bacteriën en fase contrast beelden van de cellen van de gastheer, elke 10 min. voor 4 tot 12 h aanschaffen.
    Opmerking: Voor de beeldvorming, de macht werd ingesteld op 25% en de belichtingstijd aan 100 ms. de Microscoop filters (excitatie/emissie) die worden gebruikt voor mCherry en GFP 470/525 nm en 530/645 nm respectievelijk.
  6. Aan het einde van de opname, voeg 500 µL van 10% natrium dodecyl sulfaat (SDS) in water in elk van de putten.
    Opmerking: De cellen zal worden losgekoppeld van de hydrogel en de hydrogel zal terugkeren naar de oorspronkelijke toestand van de undeformed omdat het elastisch.
  7. Neem een beeld van de hydrogel en gebruik het als de referentieafbeelding undeformed.
  8. Het bepalen van de tweedimensionale vervorming van de hydrogel op elk moment met behulp van de particle image velocimetry (PIV)31, vergelijken van elke afbeelding van de time-lapse serie met het referentiebeeld de undeformed hydrogel. Gebruik de juiste venstergrootten en overlappen afhankelijk van het experiment.
    Opmerking: We gebruikt windows 32 pixels met een overlapping van 16 pixels.
  9. Bereken de 2D tractie benadrukt dat cellen op de hydrogel uitoefenen zoals elders beschreven32,33.
  10. Bereken de spanning enkelgelaagde van de tractie stress34 zoals hiervoor is beschreven door het oplossen van de vergelijkingen van mechanisch evenwicht voor een dunne elastische plaat onder de reactiekrachten gemaakt door de PA hydrogel op de enkelgelaagde, die van een tegengesteld teken aan de spanningen gemeten tractie.
    Opmerking: Zie aanvullend materiaal 1.

7. kwantitatieve Time-lapse microscopie te beoordelen Extracellular-matrix-stijfheid afhankelijke L. monocytogenes verspreiding via endotheliale cellen

Figure 6
Figuur 6: Time-lapse microscopie van kwantitatieve gegevens voor Lm verspreiding via HMEC-1 monolayers van substraten met 3-kPa en 70-kPa stijfheid agarvoedingsbodem. A. dit paneel toont nog steeds beelden van twee representatieve infectie foci op 0, 200, 400 en 600 min. De fase-kanaal HMEC-1 cel monolayers toont, en het rode kanaal toont intracellulaire Lm (Zie stap 7 van het protocol). B. dit paneel toont het gebied van het convex omhulsel omvat de focus van de infectie uitgezet als functie van de tijd. Het aandachtspunt van de conditie van de 3-kPa (rood) groeit sneller dan die van de 70-kPa (groen). C. dit paneel toont dat de radiale afstand vanuit het midden naar de rand van de infectie focus uitgezet als functie van de tijd voor vertegenwoordiger infectie foci groeien in HMEC-1 monolayers ontpit op PA substraten van 3-kPa (rood) en 70-kPa (groen) stijfheid. De radiale snelheid (dr/dt) is constant voor de 3-kPa voorwaarde, maar tweefase voor de 70-kPa voorwaarde. D. deze gegevens blijkt dat de radiale snelheid voor de eerste 200 min van tien onafhankelijke infectie foci. De rode (3-kPa) en groen (70-kPa) gegevenspunten verbeelden de hellingen van de twee foci beschreven in de vorige panelen. De horizontale balken verbeelden de gegevens betekenen. De P-waarde werd berekend met de niet-parametrische Wilcoxon Rank-Sum test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Voorbereiden van de PA hydrogels op een 24-well plaat (Zie stap 1), seed HMEC-1 cellen (Zie stap 2), en groeien van nachtelijke JAT983 culturen, zoals eerder beschreven (Zie stap 3).
  2. De dag van de infectie, bereid de mix van infectie door het mengen van 10 µL van bacteriële pellet per mL MCDB-131 volledige media. Zorgvuldig Verwijder het medium van de putten van de 24-Wells-platen, en voeg 1.9 mL van de MCDB-131 volledige media en 0,1 mL van de bacteriële mix aan elk putje.
    Opmerking: De lagere MOI gebruikt in deze bepaling is noodzakelijk om te analyseren verspreiding gebeurtenissen die starten vanaf een enkele bacterie invasie van een gastheercel.
  3. De afdekplaat met het deksel en verzegel het met een plastic wrap om te voorkomen lekkage. Plaats de platen in de centrifuge en draaien van de monsters gedurende 10 minuten bij 200 x g voor het synchroniseren van de invasie.
  4. Bewegen van de platen in de weefselkweek incubator en incubeer hen gedurende 5 min.
  5. Wassen van de monsters 4 x met media en verplaats ze naar de weefselkweek incubator. Na een extra 5-7 minuten, door de media te vervangen door media aangevuld met 20 µg/mL gentamicine.
  6. Incubeer de plaat in de incubator voor een extra 5 h zodat de actA promotor te schakelen en rijden de uitdrukking van de mTagRFP open frame35lezen.
  7. Bereiden een live-microscopie medium door Leibovitz van L-15 met 10% foetale runderserum en 10 ng/mL van epidermale groeifactor 1 µg/mL hydrocortison aan te vullen.
    Opmerking: De L-15 bevat al 2 mM L-glutamine, dus het is niet nodig om toe te voegen extra zoals in het geval van MCDB-131 media.
  8. Meng 1 μL van 1 mg/mL Hoechst kleurstof met 1 mL L-15 volledige media en voeg deze toe aan elk putje om vlek de cellen kernen. Plaats van de cellen in de weefselkweek incubator voor 10 min en vervolgens vervangen in elk putje de L-15 volledige media met 1 mL van de volledige media L-15 aangevuld met 20 µg/mL gentamicine. Dekking de plaat met de deksel en de plaats in van een Microscoop milieu kamer (Zie Tabel van materialen) geëquilibreerd aan 37 ˚C.
    Opmerking: Voor imaging, een omgekeerde epifluorescence Microscoop werd gebruikt met een CCD-camera (Zie Tabel van materialen) en een 20 X air plan fluoriet lucht doelstelling met 0,75 NA. De macht werd ingesteld op 50% en de belichtingstijd tot 50 ms. de Microscoop filters die worden gebruikt voor mCherry 470/525 nm voor excitatie en uitstoot respectievelijk.
  9. Afbeelding meerdere posities elke 5 min een autofocus functie om te controleren hoe Lm verspreid door HMEC-1 monolayers ontpit op verschillende stijfheid hydrogels.
    Opmerking: L-15 is gebufferd met HEPES, dus het is niet nodig om CO2 tijdens de beeldvorming.

Representative Results

ECM stijfheid-afhankelijke gevoeligheid van cellen van de HMEC-1 voor Lm-infectie:
PA hydrogels verschillende stijfheid, alle oppervlak-gecoat met collageen I, werden gebouwd op multi goed glazen bodem platen zoals beschreven in stap 1 van het protocol (Zie Figuur 1). AFM metingen werden uitgevoerd om te bevestigen de exacte stijfheid van de hydrogels, zoals eerder beschreven26,27 (Zie Figuur 2). Afgelopen studies hebben aangetoond dat de plaatselijke naleving van het membraan van de kelder van endotheliale cellen van 1 kPa (b.v., hersenweefsel) tot 70 kPa (b.v., aorta)36,37,38, variëren kan 39 , 40. Daarom, kozen we voor het testen van de besmetting van HMEC-1 cellen die zich op matrices met de volgende stijfheid: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa en 70 kPa. Voor elke hydrogel stijfheid, waren zes hydrogels gefabriceerd om na te gaan van de reproduceerbaarheid van de resultaten.

Stroom cytometry werd gebruikt voor het beoordelen van de gevoeligheid van de ECM-stijfheid-afhankelijke cellen van de HMEC-1 voor Lm-infectie (Zie Figuur 3). HMEC-1 cellen waren besmet met een Lm-stam (JAT985) die een fluorescerende markeerdraad na de internalisering (actAp::mTagRFP), waardoor de detectie van intracellulaire bacteriën enige (Zie figuren 1 L - 1N) uitdrukt. JAT985 ontbreekt ook ActA, het uitschakelen van de bacteriën verspreiden van cel naar cel, aangezien ActA is noodzakelijk voor de vorming van actine komeet staarten en verdere bacteriële verspreiding. 7 - 8 h na infectie, infectie van de HMEC-1 cellen werd beoordeeld met behulp van stroom cytometry. Om ervoor te zorgen de analyse van afzonderlijke cellen, was het grootste deel van de distributie van de graven van de cel gated met behulp van het doorsturen versus kant scatterplot, en vervolgens een tweede gating stap werd uitgevoerd om uit te sluiten van cellen die autofluorescence vertonen (Zie figuren 3A - 3 C ). De voorlopige resultaten afgebeeld in Figuur 3 blijkt dat HMEC-1 infectie met Lm ongeveer twee-voudige groter voor HMEC-1 cellen die zich bevinden op de stijve 70 kPa hydrogels in vergelijking met de cellen die zich bevinden op de zachte 0.6 kPa hydrogels (Zie cijfers 3B - 3D). de verhoogde vatbaarheid Lm infectie van cellen van de HMEC-1 op stijf in vergelijking met zachte matrices kan te wijten zijn aan: 1. verhoogd Lm hechting op HMEC-1; 2. verhoogde Lm invasie in HMEC-1; of 3. zowel de bovenstaande samen die zich voordoet. Om te testen welke hypothese houdt, HMEC-1 cellen waren ontpit op zachte (3 kPa) en stijf (70 kPa) hydrogels en besmet met constitutively GFP Lm uiten (Zie de figuren 4A - 4 C). De monsters werden vastgesteld kort na infectie en de externe (daaraan vastzittende) bacteriën waren bevlekt met antilichamen. Met behulp van kwantitatieve microscopie, vonden wij dat er aanzienlijk meer bacteriën vast te houden aan de HMEC-1 wanneer de cellen van de gastheer bevinden zich op stijf in vergelijking met zachte gels (Zie Figuur 4D). In overeenstemming met de stroom cytometry gegevens, zijn er beduidend meer bacteriën geïnternaliseerd door HMEC-1 wanneer de cellen van de gastheer bevinden zich op stijf in vergelijking met zachte gels (Zie Figuur 4E). Echter, de invasie efficiëntie (bacteriën geïnternaliseerd/totaal aantal bacteriën) van Lm in HMEC-1 cellen is vergelijkbaar, ongeacht substraat stijfheid (Zie Figuur 4F).

Tractie kracht microscopie van HMEC-1 Lm-geïnfecteerde cellen:
LM infectie van cellen van de HMEC-1 kon de biomechanica van besmette gastheer cellen, met inbegrip van de sterkte van de bijlage aan hun ECM of aan elkaar, waardoor de integriteit van hun barrière wijzigen. Wij willen beoordelen of dat het geval kunnen zijn zou met behulp van tractie Force microscopie32 cel-ECM tractie krachten en enkelgelaagde Stress microscopie41 voor de berekening van de intracellulaire spanning krachten wilt berekenen. Figuur 5 toont kaarten van de vervorming veld, tractie stress veld en intracellulaire spanning gebied van cellen van de HMEC-1 op 20-kPa hydrogels op verschillende tijdstippen punten na infectie. Cijfers 5A - 5 D verwijzen naar niet-geïnfecteerde control HMEC-1 cellen terwijl cijfers 5E - 5 H verwijzen naar HMEC-1-cellen geïnfecteerd met Lm op een veelheid van infectie gelijk is aan 300 bacteriën/cel. Deze voorbereidende werkzaamheden suggereert dat geïnfecteerde cellen van de HMEC-1 de omvang van hun cel-ECM en intracellulaire benadrukt in de loop van een infectie met Lm verminderen, terwijl dat niet wordt waargenomen voor niet-geïnfecteerde cellen.

ECM stijfheid-afhankelijke Lm verspreiding over HMEC-1 monolayers:
Time-lapse microscopie werd gebruikt voor het onderzoeken van het effect matrix stijfheid heeft op Lm verspreiding via HMEC-1 monolayers. Als Lm via de enkelgelaagde verspreidt, maken de bacteriën een focus van infectie die als een functie van de tijd (Zie Figuur 6A en Video figuren 1 en 2 groeit). Het gebied van de infectie focus werd gemeten door het opstellen van een convex omhulsel, de kleinste convexe veelhoek die een verzameling van punten, rond de bacteriën42omvat. Er is geen standaard metrische in het veld voor het meten van de doelmatigheid van L. monocytogenes cel-naar-cel verspreiding via een monolayer van cellen van de gastheer. Om te beoordelen verspreiding efficiëntie, sommige hebben het aantal cellen van de gastheer van een infectie focus41geteld, en anderen hebben getrokken grenzen handmatig rond de groep van cellen43van de gastheer van de infectie. We kozen voor een convexe veelhoek om rond te tekenen de bacteriën, omdat het is een geautomatiseerde, consistent en rekenkundig goedkope proces voor het meten van de doelmatigheid van L. monocytogenes verspreiding. Door dit te doen, vonden we een lichte daling in het focusgebied infectie in de cellen van de HMEC-1 ontpit op 70 kPa hydrogels in vergelijking met die zaadjes op 3 kPa matrices (Zie Figuur 6B en Video figuren 1 en 2). Om te bepalen van het tempo van de groei van de focus van de infectie, was de radiale afstand uitgezet als functie van de tijd door het nemen van de vierkantswortel van het gebied van de focus van de infectie en dit te delen door pi. Deze mathematische transformatie wordt ervan uitgegaan dat de vorm van de infectie focus ruwweg cirkelvormige44 is. Voor het meten van de snelheid van de groei van de focus, werd de mate van verandering (dat wil zeggen, de helling) van de radiale afstand voor beide 3 - en 70-kPa matrices gemeten. Deze benadering wordt toegelicht dat de infectie focus groeide sneller en monotoon in HMEC-1 cellen ontpit op 3-kPa matrices. Echter groeide de focus aanzienlijk langzamer (eerste 200 min) en iets trager (200 tot 600 min) in cellen ontpit op 70-kPa matrices (Zie Figuur 6C). Inderdaad, de analyse van verdere gegevens bevestigd dat de infectie focus, gemiddeld, twee-voudige langzamer in 70-kPa matrices, vooral tijdens de eerste 200 min groeide (Zie Figuur 6D).

