Name: Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Zellkultivierung auf makroporösen Mikroträgern in einem Perfusionssystem für Gewebeengineering. Diese Methode ermöglicht die effiziente Zellvermehrung und biokompatible Zelllieferung ohne Ernteschritt.

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Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmen Programm RP7/2007-2013 unter Grant Vereinbarung n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Wir danken Carolien van Spreuwel-Goossens von Fujifilm Manufacturing Europe b.v., für technische Hilfe bei der RCP-Herstellung und Werner Stracke vom Fraunhofer-Institut für Silikat Research ISC, um Unterstützung bei der SEM-Analyse.

hBMSCs waren von der Femur-Leiter der Arthrose-Patienten, die eine Oberschenkel-Kopf TEP isoliert. Das Verfahren wurde unter die Zustimmung der lokalen Ethikkommission der Universität Würzburg und Einwilligung der Patienten durchgeführt. Primäre mikrovaskuläre Endothelzellen waren von Vorhaut Biopsien der juvenilen Spender isoliert. Ihre gesetzlichen Vertreter(n) vorgesehen vollen informierte Zustimmung in schriftlicher Form. Die Studie wurde von der lokalen ethischen Verwaltungsrat der Universität Würzburg (Abstimmung 182/10) genehmigt.
1. Isolierung von hBMSCs und HDMECs
<ol><li>Menschlichen Knochenmark stammenden mesenchymaler Stromazellen Zellen (hBMSCs)<ol>
<li>Entfernen Sie Spongiosa aus dem Oberschenkelknochen Kopf mithilfe eines sterilen Löffels. Hinweis: Die Spongiosa erscheint als eine lose und körnige Substanz im Inneren der Kortikalis, die hart und steif ist. Es kann Kratzer Teile des spongiösen Knochens aus dem kortikalen Knochen erforderlich mit einem Skalpell.</li>
		<li>Legen Sie die entfernten Spongiosa in zwei 50 mL Röhrchen. Das Volumen des spongiösen Knochens variiert von 5 bis 10 mL je nach Größe des entfernten Femur Kopfes während der Hüftoperation.</li>
		<li>Waschen mit DMEM-F12 (1:1 Mischung von DMEM und Schinken F12 Medium), füllt das Rohr mit ca. 30 mL des Mediums.</li>
		<li>Schütteln Sie das Rohr manuell, gewissermaßen längs für 5 s, Fettzellen aus der Spongiosa zu lassen. Zentrifuge bei 300 X g und 22 ° C für 5 Minuten.</li>
		<li>Mit einer abgestuften Kunststoff-Pipette, die Fettzellen Schicht und ca. 20 mL der restlichen überstand Aspirieren. Lassen Sie genügend Mittel zur Deckung der Spongiosa.</li>
		<li>Füllen Sie die Rohre mit 10 ml DMEM-F12 und längs mit der Hand, für 10-15 s, die Zellen lassen sich schütteln Sie kräftig.</li>
		<li>Übertragen Sie 10-15 mL Zellsuspension mit einer abgestuften Kunststoff Pipette aus den Rohren auf eine neue 50 mL Tube.</li>
		<li>Wiederholen Sie ab Schritt 1.1.6 Zusammenlegung der erhaltenen Zellsuspension, bis die Spongiosa gesammelt in der 50 mL Tube weiß ist 2-3 Mal.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer abgestuften Kunststoff Pipette auf zwei neue Röhren, Absaugen der Kollagen-Pellets lagern sich auf den Boden der 50 mL Röhrchen zu vermeiden.</li>
		<li>Zentrifuge die Zellsuspension bei 300 X g und 22 ° C für 5 min. verwerfen den Überstand durch mit einer abgestuften Kunststoff Pipette absaugen.</li>
		<li>40 mL DMEM-F12 10 % FCS 1 % Pen/Strep 50 µg/mL Ascorbat-2-Phosphat in einer dritten Röhre hinzugeben. Übertragen Sie 5 mL dieses Mediums auf jedes Röhrchen enthält die Zelle Pellet. Wieder aussetzen Sie der Zelle Pellets durch den Boden der Röhrchen kräftig flackern und übertragen Sie die Zellsuspensionen auf das Röhrchen mit nur Medium.</li>
		<li>OPTIONAL: Verdünnen Sie 100 µL Zellen Aufhängung für Zellzählung, Verdünnung 1: erste 100 mit PBS und dann 01:10 in Trypan blau, indem 15 µL der ersten Verdünnung zu 15 µL des DPBS und 30 µL Trypan blau, um ein DPBS zu erhalten: Trypan blau-Verhältnis von 1:1. Zählen Sie die Zellen mit einer standard Neubauer-Kammer.</li>
		<li>Samen der Zellen bei 109 Zellen/175 cm2 T-Kolben in 25 mL Medium wie in 1.1.11 beschrieben. Alternativ, teilen Sie die ganze Zellsuspension in bis zu zehn 175 cm2 Zellkulturflaschen nicht mitgerechnet. In diesem Stadium sind hBMSCs nicht zu unterscheiden von der Erythrozyten, die stark sie zahlenmäßig überlegen. hBMSCs erscheint als spärlich Kolonien (1-2/Kolben) im Laufe der ersten 7 Tage.</li>
		<li>Ändern Sie Medium nach 4 Tagen von der Saat zur Interaktion der Blutzellen mit den hBMSCs zu ermöglichen. Nach der ersten Datenträgeraustausch ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage. Führen Sie den Datenträgeraustausch indem das Kulturmedium mit einer abgestuften Kunststoff Pipette vollständig zu entfernen, waschen zweimal mit DPBS (von adhärenten Zellen 10 mL des DPBS hinzufügen und entfernen vollständig DPBS mit einer abgestuften Kunststoff Pipette) und anschließend 20 mL frisches Medium, wie beschrieben in 1.1.11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschlichen dermalen mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs)<ol>
<li>Behandeln Sie die Hautbiopsien und isolieren Sie der HDMECs gemäß zuvor veröffentlichten Protokolle21. Kurz nach der Trennung der Dermis von Epidermis, inkubieren Sie Dermis in Trypsin für 40 min bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach Inkubationszeit die Dermis auf einer Petrischale mit Nährmedium übertragen, und jedes Stück mit einem Skalpell zu kratzen. Übertragen der erhaltenen Zellsuspension auf eine 50 mL Kunststoffrohr und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g und 22 ° C. Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Neubauer Kammer und Saatgut bei einer Dichte von 1,2 x 104 Zellen/cm2. Verändern Sie das Medium vollständig täglich.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Aufbau und Entkeimung von Spinner Fläschchen, RCP Microcarriers und Bioreaktor
<ol><li>Spinner-Fläschchen und RCP microcarriers<ol>
<li>Einen Tag vor den Experimenten, Aufbau der Spinner Fläschchen und bereiten sie für die Sterilisation von Autoklaven. Hinweis: Lassen Sie die Kappen der Spinner Kolben locker und wenn möglich, Sterilisieren sie in aufrechter Position.<ol>
<li>Wickeln Sie die Spinner-Fläschchen mit Alu-Folie um die Seitenkappen getrennt zur Vermeidung von Kontamination während Auspacken. Wickeln Sie die Fläschchen mit 1-2 Schichten Aluminiumfolie für Autoklavieren um Kontaminationsrisiken nach der Sterilisation zu minimieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wiegen Sie die erforderliche Menge an RCP makroporösen Microcarriers in 20 mL des DPBS. Hinweis: 30 mg ist erforderlich pro Spinner Kolben. Lassen Sie sie für mindestens 1 h vor der Sterilisation durch Hitze von Autoklaven (121 ° C für 15 min)-Hydrat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfusion Bioreaktor<ol>
<li>Verwenden Sie das beschriebene vaskularisierte Gewebe äquivalente20produzieren Bioreaktorsystem. Dieser Bioreaktor besteht aus einem Gefäß, in dem die Biomatrix befindet, einem Mediumspeicher und einer Druckflasche.<ol>
<li>Verbinden Sie das Schiff mit der Mediumspeicher und der Druckflasche durch Silikon-Schläuche (siehe Abbildung 3). Verlassen Sie die Kappen lose und legen Sie sie in eine Plastiktüte Autoklaven, verschließen Sie gut und platzieren Sie diese in einem zweiten Autoklaven Plastikbeutel. Von Autoklaven sterilisieren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kultur der hBMSCs und HDMECs auf RCP makroporösen microcarriers
Hinweis: Die HDMECs verwendet, um die RCP Microcarriers Samen wurden von Lentivirale Transduktion mit RFP bezeichnet. Dieses Protokoll wurde nach einer zuvor veröffentlichten Protokoll Nr.5geändert.
<ol><li>Lassen Sie die RCP makroporösen Microcarriers auf den Boden absetzen und waschen Sie sie mit 10 mL Kulturmedium. Wiederholen Sie 3 Mal.</li>
	<li>Spinner-Fläschchen mit 10 mL Kulturmedium zu waschen.</li>
	<li>30 mg von RCP makroporösen Microcarriers pro Flasche Spinner in 8 mL Kulturmedium hinzufügen. Equilibrate der Spinner-Fläschchen mit der RCP-Microcarriers bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min vor der Aussaat der Zellen. Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.</li>
	<li>Samen 5 x 105 hBMSCs oder HDMECs (Abschnitt 3) pro Spinner Kolben in 2 mL Kulturmedium.</li>
	<li>Legen Sie die Spinner-Kolben auf die Rührer Platte und Start Rühren bei 90 u/min für 5 min und 55 min bei 37 ° C und 5 % CO2, für eine Gesamtmenge von 1 h statisch/dynamisch Inkubationszeit ruhen lassen. Wiederholen Sie 4 Mal.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL Zellkulturmedium pro Spinner Kolben und starten Sie dann kontinuierliche Rühren bei 95 Umdrehungen pro Minute. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Mit dem Einsatz von einer Mikropipette Proben nehmen an den Tagen 1, 4 und 7:333 µL DNA-Inhalt (~ 0,5 mg), 1000 µL für SEM-Analyse (~ 1,5 mg) und 333 µL für lebenden/Toten Färbung (~ 0,5 mg). Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.</li>
	<li>10 mL Kulturmedium jeden zweiten Tag zu ändern. Dafür warten Sie, bis die RCP-Microcarriers nach unten zu Regeln und sehr sorgfältig 10 mL aus der Flasche Spinner, mit dem Einsatz von einem 10 mL-Pipette Aspirieren, und fügen Sie dann 10 mL frisches Nährmedium.</li>
	<li>Halten Sie die Kulturen auf die Rührer Platte 95 u/min, bei 37 ° C und 5 % CO2 für 7 Tage festgesetzt.</li>
</ol>4. DNA-Gehalt, SEM Analyse Leben tot Färbung und sprießen assay
<ol><li>DNA-Gehalt<ol>
<li>Mit dem Einsatz einer Mikropipette sammeln Sie ca. 0,5 mg Microcarriers von jedem Spinner Kolben (enthalten in 333 µL der Suspension) und Transfer zu einer 2 ml-Kunststofftube. Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.</li>
		<li>Einmal mit 1 mL des DPBS waschen Sie, dann aspirieren Sie überstand.</li>
		<li>Entfernen Sie verbleibende DPBS in ein Gefriertrockner und Gewicht der gefriergetrockneten Microcarriers für spätere Normalisierung.</li>
		<li>Proben bei-80 ° C für mindestens 6 Stunden Einfrieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben bei 60 ° C über Nacht mit 300 µL Papain 5 U/mL.</li>
		<li>Schaffen die entsprechenden Titrierung Kurven den Anweisungen des Herstellers des Quantifizierung Assays (z.B. PicoGreen DsDNA-Assay) kit und führen Sie die Messung das Fluoreszenzsignal bei 520 nm mit einem Lumineszenz-Detektor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scannen von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Analyse<ol>
<li>Sammeln Sie ca. 1 mg Microcarriers von jedem Spinner Kolben und Transfer zu einer 2 mL-Kunststofftube.</li>
		<li>Waschen Sie Microcarriers einmal mit 1 mL des DPBS.</li>
		<li>DPBS zu entfernen und in 1 mL 70 % igem Ethanol für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Überstand zu entfernen und in 1 mL 80 % Ethanol 1 h inkubieren.</li>
		<li>Überstand zu entfernen und in 1 mL Ethanol 90 % für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Überstand zu entfernen und in 1 mL 100 % Ethanol 1 h inkubieren.</li>
		<li>Überstand zu entfernen und in 1 mL Hexamethyldisilazane für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Öffnen Sie den Verschluss und lassen Sie die Proben über Nacht trocknen unter eine chemische Haube.</li>
		<li>Beheben von Proben auf angemessene Unterstützung und fahren Sie mit SEM-Analyse nach etablierte Protokolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DAPI und Live/Dead Färbung<ol>
<li>Am Tag 2, 4 und 7 nach der Aussaat auf die Microcarriers Zelle sammeln Sie 0,5 mg Microcarriers von jedem Spinner Kolben und Transfer zu einer 2 mL-Kunststofftube. Einmal waschen Sie, mit 1 mL des DPBS.</li>
		<li>DAPI<ol>
<li>Beheben Sie Proben für 10 min in genügend 4 % Paraformaldehyd, sie bedecken.</li>
			<li>Einmal waschen Sie, mit 1 mL des DPBS.</li>
			<li>Inkubation bei Raumtemperatur mit der Färbelösung für 45 min auf einen rockigen Shaker.</li>
			<li>DAPI Fluoreszenzsignal auf dem Fluoreszenzmikroskop mit 420 nm Emission Filter erkennen und Abrufen von Bildern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lebenden/Toten Färbung<ol>
<li>Inkubieren Sie Proben in 500 µL Live/Dead Farbstofflösung. Halten Sie die Proben bei 37 ° C für 20 min, vor Licht geschützt werden.</li>
			<li>Einmal waschen Sie, mit 1 mL des DPBS.</li>
			<li>Fluoreszenzsignal lebender Zellen mit einem 490 nm Emission Filter und von abgestorbenen Zellen mit einem 545 nm Emission Filter auf dem Fluoreszenzmikroskop zu erkennen. Bilder zu erwerben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sprießen Assay für HDMECs<ol>
<li>Mix 330 µL Kollagen R Lösung um 0,4 %, 170 µL 0.1 % Essigsäure und 50 µL des mittleren M199 in 15 mL Kunststoffhülse. Halten Sie auf dem Eis.</li>
			<li>Nehmen Sie ~0.375 mg Microcarriers (250 µL) mit dem Einsatz von einer Mikropipette. Übertragen auf ein Kunststoffrohr 1,5 mL, warten auf die RCP-Microcarriers nach unten und entfernen das Medium vollständig. Hinweis: Dies basiert auf ungefähre Trockengewicht von RCP Microcarriers vor der Sterilisation.</li>
			<li>Fügen Sie das Volumen der NaOH 0,2 N erforderlich, um das Kollagen-Gemisch zu neutralisieren und mischen Sie es sofort mit der RCP-Microcarriers. Hinweis: Bestimmen Sie die erforderliche Menge an NaOH 0,2 N im Voraus, indem es zu der Mischung bis Änderung des pH-Wertes (wiederum von gelb bis rosa), und setzen dann die Mischung in den Inkubator für 1 min, nach denen eine Gel gebildet werden muss.</li>
			<li>Platte die Kollagen Gel-RCP Microcarriers Mischung in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte. Bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min inkubieren.</li>
			<li>Fügen Sie 200 µL des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (z.B. VascuLife VEGF-Mv Nährmedium). Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.</li>
			<li>Unter eine umgekehrte Phase Kontrast Mikroskop, mit einem 10-fach Vergrößerung Objekt beobachten und Abrufen von Bildern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biomatrix seeding und Beginn der Bioreaktorsystem für HDMECs
<ol><li>Einen Tag vor dem Bioreaktor Starterkulturen, offene BioVaSc (Biomatrix) Längsrichtung auf der antimesenteric Seite geschnitten und in einem zuvor desinfizierte Polycarbonat-Rahmen befestigen (siehe Abb. 3A, B). Hinweis: Die BioVaSc ist eine Biomatrix erhalten aus einem decellularized porcinen Jejunal-Segment, als zuvor veröffentlichten21vorbereitet. Hinweis: da der Polycarbonat-Rahmen nicht werden, durch Hitze sterilisiert kann, desinfizieren sie durch 20 min Inkubation in sonic Bad (40 kHz), gefolgt von 3 Mal Inkubation in Ethanol 70 % für 25 min. Dann waschen Sie den Rahmen 3 Mal mit DPBS steril.<ol>
<li>Platzieren Sie das Biomatrix-Frame-System in einem 100 mm Petrischale und füllen Sie ihn mit den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor + 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep).</li>
		<li>Equilibrate der Biomatrix durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spritzen Sie nach abnehmen und die Zellen zählen 10 x 107 HDMECs in 1000 µL Kulturmedium durch das erhaltene Gefäßsystem der Biomatrix mit dem Einsatz einer 2 mL Spritze. Hinweis: Spritzen Sie ~ 700 µL über den arteriellen Zulauf und ~ 300 µL durch die Vene Auslass.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 3 h um Zellhaftung zu ermöglichen.</li>
	<li>Füllen Sie das Bioreaktorsystem mit 350 mL des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor + 1 % Pen/Strep und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Setzen Sie den Rahmen im Innern des Behälters des Bioreaktors. Schließen Sie die arterielle und venöse Wirbelsäulenversteifung an das Schiff.</li>
	<li>Verbinden Sie die Bioreaktorsystem mit einer peristaltischen Pumpe zunächst Perfusion. Stellen Sie den Druck auf 10 MmHg und Amplitude ±1.</li>
	<li>Erhöhen Sie den Druck schrittweise jede Stunde bis 100 MmHg Druck, Amplitude ±20 zu erreichen.</li>
	<li>Halten Sie die Bioreaktorsystem für 7 Tage unter diesen Bedingungen bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
</ol>6. Zusatz von RFP-HDMECs um die biomatrix
<ol><li>Mischen Sie 330 µL 0,4 % Kollagen R Lösung, 170 µL 0.1 % Essigsäure und 50 µL des mittleren M199 in einem 15 mL Falcon-Röhrchen. Halten Sie auf dem Eis.</li>
	<li>Nehmen Sie die RCP-Microcarriers aus den Spinner-Kolben. Das Kulturmedium vollständig zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie das Volumen der NaOH 0,2 N erforderlich, um das Kollagen-Gemisch zu neutralisieren und mischen Sie es sofort mit der RCP-Microcarriers.</li>
	<li>Fügen Sie die Kollagen-Gel-RCP-Microcarriers-Mischung auf das Lumen der Biomatrix. Gelierung für 30 min zu ermöglichen.</li>
	<li>Parallel, ändern das Medium des Bioreaktors durch das Medium vollständig entfernen und fügen Sie dann die 350 mL frisch, Pre erwärmt, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor + 1 % Pen/Strep.</li>
	<li>Schließen Sie des Bioreaktors der peristaltischen Pumpe an und der Druck bei 100 MmHg und Amplitude ±20 einrichten.</li>
	<li>Verändern Sie alle 7 Tage das Medium.</li>
	<li>Halten Sie den Bioreaktor in Kultur für 21 Tage.</li>
</ol>7. Analyse und Auslesen der Bioreaktor Kulturen
<ol><li>Vorbereitung der Proben<ol>
<li>Der Bioreaktor trennen Sie die Biomatrix und entfernen Sie es aus dem Polycarbonat.</li>
		<li>Schneiden Sie das erhaltene Stück in 6 Abschnitte: 2 für MTT, 2 für Paraffin einbetten/Färbung und 2 für SEM-Analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paraffin einbetten<ol>
<li>Legen Sie die Abschnitte in einer Petrischale und waschen mit genügend DPBS um sie zu bedecken. Entsorgen Sie die DPBS.</li>
		<li>Befestigen Sie die Abschnitte in 4 % Paraformaldehyd über Nacht.</li>
		<li>Bereiten Sie die Kassetten für die Einbettung von Paraffin und führen Sie es nach standard-Protokolle.</li>
		<li>Bereiten Sie die Abschnitte in Paraffin-Blöcke und geschnitten Sie Proben von 3 µm für H & E Färbung, die mit einem Mikrotom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H & E Färbung<ol>
<li>Führen Sie eingeweichtes Abschnitte nach Standardprotokollen32zu Flecken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scannen von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Analyse<ol>
<li>Legen Sie die Abschnitte in einer Petrischale und waschen mit genügend DPBS um sie zu bedecken. Entsorgen Sie die DPBS.</li>
		<li>Befestigen Sie die Abschnitte mit 4,75 % Glutaraldehyd über Nacht.</li>
		<li>Führen Sie Dehydratisierung-Kette mit steigenden Konzentrationen von Ethanol 50 % - 100 %.</li>
		<li>Sollte in den Kapiteln mit Hexamethyldisilazane (HMDS) für 10 min. verwerfen die verwendeten HMD und frische HMDS hinzufügen.</li>
		<li>Die Abschnitte über Nacht trocknen unter Abzug erlauben, und dann die Proben für die Abbilderstellung vorbereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT)<ol>
<li>Mischen Sie das MTT-Reagenz mit den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, in einer Konzentration von 1 mg/mL.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in der MTT-Lösung für 90 min bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Beobachten Sie die vaskulären Strukturen und Zellen ausgesät Microcarriers makroskopisch oder unter dem Hellfeld Mikroskop, metabolisch aktive Zellen zu erkennen. Bilder zu erwerben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein Hauptziel des Microcarrier ist der Ausbau der Zellen unter Beibehaltung ihrer Differenzierung um Zellen an die Notwendigkeit zu liefern. Die dargestellte Methode einzuführen RCP Microcarriers Zellen in der Lage zu befestigen, vermehren und besiedeln die Microcarriers mit hoher Zelldichte waren. Dies wurde von lebenden/Toten Färbung, beobachtet, in denen mehr als 90 % der lebensfähigen Zellen gefunden wurden, während nur wenige Tote Zellen nach 7 Tagen des dynamischen Kulturen gewonnen wurden. Ebenso bestätigt die REM...

Ein generelles Problem in Gewebe-engineering-Anwendungen ist eine hohe Zellmasse mit dem richtigen Differenzierung Phänotyp an der Stelle des weichen müssen. Die Anwendung des Microcarriers zur Behebung dieses Problems begann 1967 mit zunehmender Bedeutung bis heute in den Bereichen orthopädische Gewebetechnik für groß angelegte Generation von Haut, Knochen, Knorpel und Sehnen1. Sie ermöglichen das Handling von anhaftenden Kulturen in Hinsicht ähnelt der Aussetzung Cultures2 durch den Ausbau der Zellen auf Microscale dreidimensionale (3D) Substraten. Dabei erleben die Zellen eine homogene Nährstoffversorgung und Zelle-Matrix Interaktionen, dass Blei, bessere Wartung der in Vivo3,4 Differenzierung, die oft verloren im Laufe der Zeit in 2D5nähert. Eine höhere Oberflächen-Volumen-Verhältnis - führt schließlich zu einer Zelle höhere Erträge6,7, höhere gas und Nährstoff Wechselkurse im Vergleich zu statischen Systemen8, die Möglichkeit zu regulieren und die Kultur nach körperlichen Reize9und das Potenzial für die Aufstockung der Erweiterung Prozess7 sind weitere Vorteile. Verschiedene Funktionen wie Durchmesser, Dichte, Porosität, Oberflächenladung und Adhäsion Eigenschaften10,11 unterscheiden die verschiedenen im Handel erhältlichen Mikro - und Makro-Träger. Einer der wichtigsten Vorteile ist jedoch deren Potenzial als Microtissues Zustellung an Seite defekt oder Nachfrage.
Für Anwendungen der Microcarrier Technologie im Knochen Tissue Engineering, illustriert wir in einem früheren Bericht12 die Produktion der neuen Microcarrier Typ konstituiert eine rekombinante Kollagen ich Peptid (RCP, als Cellnest im Handel erhältlich). Diese neue Microcarrier ermöglicht die GMP-gerechte, Skalierung von Gerüst und Zelle Produktion Bedarf für die Zelle Lieferung in einem klinischen Szenario. In diesem Zusammenhang ermöglicht tuning Gerüst Stabilität, Abbaurate und Oberflächeneigenschaften durch geeignete Wahl einer geeignet Vernetzung Strategie anzupassen, die Technik, um die ausgewählte Anwendung, Zelltyp von Interesse oder gezielt Gewebe13. Vor allem macht der mögliche Einsatz von dieser Microcarrier als eine injizierbare Zelle Liefersystem für therapeutische Anwendung14 sie besonders interessant in einem klinischen Umfeld.
In diesem Beitrag zeigen wir daher die Kultivierung Verfahren zur Isolierung und Erweiterung der menschlichen Knochenmark stammenden mesenchymaler Stromazellen Zellen (hBMSCs) und menschlichen dermalen mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs) auf Kollagen-ich-basierten rekombinante Peptid-basierte Microcarriers und deren Vorbereitung für die Lieferung in einem klinischen Umfeld. Darüber hinaus beschreiben wir Zusatzprotokolle nützlich für die Aufrechterhaltung der Zellviabilität nach Implantation.
Zellviabilität nach der Implantation ist in der Tat stark abhängig von Vaskularisierung15,16,17, der Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet und erleichtert die Entsorgung. Bioreaktoren sind ein Ansatz um Vaskularisierung meistern in Gewebe-Engineering und pflegen Zellviabilität durch Perfusion Kulturmedium bietet dabei Sauerstoff und Nährstoffe18. Hier zeigen wir eine in-vitro- Methode zur Bewertung der Migration Fähigkeit mikrovaskuläre Endothelzellen aus der RCP-Microcarriers zu einem Biomatrix und ihre Fähigkeit, de Novo Vaskularisierung und Angiogenese beizutragen. Diese Biomatrix ist ein decellularized Segment des porcinen Jejunum bezeichnet BioVaSc (biologische durchblutet Gerüst), reich an Kollagen und Elastin und vaskulären Strukturen, einschließlich Fütterung Arterie und eine drainierende Vene19 , die wurde mit bewahrt Einnistung Fragen20beantragt.

<table><tbody><tr><td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>20395.01</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533.001</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage Kern EG 2200-2NM</td><td>Kern & Sohn GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbat-2-phosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor</td><td>Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Würzburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop Axiovert 40C</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellnest</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 mL, 50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagen R Lösung 0,4%</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>47254.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177.01000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T171.4</td><td>Denaturiertes</td></tr><tr><td>fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Bio& VERKAUFEN SIE</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>nicht hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop BZ-9000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Morphisto</td><td>10231.01000</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>Reagenzqualität, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Inkubator für Bioreaktor</td><td>Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Würzburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelfärbekit für lebende/tote Zellen</td><td>Fluka</td><td>04511KT-F</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührplatte</td><td>2Mag</td><td>80002</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>10X</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadel 21G 16mm</td><td>VWR</td><td>613-5389</td><td></td></tr><tr><td>Papain aus Papaya-Latex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>lyophilisiertes Pulver, &ge; 10 Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quanti-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P087</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop Supra 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natronlauge 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Spinnerkolben (25 mL)</td><td>Wheaton</td><td>356879</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 1 mL</td><td>VWR</td><td>720-2561</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)</td><td>TPP Techno Plastik Products AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF-Mv</td><td>Lifeline Zelltechnologie</td><td>LL-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinante kollagen modell i peptid-microcarriers für zelle expansion und ihre mögliche verwendung als zelle-delivery-system in einem bioreaktor

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Gewebe-Engineering ist ein vielversprechendes Feld, konzentrierte sich auf die Entwicklung von Lösungen für die steigende Nachfrage auf Gewebe und Organe zur Transplantationszwecke. Der Prozess um solche Gewebe zu generieren ist komplex und beinhaltet eine geeignete Kombination von bestimmten Zelltypen, Gerüste und körperliche oder biochemische Reize, Zellwachstum und Differenzierung zu führen. Microcarriers stellen eine ansprechende Werkzeug, Zellen in eine dreidimensionale (3D) Mikroumgebung zu erweitern, da sie höhere Oberfläche-Volumen-Verhältnis bieten und die in-Vivo -Situation im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Methoden genauer zu imitieren. Das Gefäßsystem, liefert Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen und die Gewährleistung der Abfallentsorgung, stellt einen wichtigen Baustein bei der Erzeugung von Geweben entwickelt. In der Tat fallen die meisten Konstrukte nach aufgrund fehlender vaskulären Unterstützung implantiert. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für die Endothelzellen Expansion auf rekombinante Kollagen-basierten Microcarriers unter dynamischen Bedingungen in Spinner Kolben und Bioreaktoren, und wir erklären, wie man in dieser Einstellung Zellviabilität und Funktionalität bestimmen. Darüber hinaus schlagen wir eine Methode für die Zelle Lieferung Vaskularisierung Zwecken ohne zusätzliche Ablösung Schritte notwendig. Darüber hinaus bieten wir eine Strategie, um die Zelle Vaskularisierung Potenzial in einem Bioreaktor Perfusion auf eine decellularized biologische Matrix bewerten. Wir glauben, dass die Nutzung der vorgestellten Methoden zur Entwicklung neuer zellbasierte Therapien für eine Vielzahl von Tissue engineering-Anwendungen in der klinischen Praxis führen könnte.

