Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Zusammenfassung

Um hochempfindliche Detektion der Verbreitung von menschlichen colorectal Krebses (CRC) Zellen Gewebe besiedeln können, zeigen wir hier ein Protokoll zur effizienten Transduktion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Lentivirale Partikel in PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen vor der Injektion in Empfänger Mäuse mit Stereo-Fluoreszenz-mikroskopische Beobachtung.

Zusammenfassung

Trotz aktueller Fortschritte in der Behandlung der menschlichen kolorektalen Karzinoms (CRC) sind einige radikale Therapien effektiv für den späten Stadien der CRC. Zur Überwindung dieser klinische Herausforderung, Tumor-Xenograft-Maus-Modellen alteingesessenen mit menschlichen Karzinom-Zell-Linien und viele transgenen Mausmodellen mit Tumoren wurden als präklinischen Modellen entwickelt. Sie teilweise die Funktionen der menschlichen Karzinome zu imitieren, aber oft nicht auf die wesentlichen Aspekte der menschlichen Tumoren einschließlich Invasion und Metastasierung zu rekapitulieren. Alternative Modelle, die besser die maligne Progression in menschlichen CRC darstellen sind so lange erwartet worden.

Wir zeigen hier Generation von Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) durch subkutane Implantation von kleinen CRC-Fragmente von einem Patienten chirurgisch seziert. Der Doppelpunkt, den pdxs entwickeln und histopathologisch ähneln die CRC des Patienten. Allerdings sind einige spontane Fixierungsprotokoll nachweisbar in konventionellen Querschnitte der betroffenen entfernte Organe des PDX-Modells. Um die Erkennung von metastasierendem Verbreitung in entfernten Organen zu erleichtern, wir Doppelpunkt PDXs in Kultur organoide Tumorzellen entnommen und mit GFP Lentivirus vor der Injektion in stark immungeschwächte NOD/Shi-scid IL2Rγ infiziert^Null (NOG) Mäuse. Orthotopically injiziert PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen konsequent Form Primärtumoren positiv für GFP im Empfänger Mäuse. Darüber hinaus entwickeln spontan Micrometastatic, die Kolonien mit dem Ausdruck GFP vor allem in den Lungen von diesen Mäusen durch Fluoreszenzmikroskopie erkannt werden. Darüber hinaus produziert intrasplenic Injektion von CRC Organellen häufig hepatische Kolonisation. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse GFP gekennzeichnet PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen visuell erkennbaren in einem mehrstufigen Prozess werden die Invasion Metastasierung Kaskade genannt. Die beschriebenen Protokolle gehört die Einrichtung der PDXs der menschlichen CRC und 3D Kultur der entsprechenden CRC organoide Zellen durch GFP Lentivirale Partikel ausgestrahlt.

Einleitung

Kolorektales Karzinom (CRC) ist die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit¹. Die unzureichende Reaktion auf konventionelle Therapien von Patienten mit fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung zeigt die Unwirksamkeit der Versuche, CRCs radikal zu heilen. Um eine effektivere therapeutische Ansätze zu entwickeln, entstanden verschiedene präklinische Mausmodelle von Krebs, die die Eigenschaften des SFB zu imitieren. Verschiedene CRC-Zell-Linien wurden weithin zur Tumor Xenografts aufgrund ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Manipulation zu generieren. Langfristige Kultur von Krebszelllinien, führt jedoch oft zu Auswahl an einzig....

Protokoll

Der Patienten zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung und das Projekt wurde von der Ethikkommission der Forschung der Juntendo University Fakultät genehmigt. Die Maus-Experimente stimmten auch die Tier-Forschung-Ethik-Kommission der Juntendo Fakultät für Medizin.

1. Aufbau der CRC PDXs in immungeschwächte Mäuse

Experimentelle Verfahren für die Festlegung von CRC PDXs (Schritt 1) sind in Abbildung 1Askizziert.

1. Bereiten Sie das primäre CRC Gewebe unmittelbar nach der chirurgischen Resektion des Tumors vom Patienten.
2. Waschen das primäre CRC-Gewebe ....

Ergebnisse

Eine primäre kolorektalen Adenokarzinom diagnostiziert als mäßig differenziert hatte von einer 76 Jahre alten Frau mit TNM-Klassifikation, Stadium IIIa, gefolgt von postoperativen Chemotherapie chirurgisch reseziert worden. Die primäre CRC Zellen-Proteins gebeizt für carcinoembryonales Antigen, Ki-67, Pan-Cytokeratin und E-Cadherin positiv. Stücke des resezierten Tumors waren NOG Mäuse um den Doppelpunkt PDX Modell erzeugen auch subkutan implantiert. CRC organoide Zellen wurden dann für G.......

Diskussion

Obwohl das CRC PDX-Modell weithin eingesetzt worden, hat um primäre Tumorwachstum zu studieren, ob dieses Modell auch für Tumor Metastasen zu untersuchen gilt hat nicht noch nicht vollständig aufgeklärt. Spontane Metastasen waren auch kaum nachweisbar in Leber und Lunge von verschiedenen gemeldeten Doppelpunkt PDX Modelle^4,10. Um Fixierungsprotokoll mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen, haben wir ein Protokoll für transducing GFP Lentivirale Partikel in CRC PDX-.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NOD/Shi-scid IL2R&gamma (NOG) Mäuse	The Central Institute for Experimental Animals, Kanagawa, Japan		Züchten Sie 6 Wochen alte männliche Mäuse unter keimfreien und spezifisch pathogenfreien Bedingungen
Wundclips 2& mal; 10mm	Natsume Herstellung, Japan	#C-21-S	Autoklav vor Gebrauch
Hamilton Spritze Nadelstärke:22 Gauge	Tokyo Science, Japan		Desinfizieren Sie mit 70% Alkohol und sterilem PBS.
6-Well-Platte	BMBio	#92006
12-Well-Platte	BMBio	#92412
15ml konisches Röhrchen	Sumitono Bakelit	MS-57150
50ml konisches Röhrchen	Sumitomo Bakelit	MS-57500
Mikroröhrchen	Eppendorf	#0030120086	Autoklav vor Gebrauch
Hämozytometer	Erma	#03-202-1
40 Mio. Jahre m Zellsieb	Corning	#352340
Matrigel Basalmembran Matrix	Corning	#354234	Lagern Sie Aliqupten bei -20°C. Auf Eis legen, bis
Kollagenase Typ 1	Sigma	#C1030	150 mg/ml Kollagenase Typ1 in 1&mal; PBS. Lagern Sie Aliqupte bei -20°; C für bis zu 1 Jahr
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	Bei 4&Grad;C lagern.
DMEM/F-12 mit GlutaMAX™	Gibco	#10565018	Bei 4°C lagern. Warm bei 37°C; C vor dem Gebrauch
Cell banker 1plus	ZENOAQ	#628	Bei 4°C lagern. Innerhalb von 1 Monat verbrauchen
Penicillin	Gibco	#15140122	Bei 4°C lagern. Innerhalb von 1 Monat verbrauchen
Streptomycin	Gibco	#15140122	4°C lagern. Innerhalb von 1 Monat
verbrauchen hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	-20°C lagern. Am Tag des Gebrauchs
dem Medium hinzufügenY27632, ein ROCK-Inhibitor	Wako	#253-00591	Bei -20°C lagern. Am Tag der Verwendung zum Medium hinzufügen
Kulturmedium	Gibco		DMEM/F-12 mit GlutaMAX™ Ergänzungsmittel ergänzt mit 5% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μ; g/ml Streptomycin. Bei 4°C lagern. Innerhalb von 1 Monat verbrauchen.
CRC-Organoid-Kulturmedium mit 1 % oder 5 % FCS			DMEM/F-12 mit GlutaMAX™ Supplement (Gibco #10565018) ergänzt mit 1 % oder 5 % FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml g/ml Streptomycin, 2 ng/ml hEGF und 10 & Mikro; M Y27632, ein ROCK-Inhibitor. Bei 4 °C lagern. Innerhalb von 1 Monat verbrauchen.
die FuGENE 6 Transfektion Regent	Roche	11814 443001
Minisart 0,45 µ m filter	Sartorius stedim	17598-K
5 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Beckman Coulter	326819
PRRL-GFP Vektor	Geschenk von Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G	Geschenk von Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Geschenk von Dr. Robert A. Weinberg
der SW55Ti Schwingschaufel Rotor	Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 Stereofluoreszenzmikroskop	Zeiss