Figure 3
Figuur 3 : ECM stijfheid-afhankelijke gevoeligheid van cellen van de HMEC-1 voor Lm invasie gemeten met behulp van stroom cytometry .  HMEC-1 cellen waren besmet met Lm (JAT985) en de infectie werd geanalyseerd door stroom cytometry. A. dit paneel toont een kant tegenover doorsturen scatterplot voor representatieve HMEC-1 cellen afkomstig van een enkele goed. De verdeling van de bulk van de cellen werd geselecteerd via gating uitsluiten van puin (links) en cel paren of drieling (rechts). B. deze grafiek ziet u een histogram van de logaritme van de intensiteit van de fluorescentie Lm per cel voor HMEC-1 verguld op zachte 0.6 kPa. C. deze grafiek toont een histogram van de logaritme van de intensiteit van de fluorescentie Lm per cel voor HMEC-1 verzinkt op stijve 70 kPa hydrogels. De histogrammen voor N = 4-6 replicatieonderzoeken worden weergegeven in verschillende kleuren. De controle niet-geïnfecteerde cellen histogram is paars. De poort gebruikt om te definiëren wat is geïnfecteerd is in rood weergegeven. De MOI is 100 en de infectie was beoordeeld 8 h na infectie. D. gegevens tonen percentage van geïnfecteerde cellen van de HMEC-1 versus hydrogel stijfheid (N = 5). De horizontale balken verbeelden de gegevens betekenen. De P-waarde werd berekend met de niet-parametrische Wilcoxon Rank-Sum test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video Figure 1
Video Figuur 1: verspreiding van intracellulaire Lm (rode kanaal) door middel van een HMEC-1 cel enkelgelaagde (fase) zaadjes op een substraat 3-kPa. De cellen waren beeld in Leibovitz van L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicine) binnen een milieu kamer geëquilibreerd aan 37 ˚C. De beelden werden verzameld elke 5 min. De snelheid van film is 15 frames/s. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video Figure 2
Video Figuur 2: verspreiding van intracellulaire Lm (rode kanaal) door middel van een HMEC-1 cel enkelgelaagde (fase) zaadjes op een substraat 70-kPa. De cellen waren beeld in Leibovitz van L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicine) binnen een milieu kamer geëquilibreerd tot 37 ° C. De beelden werden verzameld elke 5 min. De snelheid van film is 15 frames/s. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Youngs modulus (E, kPa) Acrylamide % (vanaf 40% voorraad) Bisacrylamide % (vanaf 2% voorraad)
0.6 3 0.045
3 5 0,075
10 10 0,075
20 8 0.195
70 10 0,45

Tabel 1. Samenstelling van polyacrylamide (PA) hydrogels verschillende stijfheid. In deze tabel wordt het percentage voorraad 40% acrylamide oplossing en het percentage van de stockoplossing 2% BIB-acrylamide om een bepaalde stijfheid (Youngs modulus, E) worden aangeduid in verschillende kolommen.

Supplemental Material
Aanvullend materiaal 1. Berekening van intracellulaire spanning van berekende tractie stress. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Cellen kunnen een verscheidenheid van fysieke milieu signalen, waardoor niet alleen de cellen morfologie, maar ook hun gen expressie en eiwit activiteit, waardoor dus kritisch cel functies en gedrag45,46kunt voelen. De stijfheid van de ECM van cellen wordt steeds meer gewaardeerd als een belangrijke modulator van cellulaire motiliteit, differentiatie, proliferatie, en uiteindelijk cel lot47,48,49. Al zijn er vele recente vooruitgang in het begrip van de complexe biomechanische interactie tussen cellen en hun ECM, is weinig bekend over hoe milieu stijfheid is van invloed op de gevoeligheid van cellen voor bacteriële infectie. Ter vergemakkelijking van dergelijke studies, ontwikkelden we deze roman multi goed test gebaseerd op de reeds lang gevestigde fabricage van polyacrylamide hydrogels afstembare stijfheid die verenigbaar met de infectie testen50 is. Traditioneel, is een bacteriële infectie van cellen in de weefselkweek onderzocht op glas of polystyreen oppervlakken die ongeveer 1-3 ordes van grootte stijver dan de natuurlijke ECM van meest Adherente cellen8,51 zijn. De hier beschreven test opent nieuwe snelwegen doordat de studie van bacteriën-gastheer interacties in een fysiologisch relevante milieu stijfheid regime.