Wie in Abbildung 1Adargestellt, erhalten wir hohe Anzahl der lebensfähigen Zellen auf die RCP-Microcarriers nach 7 Tagen Kultur, ermittelt durch die lebenden/Toten Färbung. Diese Ergebnisse wurden durch SEM Analyse bestätigt in denen vollständig kolonisierten Microcarriers rund um die Poren, zum Teil überwuchert sie (Abbildung 1 b) beobachtet wurden. Auf der anderen Seite führte Experimente, in denen Zellen nicht gleichmäßig ausg...

Wir schlagen eine Zelle Erweiterung Protokoll über makroporöse Microcarriers und deren Verwendung als Delivery-System in einem Bioreaktor Perfusion eine decellularized Gewebe-Matrix zu säen. Wir gehören auch verschiedene Techniken um Zellproliferation und Lebensfähigkeit der Zellen kultiviert auf Microcarriers zu bestimmen. Darüber hinaus zeigen wir die Funktionalität der Zellen nach Bioreaktor Kulturen.

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zellen auf einer hoch verfügbaren Oberfläche zu expandieren und diese Zellen weiter an Defektstellen oder Nachfragestellen für klinische Anwendungen zu liefern. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, wie z. B. Zellexpansion, Zellabgabe und Vaskularisierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Zellen vermehren und sie ohne Ernteschritt auf biokompatible Weise an die Defektstellen abgeben können.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Arbeit mit Microcarriern und Bioreaktoren aufgrund der vielen erforderlichen Schritte zunächst kompliziert sein kann. Bei dem Eingriff wird Jihyoung Choi, ein Doktorand aus unserem Labor, helfen. Einen Tag vor den Experimenten werden die Spinnerkolben aufgestellt und für die Sterilisation im Autoklaven vorbereitet.Wickeln Sie die Spinnerkolben separat mit Alufolie um die Seitenkappen, um eine Kontamination beim Auspacken zu vermeiden. Wickeln Sie die Kolben zum Autoklavieren mit ein bis zwei Lagen Aluminiumfolie ein, um das Kontaminationsrisiko nach der Sterilisation zu mini

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Eine große Hürde in der aktuellen Stammzelltherapien ist die Bestimmung der effektivste Methode, diese Zellen zu Wirtsgewebe zu liefern. Hier beschreiben wir eine Chitosan-basierte Methode, die Lieferung effizienter und einfacher in Ansatz ist, während es aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen, ihre Multipotenz aufrecht zu erhalten.

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Tissue Engineering umfasst oft in vitro-Expansion um Autotransplantate für die Geweberegeneration zu erstellen. In dieser Studie wurde ein Verfahren zur Gewebeexpansion, Regeneration, Rekonstruktion und in vivo wurde entwickelt, um die Verarbeitung von Zellen und biologischen Materialien außerhalb des Körpers zu minimieren.

Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Die gewebespezifischen extrazellulären Matrix (ECM) ist ein wichtiger Vermittler der Zellfunktion. Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Synthese von reinem ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern , die ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung für Anwendungen in der modernen 3D in vitro Zellkulturmodellen oder als Pro-regenerative bioscaffolds in Kultur stabil ist.

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Kanals mit sich ändernder Geometrie entlang der Strömungsrichtung des Fluids, um eine Dehndehnung (Dehnung) zu erzeugen, um Fasern in einem 3D-Kollagenhydrogel (&lt;250 μm Dicke) auszurichten. Die resultierende Ausrichtung erstreckt sich über mehrere Millimeter und wird durch die Dehndehnungsrate beeinflusst.

Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.

Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität

Dieses Protokoll zielt darauf ab, biofunktionelle selbstorganisierende Peptide auf Zelladhäsion, Organoidmorphologie und Genexpression durch Immunfärbung zu bewerten. Wir werden eine Darmkrebszelllinie verwenden, um eine kostengünstige Möglichkeit zu bieten, Organoide für intensive Tests zu gewinnen.

Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

Erfahren Sie die Zellkultivierung auf makroporösen Mikroträgern in einem Perfusionssystem für Gewebeengineering. Diese Methode ermöglicht die effiziente Zellvermehrung und biokompatible Zelllieferung ohne Ernteschritt.

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor (Video) | JoVE Journal

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

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