Method Article

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Methode ein Array gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Vorbereitung für Hochdurchsatz-Manipulation von physikalischen und chemischen imitiert in Vivo zellulären Mikroumgebungen Queues und Identifizieren Sie die optimale zelluläre Umgebung für menschliche pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einzelligen profiling.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zelluläre Mikroumgebungen bestehen aus einer Vielzahl von Signalen, wie Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrizen und interzelluläre Wechselwirkungen. Diese Hinweise sind gut inszeniert und von entscheidender Bedeutung bei der Regulierung der Zellfunktionen in ein lebendiges System. Obwohl eine Reihe von Forschern versucht haben, die Korrelation zwischen Umweltfaktoren und gewünschte Zellfunktionen zu untersuchen, bleibt noch viel Unbekanntes. Dies ist vor allem auf das Fehlen einer richtigen Methodik derartige ökologische Hinweise in Vitrozu imitieren und gleichzeitig testen verschiedene ökologische Hinweise auf Zellen. Hier berichten wir über eine integrierte Plattform von mikrofluidischen Kanälen und einer Nanofaser-Palette, gefolgt von hoch-einzellige Inhaltsanalyse, Stammzell-Phänotypen verändert durch verschiedene Umweltfaktoren zu untersuchen. Um die Anwendung dieser Plattform zu demonstrieren, konzentriert sich diese Studie auf die Phänotypen menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) selbst zu erneuern. Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung-Verfahren für eine Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur bei der Herstellung eines Arrays gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME). Darüber hinaus werden allgemeine Schritte der Profilierung, Zelle färben mit mehreren fluoreszierenden Marker, mehrere Fluoreszenz-Bildgebung und statistische Analysen, einzellige beschrieben.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)1,2 selbst unbegrenzt zu erneuern und zu differenzieren in verschiedene Gewebe Abstammungen, die Entwicklung von Medikamenten, zellbasierte Therapien, Gewebetechnik und regenerative Medizin revolutionieren könnte 3 , 4 , 5 , 6. allgemeine Kultur Gerichte und Mikrotiter-Platten, jedoch sollen nicht präzise physikalische und chemische Zelle Manipulation auf zellulärer Ebene mit dem Bereich der Nano -, Mikro-Meter, aktivieren, wodurch ein entscheidender Faktor für die zelluläre Expansion ist, Selbsterneuerung und Differenzierung. Um diesen Nachteil zu beheben, haben Studien die Rolle der zellulären Mikroumgebungen bei der Regulierung der Zelle-Schicksal Entscheidungen und Zelle Funktionen4untersucht. In den letzten Jahren haben eine wachsende Zahl von Studien durchgeführt, um zelluläre Mikroumgebungen in-vitro-7,8zu rekonstruieren. Nano und Mikro-Herstellungsprozesse haben diese Mikroumgebungen durch die Manipulation der chemischen9,10,11,12,13etabliert, 14,15,16,17 und physischen18,19,20 ökologische Hinweise. Bis jetzt gab es keine Berichte, die zugrunde liegenden Mechanismen der chemischen und physikalischen Umwelt Hinweise auf Zelle-Schicksal Entscheidungen und Funktionen innerhalb einer einzigen Plattform systematisch zu untersuchen.

Hier stellen wir eine Strategie basiert auf einfachen Design-Prinzipien, eine robuste Screening-Plattform (Abbildung 1) zu etablieren. Zunächst beschreiben wir die Entwicklung Vorgehensweise einer integrierten Plattform für die Erstellung vielseitiger, künstliche zellulärer Mikroumgebungen mithilfe einer Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur: die gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Array (Abbildung 1A , 2A). Das Nanofaser-Array enthält 12 verschiedene Mikroumgebungen in unterschiedlichen Kombinationen von Nanofaser Materialien und dichten. Elektrospinnen wurde zur Nanofasern zu fabrizieren. Die Nanofaser-Materialien, wie Polystyrol (PS)21, Polymethylglutarimide (PMGI)22und Gelatine (GT)23, wurden entwickelt, um ihrer chemischen Eigenschaften testen die Zelladhäsion und Aufrechterhaltung der Pluripotenz ( beeinträchtigen könnten Abbildung 2B). Nanofaser dichten waren vielfältig durch Elektrospinnen Zeit ändern und die generierten Nanofasern wurden nach ihrer Dichte definiert (DNF, mit D = XLow/Low/Mid/High). Die mikrofluidischen Struktur besteht aus Polydimethylsiloxan (PDMS) beherbergen 48 Zellkultur Kammern, die entlang die Standardabmessungen der 96-Well Mikrotestplatte positioniert werden können. PDMS ist eine biokompatible und Gas-austauschbare Polymer in der Regel zur Herstellung von mikrofluidischen Geräten24verwendet. Jeden mikrofluidischen Kanal wurde entwickelt, um 700 µm breit und 8,4 mm lang und hatte zwei Buchten an den Rändern (Tabelle 1). Die Kammern hatten unterschiedliche Höhen (250, 500 und 1000 µm), die erste Zelle Aussaat dichten (0,3 und 0,6 1,2 × 105 Zellen/cm2), die mit überleben, Proliferation und Differenzierung von hPSCs25 korrelieren könnte zu manipulieren (Abbildung 2C). Die Anzahl der Zellen ausgesät in eine Kammer ist proportional zu der Spalte Dichte über dem Kammerboden, und somit erste Zelle Dichte Aussaat wurde durch die Einführung der gleichen Zellsuspension in Kultur Kammern mit unterschiedlichen Höhen gesteuert. Alle Kanäle wurden entwickelt, um ≥ 250 µm hohen26 werden zur Minimierung der Auswirkungen von sauerstoffarmen Spannung27 und Schubspannung28 auf die Zellen. Kanal-Höhen von 250, 500 und 1000 µm werden hier abgekürzt als XCD mit X = Low, Mid, und hoch, beziehungsweise. Umgebungen mit unterschiedlichen Nanofaser dichten und erste Zelle Aussaat dichten wurden als "Material_NF-Density_Cell-Dichte" verkürzt (z. B. GT_HighNF_HighCD: ein Umfeld mit hoher Dichte GT Nanofasern und hohe anfängliche Zelle-seeding geprägt Dichte).

Anschließend beschreiben wir, wie einzellige Analysen um Zellen Verhalten als Reaktion auf Umweltfaktoren (Abbildung 1B) systematisch zu untersuchen. Als ein Proof-of-Concept identifizierten wir die optimale zelluläre Umgebung hPSC Selbsterneuerung, das ist eine zentrale Funktion für hPSC Wartung (Abbildung 1B)29. Image-basierte zytometrie, gefolgt von statistischen Analysen ermöglicht quantitative Interpretation der einzelnen zellulären phänotypischen Antworten auf zelluläre Umgebungen. Unter einer Vielzahl von zellulären Funktionen bietet dieses Papier ein detailliertes Verfahren um die optimalen Bedingungen für die Aufrechterhaltung der hPSC Selbsterneuerung zu identifizieren.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) Herstellung von MACME Array

Hinweis: Alle Materialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

  1. Vorbereitung von Masken für eine Nanofaser-Array und eine Form für eine mikrofluidische Struktur
    1. Erstellen Sie dreidimensionale (3D) Bilder von Masken für die Nanofaser-Arrays und Formen für mikrofluidischen Strukturen mittels 3D Computergraphik-Software-Pakete (Tabelle 1) verwendet.
      Hinweis: Die 3D-Bilder sind gelesen und durch einen 3D-Drucker ausgedruckt. Die gedruckten Masken und Schimmel haben die gleichen Abmessungen mit 3D Bildern über die Grafiksoftware bei Schritt 1.1.1 definiert.
    2. Drucken Sie Masken und eine Form basierend auf diese Entwürfe mit einem 3D-Drucker.
      Hinweis: In diesem Protokoll war ein Ink-Jet-Like-3D-Drucker mit UV-härtender Harz verwendet30. Die Auflösung des Druckers war 635 × 400 dpi und 15 µm in X, Y und Z, bzw. der tatsächlichen X Y-Auflösung war jedoch etwa viermal geringer.
  2. Nanofaser-Array Vorbereitung (Abbildung 3A( )
    1. Elektrospinnen Polymerlösungen vorbereiten.
      1. Verdünnen Sie 13 % PMGI Flüssigkeit mit Tetrahydrofuran von 9 % (w/V)22.
      2. Lösen Sie 0,08 g PS (Anzahl durchschnittliche Molekulargewicht (Mn): 130.000) in THF:dimethylformamide (Volumenverhältnis 1:1)21, und fügen Sie THF:dimethylformamide das Volumen bis zu der endgültigen 1 mL (8 % (w/V) PS Lösung) zu bringen.
      3. 0,1 g GT in Wasser auflösen: acetic Acid: Ethylacetat (1:1.6:2.1-Volumen-Verhältnis), und fügen Sie Wasser: acetic Acid: Ethylacetat bringen das Volumen bis zu der endgültigen 1 mL (10 % (w/V) GT-Lösung) als beschrieben23,31.
    2. Verwenden Sie ein Magnetron Sputtern Maschine, Zahlen Sie eine dünne Schicht Platin mit einer 5-nm Dicke auf einer Polystyrol (PS)-Grundplatte (127,7 × 85,5 mm), dient als eine Kathode im Elektrospinnen Setup ein.
    3. Laden Sie jede Polymerlösung in einer 5-mL-Spritze mit einer stumpfen Nadel von 23 G aus rostfreiem Stahl ausgestattet.
    4. Legen und die Spritze mit der Nadel auf eine Spritzenpumpe mit 12-cm neben der Sammler das Elektrospinnen Gerät zu verankern.
    5. Verbindung die Spritzennadel mit einer Hochspannungs-Stromversorgung, und zuweisen 11 kV.
    6. Festlegen der FÖRDERRATE von 0,2 mL/h.
    7. Halten Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit bei 30 ° C und < 30 % (V/V).
    8. Ziehen Sie die Maske auf der Grundplatte am Schritt 1.2.2 zubereitet.
    9. Nanofasern auf der Grundplatte durch die Löcher der Maske mit unterschiedlichen dichten zu fabrizieren, indem Sie ändern die Elektrospinnen Zeit (z. B. 20, 60, 90 und 180 s).
    10. Entfernen Sie die Maske aus der Grundplatte.
      Hinweis. Ethanol kann auf Electrospun GT Nanofasern gesprüht werden, bevor Sie die Maske zur Vermeidung von GT Nanofasern zusammen mit der Maske abziehen entfernen.
    11. Wiederholen Sie Schritt 1.2.4-1.2.10 bis zur Fertigstellung des Nanofaser-Array Fertigung.
    12. Nanofaser-Array in einem Exsikkator bei 25 ° C 16 h das restliche Lösungsmittel verdunsten zu platzieren.
    13. Crosslink GT Nanofasern mit 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und 0,2 M N-Hydroxysuccinimide (NHS) in Ethanol bei 25 ° C für 4 h23.
    14. Spülen Sie GT Nanofasern zweimal mit 99,5 % (V/V) Ethanol und Vakuum-trocken, bei 25 ° C 16 h.
  3. Herstellung von mikrofluidischen Strukturen (Abbildung 3B( )
    1. Mischen Sie 2 g PDMS Heilung Agent und 20 g der PDMS-Basis (01:10 Gewicht-Verhältnis; Pre-PDMS). 24
    2. Gießen Sie die Pre-PDMS-Mischung auf die Form, die in Schritt 1.2 hergestellt.
    3. De-Gas die Pre-PDMS-Mischung in den Exsikkator gestellt für 30 Minuten.
    4. Die Pre-PDMS-Mischung in einem Ofen bei 65 ° C 16 h zu heilen.
  4. Montage von MACME Arrays (Abbildung 3B( )
    1. Abziehen der PDMS-Struktur bei Schritt 1.3.4 aus der Form und sauber mit 70 % (V/V) Ethanol geheilt.
    2. Atmosphärischen Korona-Entladung auf der Unterseite des PDMS Struktur32zu behandeln.
      Hinweis: In diesem Protokoll wird die Korona auf der gesamten Oberfläche eine Schicht 3 oder 4 mal mit einem "Handy" Korona-Entladung Apparat entladen. Sauerstoff-Plasmabehandlung ersetzte mit atmosphärischen Korona-Entladung, die Oberfläche Haftfähigkeit zu ändern.
    3. Montieren Sie die PDMS-Struktur mit dem Nanofaser-Array schnell.
    4. Backen Sie Backofen-bei 65° C für 2 Tage.

2. Laden hESC in MACME Array

  1. Pflegen Sie für die routinemäßige Kultur der H9 menschliche embryonale Stammzellen (hESC), dass Zellen in Xeno-freien Kulturmedium für hPSC Wartung33 ergänzt mit 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor34 (hPSC Medium genannt) in einer 35-mm-Zellkultur chemisch definiert Gericht mit Basalmembran Gelmatrix (MG) beschichtet.
  2. Durchgang Zellen alle 4-7 Tage mit einem rekombinanten Trypsin-ähnliche Protease.
  3. Sterilisieren Sie eine MACME Array mit 99,5 % Ethanol, durch Einlegen in den Kammern für 10 min, und entfernen Sie dann das Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
  4. Stellen 12 µL 10 µg/mL Vitronectin (VN), mg und 0,1 % (w/V) GT in Steuerelement Kultur Kammern und inkubieren Sie die Kammern bei 37 ° C für 1 h auf den Oberflächen der Kammer zu beschichten.
    Hinweis: In diesem Protokoll wurden MG, VL und GT als Referenz Proteine für die Zelladhäsion und Kultur gewählt. Da MG und VN standard Zellkultur Matrizen verwendet für die Aufrechterhaltung der hPSC Selbsterneuerung sind, dienen sie als Positivkontrollen; zweidimensionale GT Beschichtung (2DGT) oder nicht-Beschichtung (NC) dienten als Negativkontrollen.
  5. Vorgewärmte hPSC Medium in alle Kammern MACME Arrays einführen. Inkubieren Sie die Kammern für 30 min bei 37 ° c
  6. Waschen H9 hESC kultiviert auf einer 35-mm-Schale mit DPBS, 0,5 mL eines rekombinanten Trypsin-ähnliche Protease in die Schale hinzufügen und Inkubation bei 37 ° C für 1 min und Aspirieren Sie sorgfältig nur die Überstände mit Protease gemischt.
    Hinweis: Bei der Aspiration Schritt sind die Zellen nicht gelöst.
  7. Fügen Sie sofort hPSC Medium, verzichten Sie sanft das Medium gegen die Oberfläche der Schale mehrmals, um Zellen zu trennen und die freistehenden Zellen auf eine 15 mL konische Rohr übertragen.
  8. Zentrifugieren bei 200 X g für 3 min. Aspirat überstand und Zellen in einem vorgewärmten hPSC Medium aussetzen.
  9. 12 µL Zellsuspension (1,2 × 106 Zellen/mL) in jeder Kammer mikrofluidischen einführen.
    Hinweis: Eine Kammer stellen Sie Zellen voneinander mit einer Mikropipette vor. Da die Anzahl der Zellen ausgesät Kammern proportional zur Spalte Dichte über dem Kammerboden ist, konnte die erste Zelle Aussaat Dichte kontrolliert werden, obwohl Proben aus gleichen Zellsuspension verwendet wurden. Sicherstellen Sie, dass pipettieren sanft erfolgt. Entfernen Sie überschüssiges Mittel aus den Kammern mit einem Baumwoll-Kreissägeblätter-Stick nach dem Laden. Das MACME-Array ist kompatibel mit gängigen Labor Pipetten und automatische Pipette Systeme, und es erfordert keine spezielle Ausrüstung.
  10. HPSC Medium jeder 12 h und Kultur für 4 Tage zu ändern.
    Hinweis: Konstanten Volumen des Mediums (1,6 mm, 3,2 und 6.4 µL) werden mithilfe von Kammern mit unterschiedlichen Größen beibehalten. Kultur-Zellen unter einen statischen Zustand Scherbeanspruchung bis auf den Austausch der Zelle Kulturmedium35,36zu minimieren.

3. quantitative einzellige Profilierung

  1. Fluoreszierende Zelle Färbung auf Platte
    Hinweis:     um phänotypischen Veränderungen selbst erneuern hPSCs zu analysieren, dieses Protokoll drei wichtige phänotypischer Marker für dieses Protokoll ausgewählt: OCT4, 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU), und Annexin V, um den Status der Pluripotenz, Proliferation und Apoptose zu messen , bzw. (Abbildung 2b). 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) wird verwendet, um die Zellkerne zu identifizieren. OCT4 gehört zu den kritischen Transkriptionsfaktoren der Pluripotenz.
    1. Inkubieren Sie H9 hESC in MACME Arrays in hPSC Medium ergänzt mit 10 µM EdU Alkinen bei 37 ° C für 30 min.
    2. Nach dem Waschen mit annexin-Bindung-Puffer (10 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), Färben Sie sich die Zellen mit einer Orange-fluoreszierenden Farbstoff Annexin V Konjugat bei 20 ° C für 15 min.
    3. Beheben Sie Zellen mit PBS-Puffer mit 4 % (V/V) Paraformaldehyd bei 20 ° C für 15 min zu, und dann spülen Sie Zellen mit PBS zweimal.
    4. Permeabilize Zellen mit PBS mit 0,3 % (V/V) Triton x-100 bei 20 ° C 16 h.
      Hinweis: Paraformaldehyd schwächt die Bindung zwischen einer Kunststoff Grundplatte und einem PDMS mikrofluidischen Struktur. Somit kann die Ablösung des PDMS-Schicht aus dem Array bei Schritt 3.2.1 auch direkt nach diesem Schritt durchgeführt werden.
    5. Inkubieren Sie Zellen in Tris-basierte Reaktion Puffer mit einer rot-fluoreszierenden Farbstoff-azid bei 20 ° C für 30 min.
    6. Inkubieren Sie Zellen in blockierende Puffer (PBS mit normalem ziegenserum 5 % (V/V), 5 % (V/V) normale Esel-Serum, 3 % (w/V) Rinderserumalbumin, 0,1 % (V/V) Tween-20 und 0,1 % (w/V) N-Dodecyl-β-D-maltosid) bei 4 ° C für 16 h.
    7. In PBS mit 0,5 % (V/V) Triton x-100 Lösung und menschlichen OCT3/4 Antikörper (Maus IgG) bei 4 ° C für 16 h inkubieren.
    8. In blockierende Puffer mit grün fluoreszierenden Farbstoff-markierten Esel Anti-Maus IgG (H + L) bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
    9. In PBS mit DAPI bei 20 ° C für 30 min inkubieren.
    10. PBS-DAPI mit PBS zu ersetzen.
    11. Bewahren Sie das MACME-Array bei 4 ° C bis Bildaufnahme.
  2. Image-Erwerb (Abbildung 4( )
    1. Die PDMS mikrofluidischen Struktur aus dem Array MACME abziehen.
    2. Entfernen der restlichen PBS aus dem Array MACME, gelten 90%(v/v) Glycerin mit PBS-Puffer für die Zellen und Deckgläsern über die gefärbten Zellen.
    3. Die Platte auf dem Kopf stehend auf der Bühne von einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop einstellen
    4. 12-Bit-Farbe Bilder automatisch mit allen motorisierten Komponenten (Bühne, Filter, Verschlusszeit und Fokus Systeme), die durch ein Mikroskop imaging-Software gesteuert waren zu erwerben.
      Hinweis. In diesem Protokoll Belichtungszeiten werden angepasst, um in der Nähe von höchster Intensitätswerte zu erreichen (höchste Pixel-Intensität: 4096), aber keine Sättigung, für jedes Bild, DAPI OCT4, Annexin V und EdU.
  3. Computer-gesteuerten Bildverarbeitung und Fluoreszenz-signal Quantifizierung (Abbildung 5)
    Hinweis:     die folgenden Zelle Bildanalyse erfolgt anhand einer zuvor beschriebenen Methode37.
    1. Konvertieren Sie Farbbilder in Graustufen.
    2. Einen einzigen Schwellenwert für jedes DAPI-Bild mit der Otsu-Methode zu berechnen und zu klassifizieren Pixel oberhalb der Schwelle als Vordergrund und unten als Hintergrund. Sicherstellen Sie, dass die Fluoreszenz Intensität des DAPI Foreground-Wert entspricht.
      Hinweis: Die Bild-Analyse-Prozess enthält 5 Schritte; Kennung der primären Objekte in DAPI Bilder, Identifikation von sekundären Objekten in OCT4, Annexin V und EdU Bilder, bzw., und die Messung der Intensität des Objekts. Abbildung 3 stellt die Bilder der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) auf die Einstellung der Bildverarbeitung.
    3. Messen Sie die fluoreszierenden Intensitäten der OCT4 und EdU auf das jeweilige Bild.
    4. Identifizieren Sie die Region mit Annexin V mit der Vermehrung Methode befleckt zu und quantifizieren Sie die fluoreszente Intensität.
  4. 3.4 statistische Analyse einzelne zelluläre Phänotypen auf einzellige Bildgebung zu visualisieren
    1. Normalisieren Sie die Eingabe fluoreszierenden Intensitäten der einzelnen phänotypischer Marker zentrieren und Skalieren diese Variablen, um ihnen Gleiches Gewicht zu verleihen.
    2. Führen Sie selbstorganisierende Karte (SOM) Analyse mithilfe einer Softwareumgebung für statistische Berechnungen und Grafiken wie von früheren Studien38,39beschrieben aus.
      1. Erstellen Sie 25 SOM Knoten mit markanten vier "Codebuch Vektoren" entspricht die fluoreszierenden Intensitäten der vier Markierungen, DAPI, EdU, Annexin V und OCT4.
      2. Ein "Gewinner" (am ähnlichsten) Knoten Einzelzellen in jeder Mikroumgebung zuweisen und Grundstück als Zelle Frequenz, wonach die Codebuch Vektoren des preisgekrönten Knotens aktualisiert werden, mit einem gewichteten Durchschnitt, wo ist das Gewicht der Lern-Kurs (hier 0,05 als (Standardeinstellung).
        Hinweis: Lassen Sie Daten aus Kammern, die mit weniger als 1.000 Zellen, weil Datasets enthält ein paar Zellen nicht statistisch relevante SOM Ergebnisse geliefert hat.
    3. Führen Sie unbeaufsichtigt hierarchischen clustering mit den SOM-Knoten-Werten mit der Durchschnitts-Kinematik-Methode basierend auf Pearson Korrelation von einem Cluster Software40.
    4. Rendern Sie die clustering Daten in Dendrogramm und Heatmap Ansichten41.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME Arrays: Design und Herstellung: In Kombination mit Nanofaser-Technologie verwendeten wir mikrofluidischen Zellkultur und screening-Verfahren zuvor eingesetzt, um optimale Bedingungen für hPSC Selbsterneuerung und Differenzierung35,36 (Abbildung 1) zu identifizieren. Dies eignet sich gut für den Aufbau robuster Hochdurchsatz-zellbasierte Assays, weil die Zelle Kultur Kammern und ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll zeigt die erste Screening-Methode um eine robuste Kultursystems für die Pflege des qualifizierten hPSCs zu etablieren. Erstens beschrieben wir, wie man eine Plattform mit verschiedenen künstlichen ECMs und Zelle dichten mithilfe eines mikrofluidischen Geräts integriert mit einem Nanofaser-Array, das Array MACME Aussaat vorzubereiten. Zweite, quantitative bildbasierte einzellige Phänotypisierung war durchgeführten50 Bewertung einzelner zellulärer Ergebnisse und Verhaltensweisen, di...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Prof. N. Nakatsuji bei iCeMS, Kyoto University, für die Bereitstellung von humanen ES-Zellen. Wir danken auch Prof. A. Maruyama am Tokyo Institute of Technology für seine Unterstützung im Umgang mit dem Rasterkraftmikroskop. Finanzierung wurde großzügig zur Verfügung gestellt von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 und 24656502); auch wurde von der neuen Energie and Industrial Technology Development Organization (NEDO) und der Terumo Life Science Foundation finanziert. WPI-iCeMS stützt sich auf die World Premier International Research Center Initiative (WPI), Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan. Ein Teil dieser Arbeit wurde von Kyoto Universität Nanotechnologie Hub und der AIST Nano-Verarbeitungsanlage in "Nanotechnologie Plattform Förderprojekt" MEXT, Japan unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polystyrol (PS)Sigma#182435Durchschnittliche Mw: 290.000, Durchschnittliche Mn: 130.000
Polymethylglutarimid (PMGI)MicroChemG113113
Gelatine (GT)SigmaG2625Aus Schweinehaut
Sylgard 184 Silikonelastomer-KitDoe Corning Toray#1064291PDMS-Härter und Silikonelastomerbasis Bestandteile dieses Kits.
OpenSCADDies ist eine kostenlose 3D-Computergrafiksoftware (http://www.openscad.org/), die zum Entwerfen der Form des mikrofluidischen Geräts verwendet wird.
AutoCAD 2014AutodeskHierbei handelt es sich um eine 3D-Computergrafiksoftware (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview), die für das Design der Maske verwendet wird, die bei der Vorbereitung von Nanofaser-Arrays verwendet wird.
3D-Drucker, AGILISTA-3000Keyence
UV-härtendes Harz, AR-M2KeyenceDies wird von Agilista für den 3D-Druck verwendet.
EssigsäureSigma#338826≥ 99,99%
EthylacetatSigma#270989wasserfrei, 99,8%
Tetrahydrofuran (THF)Sigma#401757
MSP-30TVakuumgerätMagnetron-Sputtermaschine
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Dies ist eine Polystyrol-Grundplatte, auf der das Nanofaser-Array erstellt wird. Diese Plattengröße beträgt typischerweise 127,7 x 85,5 mm.
Korona-Entlademaschine mit PistoleShinko Electric & InstrumentierungCFG-500Dieses handliche Gerät wird verwendet, um eine Korona für die Aktivierung der Unterseite der PDMS-Schicht in Schritt 1.5 "Assemblierung der MACME-Arrays" im Protokoll zu erzeugen.
5-ml-SpritzeTerumoSS-05SZ
Stumpfe Nadel aus Edelstahl (23 Gauge)Nipro#2166Außendurchmesser und -länge betragen 0,6 bzw. 32 mm.
HochspannungsnetzteilTechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, HydrochloridDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma#56480
Matrigel hESC-qualifizierte MatrixCorning#354277Dieses Protein wird im Protokoll als Basalmembran-Gel-Matrix bezeichnet.
CellAttach Vitronectin, Human, LösungSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Feeder-freies, xenofreies Kulturmedium für die Konservierung von humanen ES- und iPS-Zellen
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express Enzym (1X), PhenolrotThermo Fisher Scientific#12605028Dabei handelt es sich um eine rekombinante Trypsin-ähnliche Protease zur Dissoziation von adhärenten Säugetierzellen.
Click-iT EdU Imaging Kit mit Alexa Fluor 647 AzidenThermo Fisher ScientificC10086Die Fluoreszenzmarkierung von proliferierenden Zellen in der Fluoreszenzfärbung auf der Platte wurde gemäß dem Produkthandbuch dieses Kits durchgeführt.
Annexin V, Alexa Fluor 594 KonjugatThermo Fisher ScientificA13203
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Antikörper (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Esel Anti-Maus IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Hierbei handelt es sich um einen Sekundärantikörper, der bei der Fluoreszenzzellfärbung auf der Platte verwendet wird.
ECLIPSE Ti-ENikonHierbei handelt es sich um ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das mit einem CFI Plan Fluor 4&f;/0,13 N.A. Objektiv (Nikon), einer CCD-Kamera (ORCA-R2, Hamamatsu), einer Quecksilberlampe (Intensilight, Nikon), einem XYZ-Automatiktisch (Ti-S-ER motorisierter Tisch mit Encodern, Nikon) und Filterwürfeln für vier Fluoreszenzkanäle (DAPI, GFP, HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonDies ist eine Mikroskop-Bildgebungssoftware, die für die automatische Bildaufnahme verwendet wird.
CellProfiler, Version 2.1.0Dies ist eine kostenlose offene Software zur Zellbildanalyse (http://cellprofiler.org/).
Die R SOM-Analysewird mit dem kohonen-Paket dieser Software durchgeführt. Diese ist frei verfügbar (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0Dies ist die Open-Source-Clustering-Software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Mit dieser Software wird unüberwachtes hierarchisches Clustering durchgeführt.
Java TreeViewDiese Open-Source-Software (http://jtreeview.sourceforge.net/) wird verwendet, um Clustering-Daten als Heatmap und Dendrogramm zu visualisieren.
H9 humane embryonale StammzelleWiCell StammzellbankWA09
sind

References

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