Voor het bewijs van concept van de voorgestelde bepaling, werden HMEC-1 cellen gekozen als model aanhangend gastheer cellen en Lm als een model bacteriële ziekteverwekker. De bepaling kan echter worden verlengd voor verdere studies, als op de juiste manier gewijzigd. Dergelijke studies kunnen betrekking hebben op besmetting van andere zoogdieren aanhangend host celtypes door extra ziekteverwekkers, zoals bacteriën en virussen. Voor deze bijzondere assay, gels zijn eiwitten-bedekt met collageen ik, maar het is afhankelijk van het celtype host, kunt u gebruik maken van het eiwit van een verschillende ECM-coating, zoals laminin of fibronectin, ter vergemakkelijking van de bijlage van de cellen van de gastheer van de rente over de hydrogel 52. een aanvullende vergoeding die afhankelijk van het celtype host is het bereik van de stijfheid hydrogel worden bestudeerd. Het bereik van stijfheid moet afhangen van wat is fysiologisch relevant voor de specifieke host celtype en hoe goed die host hecht een enkelgelaagde vormen op een bepaalde stijfheid hydrogel. Ook, afhankelijk van het model pathogen wensten te worden onderzocht, lichte wijzigingen mogelijk moet worden toegepast op de bepaling van de infectie die hierin worden beschreven.

De innovatie van de bepaling in vergelijking met de vorige methoden voor productie polyacrylamide hydrogels24,50,53 in bepaalde unieke functies ligt geïntegreerd in de bepaling van de voorgestelde infectie. Ten eerste zijn de hydrogels gebouwd op multi goed onder glasplaten, waarmee de screening van meerdere voorwaarden gelijktijdig evenals de automatisering van bepaalde procedures. Monitoring meerdere voorwaarden op hetzelfde moment of meerdere replicatieonderzoeken is van cruciaal belang omdat de uitkomst van een dergelijke aanpak kan worden beïnvloed door factoren zoals de ontvangende cel passage en het precieze aantal bacteriën toegevoegd aan het infecteren van de gastheren te onderzoeken, die vaak wijzigen tussen onafhankelijke experimenten. Een extra bijzonderheid van deze bepaling is dat de hydrogels een hoogte van ongeveer 40 µm hebben, die is dun genoeg om het imago met behulp van klassieke microscopie. We toonden dat we met succes uitvoeren kunnen levende cel microscopie en fixatie van de cel zowel immunokleuring gevolgd door imaging, zonder hoge achtergrond fluorescentie. Tot slot de hydrogels bestaan uit twee lagen, met de bovenste plaat fluorescerende microbeads, opgesloten in een enkele brandvlak hebben ingesloten. Dit kenmerk zorgt ervoor dat er geen out-of-focus licht mengen tijdens imaging. De aanwezigheid van de parels kan zowel het onderzoek naar de oppervlakte topografie van de gels om ervoor te zorgen dat ze zijn uniform en verbetert de prestaties van TFM en MSM24,32,41. Met TFM en MSM is het mogelijk om te berekenen van de cel-cel en cel-ECM krachten respectievelijk van cellen die zich op verschillende stijfheid matrices. Met deze nieuwe test, is het mogelijk te maken van dergelijke metingen van fysieke krachten door het vergelijken van beide de bijdrage van milieu stijfheid en infectie gelijktijdig. Na een dergelijke aanpak, de infectie effect heeft op de gastheercel mechanica in haar loop kan worden bepaald. Bovendien, de evolutie van de intracellulaire stress van cellen kan worden berekend met behulp van MSM en kan worden gebruikt als een maatregel van de integriteit van de barrière van de enkelgelaagde. Tot slot, gezien de multi goed aard van de test, is het mogelijk om gelijktijdig farmacologische en genetische verstoringen met een bacteriële infectie, te onderzoeken in meer diepte het complexe samenspel tussen gastheer cel mechanica en infectie.

Een inherente beperking van de techniek in de stijfheid van de substraat effect ligt zou kunnen hebben op het tempo van de proliferatie van de cellen. Meestal in infectie testen moeten ervoor zorgen dat de celdichtheid host onder verschillende omstandigheden hetzelfde. Dat komt omdat de celdichtheid zelf kan een effect hebben op de gevoeligheid van gastheren aan infectie. De HMEC-1-cellen die werden gebruikt als gastheer cellen weergeven een significant verschil in hun nummer wanneer geplaatste gedurende 24 uur op de hydrogels niet. Verschillende soorten cellen kunnen echter differentiële proliferatie, afhankelijk van de stijfheid van de hydrogel, die kan infectie studies bias vertonen. Ook kan bias van de infectie ontstaan wanneer cellen geen monolayers vormen of koppel niet goed op de hydrogels, zoals treedt op wanneer bepaalde soorten cellen worden overgeënt op zeer zacht matrices (b.v., menselijke navelstreng endotheliale cellen of Madin-Darby canine kidney epitheliale cellen zaadjes op 0.6-kPa hydrogels54,55). Wat ziekteverwekkers betreft, bepaalde bacteriën (bijvoorbeeld Borrelia burdgorferi) kunnen koppelen naar host cellen en vallen ze maar ook via hen kunt transmigrate56. We hebben nog niet getest als deze test voor pathogen transmigratie studies zou werken, maar het lijkt mogelijk aangezien vorige studies over transmigrating endotheliale cellen ontpit op PA hydrogels neutrofielen zijn gedocumenteerd te werken succesvol57. Er zijn veel studies verricht waaruit blijkt hoe voor de vervaardiging van polyacrylamide hydrogels van een bepaalde Youngs modulus door het mengen van de juiste concentraties van acrylamide en bis-acrylamide24,25,26 ,27. Vooral wanneer een verlangens TFM experimenten uitvoeren op cellen op hydrogels verschillende stijfheid, is het echter cruciaal voor het bevestigen van de verwachte stijfheid van de hydrogels via AFM of andere inspringing technieken58. Lichte afwijkingen van de verwachte waarde kunnen ontstaan als gevolg van een ander oplosmiddel gebruikt of een stamoplossing leeftijd acrylamide, of door de manieren AFM metingen zijn uitgevoerd (bijvoorbeeldde vorm van de AFM tip). Tot slot, de hierin gepresenteerde benadering is gebaseerd op het zaaien van de cellen van de gastheer op 2D matrices, die van een realistischer en fysiologisch relevante 3D scenario afwijken kunnen. Echter omvat productie 3D gels met afstembare stijfheid, zaaien ze met cellen van de gastheer en vervolgens besmetten ze met ziekteverwekkers, nog steeds bepaalde technische problemen. Wij verwachten evenwel dat wij in de nabije toekomst kunnen uitbreiden van de huidige bepaling zullen voor de studie van infectie in een 3D omgeving.

Kortom, het beschreven protocol samen met de voorlopige resultaten bewijzen dat deze nieuwe bepaling een uiterst nuttig hulpmiddel voor de studie van infectie van aanhangend gastheer cellen met pathogene bacteriën op een kwantitatieve manier en in een nog veel meer kan worden fysiologisch relevante milieu dan eerder onderzocht. De kracht van het fabriceren van polyacrylamide hydrogels in de voorgestelde setup ligt daarin de bepaling compatibel met de prestaties van meerdere technieken zoals stroom cytometry, immunokleuring is gevolgd door de lichte microscopie en tractie kracht microscopie. De bepaling kan worden gebruikt voor studies waarbij de infectie van andere aanhangend host celtypes door ziekteverwekkers, dat wij zal hebben een aanzienlijke invloed verwachten in zowel het ontrafelen van de strategieën waarbij pathogenen infecteren hosts en bij het bevorderen van de ontwikkeling van therapeutische interventies tegen infecties.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Onze dank aan M. voettekst, R. Lamason, M. Rengaranjan en leden van de Theriot Lab voor hun discussies en experimentele ondersteuning. Dit werk werd gesteund door NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), de HHMI Gilliam Fellowship voor geavanceerde studie (F.E.O.), de Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) en de American Heart Association (E.E.B.). Stroom cytometry werd uitgevoerd op de Stanford gedeeld FACS faciliteit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Tags

Immunologie en infecties probleem 137 aanhanger zoogdiercellen bacteriële infectie endotheel stroom cytometry tractie kracht microscopie polyacrylamide hydrogels immunokleuring substraat stijfheid
Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter