Methodenartikel

Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

DOI:

10.3791/57385

⸱

1. Mai 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

Zusammenfassung

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RNA-Interferenz (RNAi) hat für die Aufdeckung der biologischen Funktionen von zahlreichen Genen weit angewendet worden und hat als eine Pest Control Tool betriebliche durch Störung der wesentlichen Genexpression vorgesehen. Obwohl verschiedene Methoden, wie Injektion, füttern und Tränken, für die erfolgreiche Durchführung der doppelsträngige RNA (DsRNA) gemeldet worden sind, ist die Effizienz der RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA hochvariablen unter verschiedenen Insektengruppen. Die Deutsche Schabe, Blattella Germanica, ist sehr empfindlich auf die Injektion von DsRNA, wie von vielen bisher veröffentlichten Studien gezeigt. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode, um nachzuweisen, dass die DsRNA gekapselt mit Liposomen Träger ausreichen, um den Abbau von DsRNA Mitteldarm Fruchtsaft zu verzögern. