Methodenartikel

Ein Maus-Modell der teilweisen Darmverschluss

DOI:

10.3791/57381

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5. März 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology, Wonkwang Digestive Disease Research Institute and Institute of Wonkwang Medical Science, School of Medicine, Wonkwang University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Darm Hindernisse sind eine teilweise oder vollständige Blockierung des Darms, die starke Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, und verhindert den Durchgang von Stuhl verursachen können. Dieses Verfahren zum Erstellen von Darm teilweise Obsructions bei Mäusen ist zuverlässig bei der Untersuchung der Mechanismen, die krankhaften Zellwachstum und Tod im Darm.

Zusammenfassung

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Darm Hindernisse, die behindern oder blockieren peristaltische Bewegung, können durch abdominale Adhäsionen und meist gastrointestinale (GI) Krankheiten einschließlich tumoröse Wucherungen entstehen. Jedoch verursacht durch Darm Hindernisse sind kaum erforscht und die zelluläre Mechanismen Umgestaltung beteiligt. Verschiedenen Tiermodellen der Darm Hindernisse wurden entwickelt, aber die Maus-Modell ist das beste Kosten/Zeit wirksam. Die Maus-Modell nutzt die chirurgische Implantation einer teilweisen Darmverschluss (PO), die eine hohe Sterblichkeitsrate hat, wenn es nicht korrekt durchgeführt wird. Darüber hinaus nicht Mäuse erhalten PO Chirurgie Hypertrophie zu entwickeln, wenn eine entsprechende Blockade ist nicht oder nicht richtig platziert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll auf PO-Operation, die zuverlässige und reproduzierbare Darm Hindernisse mit einer sehr niedrigen Sterblichkeit produziert. Dieses Protokoll nutzt einen chirurgisch platzierte Silikon-Ring, der Ileum umgibt die Verdauungs-Bewegung in den Dünndarm teilweise blockiert. Die teilweise Blockade macht den Darm aufgrund der Halt des Verdauungssystems Bewegung erweitert werden. Die Ausdehnung des Darms induziert Hypertrophie der glatten Muskulatur auf der oralen Seite des Ringes, die nach und nach über 2 Wochen bis es Todesursachen entwickelt. Die chirurgische PO-Maus-Modell bietet eine in Vivo Modell der hypertrophen Darmgewebe nützlich für die Untersuchung von krankhafter Veränderungen der Darmzellen einschließlich der glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC), PDGFRα+, und neuronale Zellen während der Entwicklung von Darmverschluss.

Einleitung

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Darm Hindernisse sind eine teilweise oder vollständige Blockierung im kleinen oder großen Darm, der verdaute Nahrung, Flüssigkeit und Gas bewegt durch den Darm-1verhindert. Aufgrund der Obstruktion induziert die Blockade die Darmwände, verdickt werden, Verengung der Lumen-2. Darmverschluss kann auftreten durch Abdominal- oder Becken-Operationen, die Abdominal-Adhäsion Gewebeanordnung verursachen oder von GI Störungen wie entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn), Divertikulitis, Hernien, Volvulus, Striktur, Invagination, Verstopfung, fäkale Impaktion, Pseudoobstruktion, Krebs und Tumore3,4,5. Intestinale Blockaden in diesen Fällen führen oft zu der Hypertrophie der Tunica Muscularis des Darms6.

PO des lumens induziert Darm Ausdehnung und glatten Muskulatur Schichtdicke um das Hindernis als Reaktion auf die Notwendigkeit, funktionellen Peristaltik7,8,9,10weiter erhöht, 11,12,13. Tiermodelle der Darm PO wurden entwickelt, um studieren glatten Muskel-Hypertrophie in Mäusen7Ratten10, Meerschweinchen11, Hunde12und Katzen13 , die konsequent entwickeln ähnliche Hypertrophie innerhalb der intestinale Muskelschichten.

Ein Maus-Modell der Darm PO ist der kostengünstigste Weg zu generieren und Darm Hindernisse in Vivozu untersuchen. Mithilfe von einen Silikonring chirurgisch gelegt Umgebung Ileum sind Dünndarm Hindernisse bei Mäusen durchgeführt. Die PO-Mäuse zeigten frühe Zunahme der Anzahl der Zellen (Hyperplasie) und eine Erhöhung im Muskel Schichtdicke (Hypertrophie) nach PO Chirurgie8,15. SMC sind die primären Kunststoff Zellen, die innerhalb der glatten Muskulatur Schichten als Reaktion auf die hypertrophe Bedingungen14wachsen, aber andere Zellen wie ICC und PDGFRα+ -Zellen, die mit SMC eng verbunden sind, sind auch neu besiedelt. Wir haben bereits berichtet, dass die PO-Mäuse Hypertrophie im Dünndarm entwickeln, in denen SMC sind entdifferenzierten in PDGFRα+ Zellen, die höchst proliferative7,15,16. Umgekehrt sind ICC verkommen und verloren in den hypertrophierten Glattmuskel-Schichten bei der Entwicklung der intestinalen Obsruction7. Ein weiterer großer Vorteil des PO-Modells ist seine Fähigkeit, Veränderungen im enterischen Nervensystem und Vermehrung von neurogenen motorischen Muster zu bewirken. Die große Verbreitung neurogenen motorischen Muster im Dünndarm Maus der migrierenden Motor Komplex (MMC), ist die neurogene und erfordert keine ICC oder elektrische langsame Wellen17. Das PO-Modell kann klare Einblicke in wie MMCs und enterischen Nerven durch partielle Obstruktion umgebaut werden.

Hier schlagen wir eine murinen Protokoll für Darm PO-Operation mit einem Silikonring. PO-Operation zuverlässig empfangen Mäuse produzieren Hypertrophie in der Tunica Muscularis des Dünndarms. Innerhalb hypertrophe Muskeln sind SMC, ICC, PDGFRα+und neuronalen Zellen drastisch umgebaut.

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Protokoll

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Das folgende Protokoll genehmigt wurde durch die institutionelle Animal Care und verwenden Committee (IACUC) an der Universität von Nevada-Reno (UNR) Tier Ressourcen und erfüllt alle institutionellen ethischen Richtlinien bezüglich der Verwendung von Versuchstieren.

(1) Tiere.

  1. Erhalten Sie Reifen (4-6 Wochen alt) C57BL/6 Mäusen mit einem Gewicht zwischen 20-30 g. Haus der Kolonie von Labormäusen in eine zentralisierte Tierstation am UNR Tier Ressourcen.

(2) partielle Obstruktion Chirurgie

Hinweis: In einem Raum gewidmet chirurgische Eingriffe sind Operationen durchgeführt. Alle chirurgischen Instrumente sind vor der Operation autoklaviert. Sterile OP Kittel und Handschuhe sollten von allen Personal im OP jederzeit getragen werden.

  1. Vorbereitung für die OP Maus
    1. Überprüfen Sie die Narkose Delivery-System um die Versorgung mit Sauerstoff zu gewährleisten und Isofluran ist ausreichend für Verfahren. Schalten Sie die Stromversorgung Sauerstoff. Schalten Sie den Gas-Durchflussmesser und passen Sie an, um 500-1000 mL/min Platz das Tier in der Induktion Kammer und verschließen Sie oben.
    2. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane auf 5 %, und überwachen Sie das Tier zu, bis es Liegerad wird. Wechseln Sie die Narkose Liefersystem zu die Bugnase
    3. Spülen der Induktion Handelskammer Restgas mit Sauerstoff, dann schalten Sie die Induktion Kammer Linie unter Beibehaltung der Bugnase Zeile öffnen.
    4. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer zu und legen Sie vorsichtig ophthalmologischen Salbe auf die Augen des Tieres.
    5. Legen Sie die Bugnase auf einen vorgeheizten warm, wenn Gas fließt weiterhin.
    6. Ändern Sie die Sauerstoffzufuhr in 100-200 mL/min, mit 2-3 % Isofluran. Wenn das Tier beginnt zu bewegen, betäubt, Gentlyrestrain das Tier mit der Nase Kegel auf bis zu vollständig wieder.
    7. Überwachung der Atmung und Reaktion auf die Stimulation während des Verfahrens und den Prozentsatz der Isofluran (2-5 %) nach Bedarf anpassen. Tierische Anesthetization Ebene wird durch den Mangel an Zehe Prise Reflex überwacht, bevor Chirurgie durchgeführt wird.
    8. Injizieren Sie Schmerzmittel (Buprenorphin, 1 µg/g Körpergewicht) intraperitoneal Weg von der Einschnitt-Website.
    9. Wenden Sie Haar Entfernung Lotion auf dem Bauch mit einem sauberen Wattestäbchen an. Lassen Sie die Lotion sitzen für 3-5 min auf Maus, dann das Haar mit Gaze und Baumwolle Tupfer entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Haare aus dem Bauch der Maus entfernt wurde.
    10. Reinigen Sie die Haut mit 70 % Ethanol mit Gaze und Baumwolle Tupfer. Gelten Sie Swabsticks oder Povidon-Jod-Lösung um den Bauch zu reinigen.
  2. Partielle Obstruktion Chirurgie
    1. Drapieren Sie die Operationsstelle mit sterilen Papier 25 x 50 cm mit einer 2,5 x 2,5 cm Öffnung in der Mitte für den OP-Bereich. Sichern Sie den Faltenwurf des Tieres indem man sterile Streifen an den Rändern der Öffnung und die Haut.
    2. Machen Sie einem ~3.0 cm Bauchschnitt längs mit Nr. 15 Klinge Skalpell, um sicherzustellen, dass nur die Haut eingeschnitten ist und schneiden in der Musculoperitoneal Schicht zu diesem Zeitpunkt zu vermeiden.
    3. Mit Zange und chirurgische Scheren, trennen Sie vorsichtig die Haut von der Musculoperitoneal-Schicht ohne jeden Schnitt, die Musculoperitoneal Schicht. Nachdem die Schichten ausreichend (ca. 1 cm x 4 cm) getrennt wurden, identifizieren die Linea Alba auf der Musculoperitoneal Ebene und Schnitt ~ 2 cm entlang der Linea Alba, die intraperitonealen Hohlraum mit Mikro-Pinzetten und Scheren verfügbar zu machen.
    4. Genau lokalisieren Sie und identifizieren Sie der Blinddarm. Langsam und sanft entfernen der Blinddarm aus dem intraperitoneale Hohlraum mit Mikro-Pinzetten, bringen die proximalen Colon und Ileum mit der Blinddarm außerhalb auf der sterilen Tuch. Sofort befeuchten Sie das Darmgewebe mit 0,9 % sterile Kochsalzlösung getränkten Gaze und halten Sie exponierte Gewebe ständig befeuchtet, während sie sich außerhalb der Bauchhöhle.
    5. Lokalisieren Sie und identifizieren Sie das Mesenterium zwischen Ileum und proximalen Colon. Machen Sie einen Einschnitt (~ 1 cm) in dem Mesenterium parallel, und knapp unterhalb der Krummdarm und vermeiden Sie, schneiden alle Gefäßsystem.
    6. Nehmen Sie einen autoklaviert Silikonring (6 mm in der Länge, 4 mm Außendurchmesser, 3,5 mm Innendurchmesser). Längsrichtung geschnitten Sie, um den Schlauch öffnen und öffnen Sie den Ring mit Mikro-Pinzetten.
    7. Stecken Sie ein Ende des geöffneten Rings durch die Inzision im Mesenterium Gewebe. Eine ausgefüllte Ringform zurückzukehren Sie den Ring bringen ein Ende in Kontakt mit anderen, mit der Krummdarm, umgeben von den Ring.
    8. Sicherzustellen Sie, dass der Silikonring vollständig Ileum umgibt, schließen Sie den Ring mit Naht und legen Sie den Darm vorsichtig zurück in die intraperitoneale Hohlraum.
  3. Chirurgie-Schließung
    1. Führen Sie eine einfache kontinuierliche Naht auf der Musculoperitoneal Ebene entlang der Linea Alba, schließen die Musculoperitoneal Wunde mit einer resorbierbaren Naht. Nachdem die Naht abgeschlossen ist, reinigen Sie eine Blutung mit 0,9 % sterile Kochsalzlösung getränkten Gaze.
    2. Um die Wunde mit einer separaten Nylon-Naht vollständig zu schließen führen Sie eine einfache kontinuierliche Naht auf der Haut.
    3. Nachdem beide Fäden abgeschlossen haben, reinigen Sie die Wunde mit neuen Swabstick oder Povidon-Jod.
    4. Intraperitoneale Injektion Antibiotika (Gentamicin, 150 μL pro Maus basierend auf 20-30 g Körpergewicht).
    5. Nach Abschluss des Verfahrens, schalten Sie Verdampfer Isoflurane und lassen das Tier nur fließende atmen Sauerstoff bis es beginnen Bewusstsein zu gewinnen.
    6. Sobald das Tier erwacht ist, legen Sie das Tier in einem separaten Recovery-Bereich mit thermischen Unterstützung bis vollständig erholt.

3. postoperative Beobachtung.

  1. Bewegen Sie nach Abschluss der Operation die Tiere in einem Inkubator in einen Aufwachraum wo Temperatur und Feuchtigkeit reguliert. Überwachen Sie die Tiere nach der Operation alle 15 min für die erste Stunde dann alle 30 Minuten für die zweite Stunde, während die Tiere in den Inkubator.
  2. Sobald die vorgeschriebene Beobachtung abgeschlossen ist, bewegen Sie die Tiere an ihre eigenen individuellen Käfig und überwachen sie täglich für klinische Indikationen Schmerzen18, und um sicherzustellen, dass die Operationswunde richtig ohne irgendwelche Anzeichen von Komplikationen (Heilung ist Dehiszenz) vorhanden.

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Ergebnisse

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Partielle Obstruktion (PO) wurde operativ in einen Monat alt Mäuse induziert, indem man einen Silikonring um Ileum in der Nähe der Ileocecal Schließmuskel. Dieser Ring erstellt eine teilweise Blockade im Ileum. Schein-Operationen (SO) auch ohne Ring auf Alter/Geschlecht durchgeführt wurden abgestimmt Mäuse und diese Mäuse nicht zeigen keine Symptome ähnlich denen in PO Mäuse gefunden. Mäuse erholten sich schnell von der PO-Operation innerhalb weniger Stunden. Sie zeigte keine offensichtli...

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Diskussion

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Wir zeigten, dass Mäuse erhält der Darm PO-Operation konsequent und reproduzierbar intestinalen glatten Muskel-Hypertrophie, entwickeln die menschliche Darmverschluss imitiert. Intestinale Obstruktion Operationen wurden für verschiedene Tiere wie Mäuse7, Ratten10, Meerschweinchen11, Hund12 und Katzen13entwickelt. Die Maus-Modell der Darmverschluss hat Zeit, Kosten, Größe und phänotypischen Vorteile gege...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren möchte Benjamin J Weigler, D.V.M, Ph.d. und Walt Mandeville, D.V.M (Tier-Ressourcen & Campus besuchen Tierarzt, Universität von Nevada, Reno) für ihre hervorragende Tieren Dienstleistungen bereitgestellt, um die Mäuse sowie ihren Rat auf chirurgische Eingriffe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
OP-AbdecktuchMedizinischer und veterinärmedizinischer BedarfSMS4040" X100 Yards
Unterlage, econ, pro plusMedizinischer und veterinärmedizinischer BedarfMSC28122417x24"
IrisschereBraintree scientific, IncSC-i-130
IrisschereVantageV95-304
Dumont Pinzette für Elektronik und JuwelierDumont98-180-3
Geflochtenes resorbierbares NahtmaterialCovidien PolysorbSL-5687G5-0, Polyglactin
Nylon nicht resorbierbares MonofilamentAD chirurgischesS-N618R136-0, Nylon
Chirurgische KlingeDynarexNr.15
NadelhalterJacobson mikrovaskulär36-1342TC8,5 Zoll
SkalpellgriffFlinn scientificAB1049
Mikrochirurgische SchereWPI503305
Vaseline AugensalbePuralube VET3,5 g
Fluriso (Isofluran))VetoneV1 502017250 ml
Steri-Streifen verstärkter Hautverschluss3MR1547
OP-HandschuheMedlineMSG2270
Ohrschlaufe GesichtsmaskeDie SicherheitszoneRS700
Avant Gaze VliesschwämmePflegendePRM25444
OP-PfanneAdmiral OYC-2725-A422,5 oz
TupferChloraPrep2601032% w/v Chlorhexidin   Gluconat (CHG) und 70 % v/v Isopropylalkohol (IPA)
Applikator mit WattespitzePuritan806-WC
BuprenorphinZoo PharmBZ80693171 mg/ml
GentamycinsulfatVetoneG-6336-04100 mg/ml
Schnell wirkender Gel-CremeentfernerVeet8111002
Spritze AHSAH01T25161 ml mit Nadel
SilikonringVWR60985-7206 mm lang, 4 mm Außendurchmesser, 3,5 mm Innendurchmesser
C57BL/6 MäuseThe Jackson Laboratory4-6 Wochen alt

Referenzen

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SilikonringimplantationGlattmuskelhypertrophieCajal interstitielle ZellenPDGFR Alpha Zellengastrointestinale Gewebeanalysechirurgisches VerfahrensprotokollIn vivo Modellzellul res Remodeling

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