Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Recombinante colágeno péptido Microcarriers para la extensión celular y su posible uso como sistema de células en un biorreactor modelo

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Proponemos un protocolo de expansión de la célula en microcarriers macroporoso y su uso como sistema de envío en un biorreactor de perfusión a una matriz de tejido decellularized de la semilla. También se incluyen diferentes técnicas para determinar la proliferación celular y la viabilidad de las células cultivadas en microcarriers. Además, demostramos la funcionalidad de las células después de culturas del biorreactor.

Abstract

Ingeniería de tejidos es un campo prometedor, centrado en el desarrollo de soluciones para la creciente demanda en los tejidos y órganos en relación con fines de trasplante. El proceso para generar dichos tejidos es complejo e incluye una adecuada combinación de tipos celulares específicos, andamios y estímulos físicos o bioquímicos para guiar la diferenciación y crecimiento celular. Microcarriers representan una atractiva herramienta para expandir las células en un microambiente (3D) tridimensional, ya que ofrecen mayor superficie para proporciones de volumen e imitar más de cerca la situación en vivo en comparación con los métodos tradicionales bidimensionales. El sistema vascular, suministrando oxígeno y nutrientes a las células y garantizar la eliminación de desechos, constituye un bloque de edificio importante al generar ingeniería de tejidos. De hecho, la mayoría de construcciones no después de ser implantado debido a carecer de apoyo vascular. En este estudio, presentamos un protocolo para la expansión de células endoteliales en microcarriers basados en colágeno recombinante bajo condiciones dinámicas en matraz de spinner y biorreactores, y explicamos cómo determinar viabilidad celular de configuración y funcionalidad. Además, proponemos un método para la entrega de células para propósitos de vascularización sin medidas de separación adicional necesarios. Además, ofrecemos una estrategia para evaluar la vascularización de la célula potenciales en un biorreactor de perfusión en una matriz biológica decellularized. Creemos que el uso de los métodos presentados podría conducir al desarrollo de nuevas terapias basadas en células para una amplia gama de usos en la práctica clínica de la ingeniería del tejido.

Introduction

Un problema general en aplicaciones de ingeniería de tejidos es rendir una masa celular alta con el fenotipo de diferenciación correcto en la situación de necesidad. La aplicación de microcarriers para abordar este tema comenzó en 1967 con el aumento de importancia hasta la fecha en campos tales como ingeniería de tejidos Ortopedia para generación a gran escala de piel, hueso, cartílago y tendones1. Permiten el manejo de cultivos adherentes de manera similar a la de suspensión culturas2 mediante la expansión de células en sustratos de (3D) tridimensionales de microescala. Tal modo células experimentan una fuente homogénea de nutrientes y las interacciones célula-matriz que conducen a un mejor mantenimiento en vivo3,4 diferenciación que a menudo se pierde en el tiempo en 2D acerca a5. Una mayor relación superficie a volumen - eventualmente conduce a rendimientos6,7más alto de la célula, más gas y nutrientes los tipos de cambio en comparación con sistemas estáticos8, la posibilidad de regular y someter la cultura a la física estímulos9y el potencial para la intensificación de los procesos de expansión7 son ventajas. Varias características como el diámetro, densidad, porosidad, carga superficial y adherencia propiedades10,11 distinguen los diferentes disponibles en el mercado micro - y macro-portadores. Sin embargo, una de las principales ventajas es su potencial microtissues entrega a demanda o defecto del sitio.

Para las aplicaciones de la tecnología de potencia en ingeniería del tejido fino del hueso, nos ilustra en un anterior informe12 la producción de una nueva potencia tipo constituido por un colágeno recombinante péptido (RCP, comercialmente disponible como Cellnest). Esta nueva potencia permite el GMP obediente a escala de la producción de andamio y de la célula, según sea necesario para la entrega de la célula en un escenario clínico. En este contexto, ajuste de estabilidad del andamio, tasa de degradación y propiedades superficiales a través de la elección adecuada de una estrategia de reticulación adecuado permite adaptar la técnica para la aplicación seleccionada, tipo de interés de la célula o tejido13de destino. En particular, el empleo potencial de esta potencia como un sistema celular inyectable para uso terapéutico14 hace particularmente interesante en un ajuste clínico.

En este trabajo, por lo tanto, ilustramos el procedimiento de cultivo para el aislamiento y la expansión de la médula ósea mesenquimales estromales células humanas (hBMSCs) y dérmicas microvasculares células endoteliales humanas (HDMECs) en recombinante colágeno basado en péptido-basada microcarriers y su preparación para el parto en un ajuste clínico. Además, describimos protocolos adicionales útiles para el mantenimiento de la viabilidad celular en implantación.

Viabilidad celular después de la implantación de hecho es fuertemente dependiente de vascularización15,16,17, que garantiza el intercambio de oxígeno y nutrientes y facilita la eliminación de desechos. Biorreactores constituyen un método para superar los desafíos de la vascularización en la ingeniería de tejidos y mantener la viabilidad de las células, mediante perfusión de tal modo proporcionando oxígeno y nutrientes18de medio de cultivo. Aquí, nos ilustran un método en vitro para evaluar la capacidad de migración de las células endoteliales microvasculares de la RCP microcarriers un biomatrix y su capacidad para contribuir a la vascularización de novo y la angiogénesis. Este biomatrix es un segmento decellularized del yeyuno porcina denominado BioVaSc (biológica andamio vascularizado), rica en colágeno y elastina y con conserva estructuras vasculares, que incluye una alimentación de la arteria y una vena drenaje19 que ha sido aplica para problemas de implantación20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hBMSCs fueron aislados de la cabeza del fémur de pacientes de osteoartritis sometidos a cirugía de reemplazo de cabeza de fémur. El procedimiento se realizó bajo la aprobación del Comité Local de ética de la Universidad de Wuerzburg y consentimiento informado de los pacientes. Las células endoteliales microvasculares primarias fueron aisladas de biopsias de prepucio de donantes menores. Su representante legal había proporcionado consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por la junta local de ética de la Universidad de Wuerzburg (voto 182/10).

1. aislamiento de hBMSCs y HDMECs

  1. Médula ósea mesenquimales estromales células humanas (hBMSCs)
    1. Quitar el hueso esponjoso de la cabeza del fémur mediante una cuchara estéril.
      Nota: El hueso esponjoso aparece como una sustancia suelta y granular dentro del hueso cortical, que es duro y rígido. Puede ser necesario rascar partes del hueso esponjoso del hueso cortical mediante el uso de un bisturí.
    2. Introducir el hueso esponjoso quitado en dos tubos de 50 mL. El volumen de hueso esponjoso puede variar de 5 a 10 mL según la dimensión de la cabeza del fémur quitado durante la cirugía de reemplazo de cadera.
    3. Lavado con DMEM-F12 (mezcla 1:1 de medio DMEM y Ham F12), llenar el tubo con aproximadamente 30 mL de medio.
    4. Agitar el tubo manualmente, de manera longitudinal, para 5 s dejar que las células adiposas en el hueso esponjoso. Centrifugar a 300 x g y 22 ° C durante 5 minutos.
    5. Aspiración con una pipeta graduada de plástico, la capa de células de grasa y aproximadamente 20 mL del sobrenadante restante. Deje suficiente medio para cubrir el hueso esponjoso.
    6. Llenar los tubos con 10 ml de DMEM-F12 y agite vigorosamente longitudinalmente a mano, para 10-15 s, para las células.
    7. Transferencia de 10-15 mL de suspensión celular con una pipeta graduada de plástico de los tubos a un nuevo tubo de 50 mL.
    8. Repetir 2 - 3 veces de paso 1.1.6 agrupación juntos la suspensión celular obtenida hasta que el hueso esponjoso en el tubo de 50 mL es de color blanco.
    9. Transferir la suspensión de células con una pipeta graduada de plástico a dos nuevos tubos, evitando la aspiración de la pelotilla de colágeno depositada en la parte inferior de los tubos de 50 mL.
    10. Centrifugue la suspensión de células a 300 x g y 22 ° C durante 5 minutos eliminar el sobrenadante por aspiración con una pipeta graduada de plástico.
    11. Añadir 40 mL de DMEM-F12 10% FCS 1% pluma/Strep 50 μg/ascorbato-2-fosfato en un tercer tubo. Transferir 5 mL de este medio a cada tubo que contiene el precipitado de células. Resuspender el pellet celular por oscilar vigorosamente la parte inferior de los tubos y las suspensiones de células de transferencia al tubo que contiene medio único.
    12. OPCIONAL: Diluir 100 μl de suspensión de células para el recuento de células, diluyendo 1: primer 100 con PBS y luego 1:10 en azul de tripano, añadiendo 15 μl de la primera dilución 15 μl de DPBS y 30 μL Trypan azul para obtener un DPBS: proporción de azul de tripán 1:1. Contar las células con una cámara de Neubauer estándar.
    13. Las células en 109 células/175 cm2 T frasco de 25 mL de medio de la semilla como se describe en 1.1.11. O bien, dividir la suspensión de células enteras en frascos de cultivo de células de2 hasta 10 de 175 cm sin tener en cuenta. En esta etapa, no son distinguibles de los eritrocitos, que los superan enormemente a hBMSCs. hBMSCs aparecen como colonias escasas (1-2/frasco) en el transcurso de los primeros 7 días.
    14. Medio de cambio después de 4 días de la siembra para permitir la interacción de las células de la sangre con el hBMSCs. Tras el primer intercambio medio, cambiar el medio cada 2-3 días. Realizar el intercambio medio quitar completamente el medio de cultivo con una pipeta de plástico graduada, lavando dos veces con DPBS (por adición de 10 mL de DPBS a las células adherentes y remover completamente la DPBS con una pipeta graduada de plástico) y luego añadir 20 mL de medio fresco, tal como se describe en 1.1.11.
  2. Células endoteliales microvasculares cutáneas humanas (HDMECs)
    1. Tratamiento de las biopsias de piel y aislar el HDMECs según protocolos previamente publicados21. Brevemente, después de la separación de la dermis de la epidermis, incubar la dermis en tripsina por 40 min a 37 ° C y 5% CO2. Después de tiempo de incubación, transferir la dermis a una placa Petri conteniendo medio de cultivo y raspar cada pieza con el uso de un bisturí. Transferir la suspensión celular obtenida a un tubo de plástico de 50 mL y centrifugar durante 5 min a 300 x g y 22 ° C. Cuenta de la suspensión celular con una cámara de Neubauer y la semilla a una densidad de 1.2 x 104 células/cm2. Cambiar el medio completamente cada día.

2. preparación y esterilización de los frascos de spinner, microcarriers RCP y biorreactor

  1. Hilandero y el RCP microcarriers
    1. Un día antes de los experimentos, puesta en marcha la ruleta frascos y prepararlos para la esterilización por autoclave.
      Nota: Dejar los tapones de los frascos de spinner sueltos y, cuando sea posible, esterilizarlas en posición vertical.
      1. Envuelva los frascos de spinner con papel de aluminio alrededor de las tapas laterales por separado para evitar la contaminación durante desenvolver. Envuelva los frascos con 1-2 capas de papel de aluminio para el autoclave con el fin de minimizar los riesgos de contaminación después de la esterilización.
    2. Pesar la cantidad necesaria de RCP macroporoso microcarriers en 20 mL de DPBS.
      Nota: se requiere matraz spinner, 30 mg. Que Hidrate durante al menos 1 h antes de la esterilización por calor en autoclave (121 ° C durante 15 min).
  2. Biorreactor de perfusión
    1. Utilice el sistema de biorreactor descrito para producir tejido vascularizado equivalentes20. Este biorreactor consiste en un recipiente, en el cual se coloca el biomatrix, un tanque medio y una botella de presión.
      1. Conectar el recipiente con el depósito medio y la botella de presión a través de tubos de silicona (ver figura 3). Deje el capuchón suelto colocarlo en una bolsa de autoclave, cerrar bien y colocar esto en una segunda bolsa de autoclave. Esterilizar por autoclave.

3. cultura de hBMSCs y HDMECs en RCP macroporoso microcarriers

Nota: El HDMECs utilizados el microcarriers RCP la semilla fueron etiquetadas con RFP por transducción lentivirales. Este protocolo fue modificado después de un protocolo previamente publicados5.

  1. Que la RCP macroporoso microcarriers settle al fondo y lavar con 10 mL de medio de cultivo. Repita 3 veces.
  2. Lavar matraces de spinner con 10 mL de medio de cultivo.
  3. Añadir 30 mg de RCP macroporoso microcarriers cada frasco spinner en 8 mL de medio de cultivo. Equilibre los frascos de ruleta que contiene el microcarriers RCP a 37 ° C y 5% de CO2 por 30 min, antes de sembrar las células.
    Nota: Esto se basa en el peso seco aproximado de microcarriers RCP antes de la esterilización.
  4. Cada frasco de spinner en 2 mL de medio de cultivo de la semilla 5 x 105 hBMSCs o HDMECs (paso 3).
  5. Coloque los frascos spinner en la placa de agitador y comienzo mezclando 90 rpm por 5 min y el resto por 55 min, a 37 ° C y 5% CO2, para un total de 1 h de incubación de estática/dinámica. Repetir 4 veces.
  6. Añadir 10 mL de medio de cultivo celular por frasco de spinner y comience a continua agitación a 95 rpm. Incubar a 37 ° C y 5% CO2.
  7. Con el uso de una micropipeta tomar muestras en días 1, 4 y 7:333 μl ADN contenido (~ 0.5 mg), 1000 μL para el análisis de SEM (~ 1.5 mg) y 333 μL para la tinción de live/dead (~ 0.5 mg).
    Nota: Esto se basa en el peso seco aproximado de microcarriers RCP antes de la esterilización.
  8. Cambio 10 mL de medio de cultivo cada dos días. Para ello, espere a que el RCP microcarriers settle al fondo y aspirar con cuidado 10 mL del frasco de la Hilandera, con el uso de una pipeta de 10 mL y luego añadir 10 mL de medio de cultivo fresco.
  9. Mantener los cultivos en la placa del agitador en rpm 95, a 37 ° C y 5% de CO2 por 7 días.

4. contenido de ADN, análisis de SEM, vivo muerto tinción y análisis de germinación

  1. Contenido de ADN
    1. Con el uso de una micropipeta, recoger aproximadamente 0,5 mg de microcarriers de cada frasco de spinner (contenido en 333 μl de la suspensión) y la transferencia a un tubo de plástico de 2 ml.
      Nota: Esto se basa en el peso seco aproximado de microcarriers RCP antes de la esterilización.
    2. Lavar una vez con 1 mL de DPBS y luego aspirar el sobrenadante.
    3. Eliminar el remanente DPBS en un liofilizador y la microcarriers liofilizado para la posterior normalización de peso.
    4. Congelar las muestras a-80 ° C durante al menos 6 h.
    5. Incubar las muestras a 60 ° C durante la noche con la papaína 300 μL 5 U/mL.
    6. Establecer las curvas de valoración apropiada siguiendo las instrucciones de manufacturer´s de la prueba de cuantificación (p. ej., ensayo de dsDNA PicoGreen) kit y realizan la medida de la señal fluorescente a 520 nm con un detector de luminiscencia.
  2. Análisis análisis de microscopia electrónica (SEM)
    1. Recoger aprox. 1 mg de microcarriers de cada frasco de spinner y transferencia a un tubo de plástico de 2 mL.
    2. Lavar microcarriers una vez con 1 mL de DPBS.
    3. Quitar DPBS e incubar en 1 mL de etanol al 70% durante 1 hora.
    4. Eliminar el sobrenadante e incubar en 1 mL de etanol al 80% durante 1 hora.
    5. Eliminar el sobrenadante e incubar en 1 mL de etanol al 90% durante 1 hora.
    6. Eliminar el sobrenadante e incubar en 1 mL de etanol al 100% durante 1 hora.
    7. Eliminar el sobrenadante e incubar en 1 mL de hexamethyldisilazane durante 10 minutos.
    8. Abrir la tapa y deje que las muestras seque durante la noche bajo una campana química.
    9. Fijar las muestras de apoyo adecuado y proceder a análisis SEM según protocolos establecidos.
  3. DAPI y Live/Dead tinción
    1. En el día 2, 4 y 7 después de la siembra en el microcarriers célula recoger 0,5 mg de microcarriers de cada frasco de spinner y transferencia a un tubo de plástico de 2 mL. Lavar una vez con 1 mL de DPBS.
    2. DAPI
      1. Fijar las muestras durante 10 minutos en suficiente paraformaldehído al 4% para cubrirlos.
      2. Lavar una vez con 1 mL de DPBS.
      3. Incubar a temperatura ambiente con la solución de tinción por 45 min en un agitador oscilante.
      4. Detectar la señal fluorescente DAPI en un microscopio de epifluorescencia con un filtro de emisión de 420 nm y adquisición de imágenes.
    3. Live/Dead tinción
      1. Incubar las muestras en 500 μl de solución de tinte de vivos o muertos. Mantener las muestras a 37 ° C por 20 min, protegido de la luz.
      2. Lavar una vez con 1 mL de DPBS.
      3. Detectar la señal de fluorescencia de las células vivas con un filtro de emisión de 490 nm y de células muertas con un filtro de emisión de 545 nm en un microscopio de fluorescencia. Adquisición de imágenes.
    4. Ensayo de despunte para HDMECs
      1. Μl de la mezcla 330 del colágeno R solución 0,4% 170 μl de ácido acético al 0.1% y 50 μl de medio M199 en un tubo de plástico de 15 mL. Mantener en hielo.
      2. Tome ~0.375 mg de microcarriers (250 μL) con el uso de una micropipeta. Transferir a un tubo de plástico de 1,5 mL, esperar a que el RCP microcarriers a instalarse en la parte inferior y retire el medio completamente.
        Nota: Esto se basa en el peso seco aproximado de microcarriers RCP antes de la esterilización.
      3. Añadir el volumen de NaOH 0.2 N necesario para neutralizar la mezcla de colágeno y se mezcla inmediatamente con la RCP microcarriers.
        Nota: Determinar la cantidad necesaria de NaOH 0.2 N previamente añadiendo a la mezcla hasta el cambio en el pH (vuelta de color amarillo a rosa) y luego colocando la mezcla en la incubadora durante 1 min, después de lo cual se debe formar un gel.
      4. La mezcla de microcarriers RCP gel de colágeno en un pozo de una placa de 24 pocillos de la placa. Incubar a 37 ° C y 5% CO2 durante 30 minutos.
      5. Añadir 200 μL del factor de crecimiento endotelial vascular (p. ej., medio de cultivo VascuLife VEGF-Mv). Incubar a 37 ° C y 5% CO2 durante 24 h.
      6. Observar bajo un microscopio de contraste de fase inversa, usando un 10 X objeto de ampliación y adquisición de imágenes.

5. Biomatrix siembra y comienzo del sistema de biorreactor para HDMECs

  1. Un día antes de las culturas del biorreactor, cortar abierto BioVaSc (biomatrix) longitudinalmente en el lado de saculaciones y fijar en un marco de policarbonato previamente desinfectados (vea la Figura 3A, B).
    Nota: El BioVaSc es una biomatriz de un segmento yeyunal porcino decellularized, preparado como anteriormente publicado21.
    Nota: como el marco de policarbonato no se puede esterilizar por calor, desinfectarla por incubación de 20 minutos en baño de ultrasonidos (40KHZ) seguido por la incubación 3 veces en etanol 70% durante 25 minutos. Luego, lavar el marco 3 veces con DPBS estéril.
    1. Coloque el sistema biomatrix marco en una placa de Petri de 100 mm y llenarlo con el factor de crecimiento endotelial vascular + 1% penicilina estreptomicina (Pen/Strep).
    2. Equilibre la biomatriz de incubar durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.
  2. Después de separar y contar las células, inyectar 10 x 107 HDMECs en 1000 μl de medio de cultivo a través de la vasculatura conservada de biomatrix, con el uso de una jeringa de 2 mL.
    Nota: Inyectar ~ 700 μl a través de la entrada arterial y ~ 300 μl a través de la vena.
  3. Incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 3 h, para permitir el accesorio de la célula.
  4. Llene el sistema de biorreactor con 350 mL del factor de crecimiento endotelial vascular + 1% pluma/Strep e incubar a 37 ° C y 5% CO2.
  5. Coloque el marco dentro de la nave del biorreactor. Conecte los pedículos arteriales y venosos al recipiente.
  6. Iniciar perfusión conectando el sistema biorreactor con una bomba peristáltica. Ajustar la presión a 10 ±1 mmHg y amplitud.
  7. Aumentar la presión paso a paso cada hora hasta llegar a 100 mmHg de presión, amplitud ± 20.
  8. Mantener el sistema de biorreactor durante 7 días bajo estas condiciones en 37 ° C y 5% CO2.

6. adición de RFP-HDMECs a la biomatrix

  1. Mezcla 330 μl de solución de colágeno R 0,4% 170 μl de ácido acético al 0.1% y 50 μl de medio M199 en un tubo Falcon de 15 mL. Mantener en hielo.
  2. Tome el microcarriers RCP de los frascos de spinner. Eliminar completamente el medio de cultivo.
  3. Añadir el volumen de NaOH 0.2 N necesario para neutralizar la mezcla de colágeno y se mezcla inmediatamente con la RCP microcarriers.
  4. Agregar la mezcla de microcarriers RCP gel de colágeno en el lumen de la biomatrix. Permite congelación durante 30 minutos.
  5. En paralelo, cambie el medio del biorreactor quitando completamente el medio y luego agregar 350 mL de fresca, pre calentado, factor de crecimiento endotelial vascular + 1% pluma/Strep.
  6. Conecte el biorreactor a la bomba peristáltica y establecer la presión en 100 ± 20 mmHg y de la amplitud.
  7. Cambiar el medio cada 7 días.
  8. Mantenga el biorreactor en cultura durante 21 días.

7. Análisis y lecturas de las culturas del biorreactor

  1. Preparación de las muestras
    1. Desconecte la biomatriz de biorreactor y quitar en la estructura de policarbonato.
    2. Cortar la pieza obtenida en 6 secciones: 2 para torneo, 2 para parafina inclusión, tinción y 2 para el análisis de SEM.
  2. Inclusión en parafina
    1. Colocar los elementos en una placa Petri y lave con suficiente DPBS para cubrirlos. Deseche la DPBS.
    2. Fijar las secciones en paraformaldehído al 4% durante la noche.
    3. Preparar los cassettes para inclusión en parafina y realizar según protocolos estándar.
    4. Preparar las secciones de bloques de parafina y cortar muestras de 3 μm para la tinción de H & E, con el uso de un micrótomo.
  3. H & E tinción
    1. Rehidratar las secciones según protocolos estándar32de la mancha.
  4. Análisis análisis de microscopia electrónica (SEM)
    1. Colocar los elementos en una placa Petri y lave con suficiente DPBS para cubrirlos. Deseche la DPBS.
    2. Fijar las secciones con 4,75% glutaraldehído durante la noche.
    3. Realizar cadena de deshidratación con el aumento de las concentraciones de etanol 50% - 100%.
    4. Cubrir las secciones con hexamethyldisilazane (HMDS) durante 10 minutos, descartar el HMDS usados y añadir HMDS fresco.
    5. Permiten las secciones secas durante la noche bajo campana y luego preparar las muestras para la proyección de imagen.
  5. Bromuro de 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)
    1. Mezclar el reactivo MTT con el factor de crecimiento endotelial vascular, en una concentración de 1 mg/mL.
    2. Incubar las secciones en la solución MTT por 90 min a 37 ° C y 5% CO2.
    3. Observar las estructuras vasculares y semillas celular microcarriers macroscópico o bajo un microscopio de campo brillante, para detectar las células metabólicamente activas. Adquisición de imágenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Como se muestra en la figura 1A, obtuvimos gran número de células viables en la RCP microcarriers después de 7 días de la cultura, determinada por la coloración en vivo/muerto. Estos resultados fueron confirmados por análisis de SEM, en la cual microcarriers completamente colonizados fueron observados alrededor de los poros, les (figura 1B) llenando en parte. Por otro lado, experimentos en los que las células no fueron sembradas uniformemente dio lugar a varios microcarriers vacíos. Experimentos fallidos se caracterizan por un número anormalmente elevado de células muertas que no debe ser superior al 10% del importe total de la célula (figura 1). Por otra parte, la cuantificación de contenido de ADN de HDMECs presentó un incremento del dsDNA en el tiempo (figura 1).

Además, HDMECs RFP fueron capaces de mantener su funcionalidad después de la cultura en RCP microcarriers, como se muestra en la figura 2, donde las células adoptaron un fenotipo despunte cuando cultivadas en un gel de colágeno.

Además, solíamos RCP RFP-HDMECs-colonizados microcarriers semilla vuelve a la luz de la biomatriz de BioVaSc. Para esto, empleamos un sistema de biorreactor para perfusión fisiológica del tejido vascularizado equivalentes22 (figura 3) en el que cortó-abierto el biomatrix y colocado en un marco de policarbonato, para que la luz fue expuesta en una (incluso configuración Figura 3B).

Después de 21 días de las culturas del biorreactor, estuvieron presentes en la vasculatura conservada de la biomatrix, así como en la RCP microcarriers células metabólicamente activas (Figura 4A y figura 3B). Experimentos fallidos o una opción incorrecta de las rebanadas durante el seccionamiento de las muestras histológicas puede conducir a la ausencia de colonización de las células endoteliales en el lumen de los vasos de la biomatriz de o en el microcarriers. Estos resultados se podrían confirmar por el análisis de SEM de las secciones de biomatrix, donde se pudo observar que algunas zonas de la RCP microcarriers estaban todavía cubiertas por células y que la RCP microcarriers en proximidad cercana a la biomatrix (figura 4 y 4 D).

Por último, tinción H & E confirmó la presencia de HDMECs en el biomatrix, específicamente en las estructuras vasculares (figura 5A). Cuando se observa bajo microscopio de fluorescencia, las células colonizan las estructuras vasculares de la biomatriz resultaron para ser RFP-HDMECs (figura 5B), indicando la migración de las células de la RCP microcarriers el biomatrix. También se observaron algunos HDMECs RFP en el microcarriers RCP (figura 5 y 5 D). En experimentos en que las células hicieron no sobrevivió debido a alterado cultivo condiciones (por ejemplo, tiempos más cortos de la cultura), ellos no se podrían detectar dentro de la estructura vascular con ninguna de las técnicas previamente divulgadas (figura 5E y 5F ).

Figure 1
Figura 1: cultura de HDMECs y hBMSCs en RCP microcarriers. (A, C) live/dead coloración después de 7 días de culturas dinámicas. (B) análisis de SEM de HDMECs cultivadas en microcarriers RCP después de 7 días de culturas dinámicas. (D) contenido de ADN determinado por PicoGreen kit de ensayo. Datos expresados como media ± desviación estándar (n = 3). Barras de escala: 200 μm para el A 88 μm de B y 100 μm para C. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ensayo despunte. Se observan brotes de RFP-HDMECs en campo brillante (A) y fluorescencia microscopía (B), saliendo de la potencia RCP colonizado después de 24 h de cultivo en un gel de colágeno. (C) superposición de imagen. Barras de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: configuración Biomatrix y biorreactor. (A) preparación del biomatrix y montaje en el marco de policarbonato (B). (C) instalación de biorreactor. El buque está conectado con el depósito medio y la botella de presión a través de tubos de silicon, y todo el sistema está conectado a una bomba peristáltica. La presión se mide mediante un sensor de presión. AI: entrada arterial; VO: salida venosa. Esta figura ha sido modificada de Gröber et al. 22 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: lectura de biorreactor. Ensayo MTT realizada en una sección de biomatrix después de 21 días de la cultura, en el que se observaron células metabólicamente activas en la vasculatura conservada de la biomatriz de (A) , así como en la RCP microcarriers (B). (C, D) Imágenes de SEM de RCP microcarriers en una sección de biomatrix. Barras de escala: 0,28 cm para A, 0,45 cm para B, 47 μm para C y 225 μm para D. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: H & E tinción y fluorescencia imágenes. (A, C, E) H & E tinción. (B, D, F) Después de 21 días de la cultura, HDMECs RFP fueron observados dentro de la vasculatura de la biomatrix (flechas), así como la RCP microcarriers (cabezas de flecha). Barras de escala: 50 μm para A, D y 30 μm de E y f el. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Un objetivo de potencia es la expansión de las células manteniendo su diferenciación con el fin de entregar las células al lugar de necesidad. El método mentionado aquí introducir microcarriers RCP donde las células fueron capaces de colocar, proliferan y colonizan el microcarriers con alta densidad celular. Esto fue observado por vivir muertas o coloración, en la cual más del 90% de células viables fueron detectado mientras que sólo algunas células muertas fueron obtenidas después de 7 días de culturas dinámicas. Además, las imágenes de SEM confirmaron que las células de cubrían toda la superficie de la microcarriers después de 7 días de las culturas.

Para asegurar la supervivencia de la célula en modelos 3D, es importante mantener el suministro de oxígeno y nutrientes a las células y permite la eliminación de sustancias de desecho. Los vasos sanguíneos son las estructuras responsables de este proceso de cambio, en el que las células endoteliales juegan un papel clave ya que son las células que recubren la parte interior de los vasos sanguíneos23. Tienen la capacidad de proliferar, migrar, se adhieren, brotar y forman estructuras de nave24. Estas propiedades se mantuvieron después de la cultura de RFP-HDMECs en la RCP microcarriers, puesto que se observó que las células eran capaces de adoptar el fenotipo despunte (ver figura 2). Podríamos probar aquí que estos colonizados microcarriers RCP entrega efectivamente las células endoteliales primarias para volver a la semilla el lumen de vasos antiguos de la biomatriz de BioVaSc. Esto sugiere que nuestro sistema para ser conveniente mejorar la vascularización de los implantes de tejidos diseñados para aplicaciones clínicas. Derivados de esta matriz se han utilizado con éxito en vascularización enfoques25, como sistemas21,26,27,28 de la prueba así como en tumor en vitro y para la producción de equivalentes de piel como alternativas a la experimentación animal29. Aquí se utiliza en un circuito abierto, aplanado instalación y colocado en un biorreactor de perfusión como se aplica para la generación de tejido equivalentes22.

Biorreactores se han utilizado en la ingeniería de tejidos para producir equivalentes de tejido que podrían ayudar a aliviar la demanda de órganos y reducir los riesgos asociados como rechazo y morbilidad30. Sin embargo, producir tejido-como construcciones es un proceso muy complejo que involucra el uso de tipos de células de tejidos específicos, un andamio adecuado y factores de crecimiento apropiados que permiten la correcta diferenciación y montaje en 3D tejidos. Uno de los principales inconvenientes de las construcciones de ingeniería es la falta de una adecuada red vascular que apoya la supervivencia de las células tanto in vitro e in vivo17. Aquí combinamos el microcarriers colonizado de RCP con la matriz decellularized en un modelo de biorreactor, proporcionando el tipo celular requerido, un andamio que permite la adhesión celular y formación de vasos y un medio de cultivo específico que proporciona los factores esenciales para las células a proliferar y mantener sus propiedades funcionales. Un resultado importante de este modelo es la capacidad de las HDMECs para migrar desde la RCP microcarriers al andamio sin ninguna separación adicional o digestión según sea necesario en otros enfoques31. Luego, colonizaron específicamente las estructuras vasculares de la matriz, demostrando el concepto macroporoso microcarriers puede utilizarse como sistema de entrega de células para los propósitos de la medicina regenerativa.

En conjunto, este protocolo representa una estrategia prometedora en regenerativa para la obtención de una extensión máxima de la célula y podría servir como entrega de celulares a los sitios de implantación, donde se podría mejorar apoyo de vascularización de los injertos de ingeniería tisular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea séptimo marco programa FP7/2007-2013 bajo el acuerdo de donación n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Agradecemos Carolien van Spreuwel-Goossens de fabricación de Fujifilm Europe B.V., la asistencia técnica durante la RCP fabricación y Werner Stracke del Instituto Fraunhofer para ISC de la investigación del silicato, para obtener ayuda con el análisis de SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).

Tags

Colágeno recombinante de bioingeniería número 132 I péptido macroporosa microcarriers Cellnest célula expansión biorreactor de perfusión de frascos BioVaSc spinner brotación vascularización
Recombinante colágeno péptido Microcarriers para la extensión celular y su posible uso como sistema de células en un biorreactor modelo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, … More

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter