Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

In den meisten Labors sind Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken nicht gebräuchlich. Vielmehr sind fest kultivierte Zellen, nicht Paraffin-eingebetteten Zellen beschäftigt subzelluläre Lokalisation Studien. Für diejenigen, die kultivierte Zellen fixiert wurde Fluoreszenz statt Chromogen verwendet. Immunofluorescent Färbung ist daher derzeit die Methode der Wahl zur Bestimmung der Ausdruck proteingehalte in der Forschung beschäftigt Zelle Kulturen¹. Folien für immunofluorescent Färbung vorbereitet können jedoch nur unter immunofluorescent Mikroskopie beobachtet werden die Bilder ganz anders als die angegeben unter dem Flugzeug Mikroskopie²zeigen könnte. Darüber hinaus Bewahrung der Folien für immunofluorescent Färbung erfordert Schutz vor hellem Licht und fluoreszierende Signale mit wiederholter Exposition für die Bildgebung durch den Verlust der Fluoreszenzsignal³schwächer geworden. Ergebnisse von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken sind ganz ähnlich wie jene von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten Gewebe⁴, und sie können leicht in klinischen Informationen übersetzt werden. Immunocytochemistry kann daher eine gute Alternative sein. Allerdings ist Zellenblock Vorbereitung in der grundlegenden Forschungslabors nicht populär gewesen. In diesem Protokoll sind dann Zellenblock Vorbereitung und Immunocytochemical Färbung vorgesehen, um die Verwendung dieser Methode im Bereich der Zellkultur Studien zu fördern.

Zellenblock Vorbereitung und Immunocytochemistry sind nicht einzigartige Methoden, und sie wurden bereits von der klinischen Diagnose angewendet auf Grundlagenforschung^4,5. Obwohl verschiedene Zellenblock Vorbereitung Methoden wurden^4,berichtet ist⁶ Rinderthromboplastin-Plasma-Methode einfach, kostengünstig und leicht anpassbar. Daher wird in das Protokoll präsentiert in diesem Papier, die Rinderthromboplastin-Plasma-Methode^4,5,6,7,8 für die Zubereitung von Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken verwendet.

In der vorliegenden Studie wurden die Modalitäten für die Vorbereitung der Rinderthromboplastin-Plasma Zellenblöcken und die Immunocytochemistry-Methode mit zwei Proliferationsmarker demonstriert. Ein Marker ist Zytoskelett-assoziierten Protein 2 (CKAP2), das vor kurzem als eine mitotische Markierung^9,10,11gemeldet wurde; der andere ist Ki-67, ist die bekannteste Verbreitung Marker¹². Das repräsentative System ist in Abbildung 1dargestellt.

Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Review Board des National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630) genehmigt.

(1) Probenvorbereitung (30 min)

1. Verwenden Sie für die Kultur der HeLa-Zellen (CCL-2, ATCC) 10 mL komplette DMEM Medium (fetale Rinderserum 10 %, 1 % Stift-Strep) in der Kulturschale 100 mm. Inkubieren Sie konfluierende HeLa-Zellen in DMEM ohne fetalen Rinderserum um Serum ausgehungerten HeLa-Zellen vorzubereiten, 48 Stunden, wie in einer früheren Studie¹¹beschrieben.
2. Um die Zellen zu entfernen, waschen Sie sie mit 2 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 2 mL 0,25 % EDTA Trypsin pro 100 mm Kulturschale hinzu. Dann, 2-3 min. in einem CO₂ Inkubator bei 37 ° c inkubieren
3. Der Kulturschale Trypsin deaktivieren 5 mL des kompletten DMEM Medium hinzu, und übertragen Sie die freistehenden Zellen auf eine 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 300 X g für 10 min, eine Kugel zu bilden.
4. Den überstand zu entfernen, und das Pellet zweimal mit 2 mL kaltem PBS durch Zentrifugation bei 300 X g für 10 min waschen.
5. Nach dem Entfernen des Überstands Zelle Pellet 1 mL 95 % Ethanol hinzu, und mischen Sie die Zelle Pellet mit Ethanol durch Vortexen. Bewahren Sie die festen Zellen auf Eis bis Zellenblock Vorbereitung.

(2) Zellenblock Vorbereitung (1 h 30 min)

1. Für die Zubereitung von frozen Plasma Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min. sammeln überstand Plasma Aliquote, EDTA-Plasma von gesunden Spenderblut sammeln und aliquoten 200-400 µL in Microfuge Röhren. Speichern Sie die Aliquote bei-80 ° C bis zur Verwendung. Wenn die frozen Plasma Aliquote bereit sind, rufen sie ab und tauen Sie des Plasmas durch Inkubation bei 37 ° C für 5 min auf.
2. Die festen Zellen bei 700 X g für 10 min zentrifugieren, dann den überstand verwerfen.
3. Mischen Sie die Zelle Pellet mit 2 Tropfen (ca. 200 µL) 2 Tropfen Rinderthromboplastin, Plasma und 2 Tropfen von 0,025 M-Kalzium-Chlorid. Dann mischen sie durch pipettieren.
4. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 min, eine Zelle Gerinnsel bilden, wie in Abbildung 2Agezeigt. Dann, waschen Sie der Zelle Gerinnsel mit PBS zweimal durch Gießen und Entfernen von PBS mit Pipette. Das repräsentative weiße Zelle Gerinnsel wird in Abbildung 2 bdargestellt.
5. Befeuchten Sie ein Stück Filterpapier mit Formalin, und wickeln Sie die Zelle Gerinnsel mit vorbefeuchteten Filterpapier. Legen Sie dann die geronnene Masse mit einer Pincette in einer Kassette Gewebe wie in Abbildung 2dargestellt.
6. Ort der Gewebe-Kassette in ein Glas mit 50 mL gepuffertem Formalin (10 % Formalin in PBS) über Nacht bei 4 ° C für Formalin fixieren.

(3) Gewebe Verarbeitung und Paraffin einbetten (über Nacht)

1. Die Gewebe-Kassette mit Formalin fixiert Zelle Gerinnsel zu laden über Nacht in einem Gewebe-Prozessor bereits¹¹beschrieben. Die Gewebe Verarbeitung ist für die Entfernung von Wasser und Konditionierung der fixen Zellen vor dem Paraffin einbetten. Führen Sie für Forschung ohne Gewebe verarbeitet das Gewebe Verarbeitung Verfahren, wie in Tabelle 1dargestellt.
2. Schalten Sie den beheizten einbetten Bahnhof und 60 Minuten später, prüfen Sie, ob darin ist geschmolzenes Paraffin in die Metallform (Abb. 2D).
3. Nehmen Sie das Gerinnsel gebildete Zelle aus der Gewebe-Kassette und legen Sie sie in den geschmolzenen Paraffin in die Metallform.
4. Ort die neuen Gewebe-Kassette ohne Deckel in die Metallform, die die Zelle enthält in der Mitte der geschmolzenen Paraffin gerinnen und Gießen mehr geschmolzenen Paraffin in die Gewebe-Kassette und auf die Metallform. Dann lassen Sie das Paraffin in die kalte Platte für 30-60 Sekunden zu festigen.
5. Trennen Sie die Gewebe-Kassette aus der Metallform. Dann ist die Zelle paraffinblock für Immunocytochemistry bereit. Das eingebettete Zelle Gerinnsel in Paraffin-eingebetteten Zellenblock wird durch den Pfeil in Abbildung 2E.

4. Vorbereitung der Folien für Immunocytochemistry (1 h)

1. Überprüfen Sie den Bereich für die Zelle Blutgerinnsel in der Zelle paraffinblock und geschnitten Sie den Zellenblock in Scheiben mit dicken von 3-4 µm mit einem Mikrotom. Setzen Sie Paraffin Abschnitte auf Silan beschichteten Objektträgern, wie in Abbildung 2Fgezeigt.
2. Legen Sie die Abschnitt Folien in einem 37 ° C Ofen für 30 min. in den Abschnitten zu den Folien haften zu machen.

5. Immunocytochemistry von Zellenblöcken (6 h)

Hinweis: Für Immunocytochemical Flecken auf Zelle Blockabschnitte, verschiedene Kits verwendet werden können (siehe Tabelle der Materialien). Diese Kits haben verschiedene Empfindlichkeiten und Besonderheiten je nach deren Änderungen.

1. Inkubieren Sie die Abschnitte in 50 mL von Xylol für 4 min zur de-paraffinize.
2. Inkubieren Sie die Folien in 100 % igem Ethanol für 2 min für Dehydrierung, zwei Mal in 95 % igem Ethanol und in 80 % Ethanol für 2 min. Dann entfernen Sie das Ethanol unter fließendem Wasser für 10 Minuten.
3. Legen Sie für Antigen-Retrieval die Folien in einem Glas mit 40 mL Tris-EDTA Abruf Puffer pH 9.0, und in einen Herd für 30 min kochen.
4. Die Objektträger unter fließendem Wasser waschen, und sie in 95 % igem Ethanol für 10 min bei 4 ° c inkubieren Markieren Sie Zelle-Färbung Bereich auf den Folien mit einem Pap-Stift zur einfachen Identifizierung.
5. Waschen Sie die Folien in Tris gepufferte Kochsalzlösung mit 0,2 % Tween 20 (TBS-T) und inkubieren Sie im Wasserstoffperoxid-Block (siehe Tabelle der Materialien) bei Raumtemperatur 15 Minuten Überbleibsel Peroxidase-Aktivität entfernt werden soll. Dann, waschen Sie die Folien in TBS-T dreimal für jeweils 2 min..
6. Bereiten Sie verdünnten Antikörperlösung durch Verdünnung Primärantikörper im Protein Block (siehe Tabelle der Materialien). Zum Beispiel verdünnt die CKAP2 Primärantikörper sein kann 1: 100 und die Ki-67 Antikörper 1: 500. Inkubieren Sie dann, die Folien in 100 µL verdünnter Antikörper-Lösung für 1 h.
7. Nach dem Waschen in TBS-T fünf Mal für 2 min inkubieren Sie die Folien in der primären Antikörper-Enhancer im Kit für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
8. Tropfen Sie nach dem Waschen in TBS-T vier Mal für 2 min 2 des HRP-Polymer (eine sekundäre Antikörper beschriftet mit Meerrettich-Peroxidase), und inkubieren Sie die Folien bei Raumtemperatur für 30 min.
9. Fügen Sie nach dem Waschen in TBS-T fünf Mal für 2 min, 100 µL der Diaminobenzidine (DAB)-Lösung (siehe Tabelle der Materialien), und die Folien für 3 min inkubieren.
10. Nach dem Waschen in TBS-T zwei Mal, 100 µL Hämatoxylin-Lösung (die Mischung von 100 µL Hämatoxylin und 600 µL destilliertes Wasser) hinzufügen und die Folien für 1 min inkubieren.
11. Nach dem Waschen entwässern die Folien in TBS-T einmal, in 95 % igem Ethanol für 2 min Inkubation und Eintauchen in 95 % igem Ethanol einmal Eintauchen in 100 % igem Ethanol zwei Mal. Dann inkubieren Sie die Folien in 40 mL Xylol im weckglas für 5 min.
12. Wenn die Folien von Xylol trocken sind, montieren Sie die jeweiligen Deckgläsern.
13. Beobachten Sie die Färbung Muster mit Lichtmikroskopie.

In einer Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Folie aus dem Paraffin-eingebetteten Zellenblock (Abb. 3AB) sind die meisten von den Zellkernen und Zytoplasma der Zellen intakt, darauf hindeutet, dass die morphologische Erhaltung ausgezeichnet mit dem aktuellen Protokoll ist ( ( Abb. 3A). In der Immunocytochemical Färbung, positive CKAP2 Färbung verkürzte Chromatin, mitotischen Spindel und Zytoplasma (Abbildung 4), wie bereits berichtet10verzeichneten. Ki-67 Färbung beobachtet in den Zellkernen als erwartet (Abbildung 4). Nur die Zellen mit CKAP2 Färbung in verkürzte Chromatin mitotische Zellen wurden (siehe Pfeile in Abb. 4AB). Im hoch mitotischen HeLa-Zellen, die nach einer Inkubation in kompletten Medium (Abb. 4A) vorbereitet worden war, wurden viele CKAP2-positiven Zellen gezeigt. Im Vergleich dazu gab es einige CKAP2-positiven Zellen in Serum ausgehungerten HeLa-Zellen (Abbildung 4 b). Die meisten hoch mitotischen HeLa-Zellen wurden Ki-67 positiver (Abbildung 4). Kontrastreich, blieb die Ki-67-Positive-Rate in der Serum-verhungert HeLa-Zellen bis zu ~ 50 % (Abbildung 4). Diese Ergebnisse sind durchaus vergleichbar mit denen von einem vorherigen Bericht11, was darauf hindeutet, dass CKAP2 ein zuverlässiger Verbreitung Marker in Krebszellen ist als Ki-67 ist.

In schlecht vorbereitete Zellenblöcken die Kerne vom Zytoplasma getrennt sind, und gibt auch, resultantly, schlechte morphologische Erhaltung. Länger als Übernachtung Inkubation von festen Zellen im Kühlschrank kann solche schlechten Ergebnissen führen. Ein weiteres wichtiges Problem ist, dass Zellen nicht gut von Immunocytochemistry, trotz der hervorragenden Morphologie gefärbt. Dieses Problem entsteht häufiger, wenn die Zelle Gerinnsel klein ist. Die Intensität der Färbung ist in der Regel unregelmäßig, wie in Abbildung 3 bgezeigt; aber wenn das Gerinnsel Zelle größer ist, gibt es viel weniger Chancen, unregelmäßige Flecken. In diesem Protokoll erhöht wir daher die Mengen an Plasma, Rinderthromboplastin und Calciumchlorid, um ein großzellige Gerinnsel bilden.

Abbildung 1: Zellenblock Vorbereitung Schema. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Paraffin Zellenblock Herstellung Außenillustration. (A) Rinderthromboplastin-Plasma Zelle Gerinnsel im Rohr. (B) TP Zelle Gerinnsel nach dem PBS waschen. (C) Zelle Gerinnsel auf feuchtes Filterpapier. (D) Gewebe einbetten-Station mit flüssigem Wachs. Metallform (Pfeil) hält geschmolzene Wachs für Erstarrung. (E) Paraffin-eingebetteten Zelle Gerinnsel (Pfeil) eingebettet in Paraffin oder Paraffin-eingebetteten Zellenblock. (F) dünne Paraffin Abschnitt auf den mittleren Teil einer beschichteten Folie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Zellenblock Vorbereitung und Bestätigung der Qualität von Hämatoxylin und Eosin und Immunostaining. (A) Hämatoxylin und-Eosin-gefärbten Bild von HeLa-Zellen in einem Paraffin-eingebetteten Zellenblock-Abschnitt. (B) unregelmäßige Färbung von Ki-67 in Immunocytochemistry auf einem schlecht vorbereitet Paraffin-eingebetteten Zellenblock Abschnitt. Maßstabsleisten sind (A) 100 und (B) 200 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Immunocytochemical Flecken auf Paraffin-eingebetteten Zellenblock für HeLa-Zellen. (A) CKAP2 Färbung sehr mitotischen Bedingungen. (B) CKAP2 Serum-verhungert Bedingungen Färbung. (C) Ki-67 Färbung sehr mitotischen Bedingungen. (D) Ki-67 Färbung Serum ausgehungerten Bedingungen. 100 μm Maßstabsleisten werden angezeigt. Die Pfeilspitzen zeigen CKAP2-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1. Gewebe-Veredelung.

Alle Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte.