Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Summary

Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Methode ein Array gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Vorbereitung für Hochdurchsatz-Manipulation von physikalischen und chemischen imitiert in Vivo zellulären Mikroumgebungen Queues und Identifizieren Sie die optimale zelluläre Umgebung für menschliche pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einzelligen profiling.

Abstract

Zelluläre Mikroumgebungen bestehen aus einer Vielzahl von Signalen, wie Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrizen und interzelluläre Wechselwirkungen. Diese Hinweise sind gut inszeniert und von entscheidender Bedeutung bei der Regulierung der Zellfunktionen in ein lebendiges System. Obwohl eine Reihe von Forschern versucht haben, die Korrelation zwischen Umweltfaktoren und gewünschte Zellfunktionen zu untersuchen, bleibt noch viel Unbekanntes. Dies ist vor allem auf das Fehlen einer richtigen Methodik derartige ökologische Hinweise in Vitrozu imitieren und gleichzeitig testen verschiedene ökologische Hinweise auf Zellen. Hier berichten wir über eine integrierte Plattform von mikrofluidischen Kanälen und einer Nanofaser-Palette, gefolgt von hoch-einzellige Inhaltsanalyse, Stammzell-Phänotypen verändert durch verschiedene Umweltfaktoren zu untersuchen. Um die Anwendung dieser Plattform zu demonstrieren, konzentriert sich diese Studie auf die Phänotypen menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) selbst zu erneuern. Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung-Verfahren für eine Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur bei der Herstellung eines Arrays gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME). Darüber hinaus werden allgemeine Schritte der Profilierung, Zelle färben mit mehreren fluoreszierenden Marker, mehrere Fluoreszenz-Bildgebung und statistische Analysen, einzellige beschrieben.

Introduction

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)^1,2 selbst unbegrenzt zu erneuern und zu differenzieren in verschiedene Gewebe Abstammungen, die Entwicklung von Medikamenten, zellbasierte Therapien, Gewebetechnik und regenerative Medizin revolutionieren könnte ^{3 , 4 , 5 , 6}. allgemeine Kultur Gerichte und Mikrotiter-Platten, jedoch sollen nicht präzise physikalische und chemische Zelle Manipulation auf zellulärer Ebene mit dem Bereich der Nano -, Mikro-Meter, aktivieren, wodurch ein en....

Protocol

(1) Herstellung von MACME Array

Hinweis: Alle Materialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Masken für eine Nanofaser-Array und eine Form für eine mikrofluidische Struktur
   1. Erstellen Sie dreidimensionale (3D) Bilder von Masken für die Nanofaser-Arrays und Formen für mikrofluidischen Strukturen mittels 3D Computergraphik-Software-Pakete (Tabelle 1) verwendet.
      Hinweis: Die 3D-Bilder sind gelesen und durch einen 3D-Drucker ausgedruckt. Die gedruckten Masken und Schimmel haben die gleichen Abmessungen mit 3D Bildern über die Grafiksoftwar....

Results

MACME Arrays: Design und Herstellung: In Kombination mit Nanofaser-Technologie verwendeten wir mikrofluidischen Zellkultur und screening-Verfahren zuvor eingesetzt, um optimale Bedingungen für hPSC Selbsterneuerung und Differenzierung^35,36 (Abbildung 1) zu identifizieren. Dies eignet sich gut für den Aufbau robuster Hochdurchsatz-zellbasierte Assays, weil die Zelle Kultur Kammern und .......

Discussion

Dieses Protokoll zeigt die erste Screening-Methode um eine robuste Kultursystems für die Pflege des qualifizierten hPSCs zu etablieren. Erstens beschrieben wir, wie man eine Plattform mit verschiedenen künstlichen ECMs und Zelle dichten mithilfe eines mikrofluidischen Geräts integriert mit einem Nanofaser-Array, das Array MACME Aussaat vorzubereiten. Zweite, quantitative bildbasierte einzellige Phänotypisierung war durchgeführten⁵⁰ Bewertung einzelner zellulärer Ergebnisse und Verhaltensweisen, di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrol (PS)	Sigma	#182435	Durchschnittliche Mw: 290.000, Durchschnittliche Mn: 130.000
Polymethylglutarimid (PMGI)	MicroChem	G113113
Gelatine (GT)	Sigma	G2625	Aus Schweinehaut
Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit	Doe Corning Toray	#1064291	PDMS-Härter und Silikonelastomerbasis Bestandteile dieses Kits.
OpenSCAD			Dies ist eine kostenlose 3D-Computergrafiksoftware (http://www.openscad.org/), die zum Entwerfen der Form des mikrofluidischen Geräts verwendet wird.
AutoCAD 2014	Autodesk		Hierbei handelt es sich um eine 3D-Computergrafiksoftware (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview), die für das Design der Maske verwendet wird, die bei der Vorbereitung von Nanofaser-Arrays verwendet wird.
3D-Drucker, AGILISTA-3000	Keyence
UV-härtendes Harz, AR-M2	Keyence		Dies wird von Agilista für den 3D-Druck verwendet.
Essigsäure	Sigma	#338826	≥ 99,99%
Ethylacetat	Sigma	#270989	wasserfrei, 99,8%
Tetrahydrofuran (THF)	Sigma	#401757
MSP-30T	Vakuumgerät		Magnetron-Sputtermaschine
Nunc OmniTray	Thermo Fisher Scientific	#242811	Dies ist eine Polystyrol-Grundplatte, auf der das Nanofaser-Array erstellt wird. Diese Plattengröße beträgt typischerweise 127,7 x 85,5 mm.
Korona-Entlademaschine mit Pistole	Shinko Electric & Instrumentierung	CFG-500	Dieses handliche Gerät wird verwendet, um eine Korona für die Aktivierung der Unterseite der PDMS-Schicht in Schritt 1.5 "Assemblierung der MACME-Arrays" im Protokoll zu erzeugen.
5-ml-Spritze	Terumo	SS-05SZ
Stumpfe Nadel aus Edelstahl (23 Gauge)	Nipro	#2166	Außendurchmesser und -länge betragen 0,6 bzw. 32 mm.
Hochspannungsnetzteil	TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, Hydrochlorid	Dojindo	W001
N-Hydroxysuccinimide	Sigma	#56480
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix	Corning	#354277	Dieses Protein wird im Protokoll als Basalmembran-Gel-Matrix bezeichnet.
CellAttach Vitronectin, Human, Lösung	STEMCELL Technologies	#07004
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	#05940	Feeder-freies, xenofreies Kulturmedium für die Konservierung von humanen ES- und iPS-Zellen
Y-27632	Wako Pure Chemical Industries	#253-00513
TrypLE Express Enzym (1X), Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	#12605028	Dabei handelt es sich um eine rekombinante Trypsin-ähnliche Protease zur Dissoziation von adhärenten Säugetierzellen.
Click-iT EdU Imaging Kit mit Alexa Fluor 647 Aziden	Thermo Fisher Scientific	C10086	Die Fluoreszenzmarkierung von proliferierenden Zellen in der Fluoreszenzfärbung auf der Platte wurde gemäß dem Produkthandbuch dieses Kits durchgeführt.
Annexin V, Alexa Fluor 594 Konjugat	Thermo Fisher Scientific	A13203
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Oct-3/4 Antikörper (C-10)	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279
Esel Anti-Maus IgG H& L (DyLight 488)	abcam	ab96875	Hierbei handelt es sich um einen Sekundärantikörper, der bei der Fluoreszenzzellfärbung auf der Platte verwendet wird.
ECLIPSE Ti-E	Nikon		Hierbei handelt es sich um ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das mit einem CFI Plan Fluor 4&f;/0,13 N.A. Objektiv (Nikon), einer CCD-Kamera (ORCA-R2, Hamamatsu), einer Quecksilberlampe (Intensilight, Nikon), einem XYZ-Automatiktisch (Ti-S-ER motorisierter Tisch mit Encodern, Nikon) und Filterwürfeln für vier Fluoreszenzkanäle (DAPI, GFP, HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Dies ist eine Mikroskop-Bildgebungssoftware, die für die automatische Bildaufnahme verwendet wird.
CellProfiler, Version 2.1.0			Dies ist eine kostenlose offene Software zur Zellbildanalyse (http://cellprofiler.org/).
Die R SOM-Analyse			wird mit dem kohonen-Paket dieser Software durchgeführt. Diese ist frei verfügbar (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0			Dies ist die Open-Source-Clustering-Software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Mit dieser Software wird unüberwachtes hierarchisches Clustering durchgeführt.
Java TreeView			Diese Open-Source-Software (http://jtreeview.sourceforge.net/) wird verwendet, um Clustering-Daten als Heatmap und Dendrogramm zu visualisieren.
H9 humane embryonale Stammzelle	WiCell Stammzellbank	WA09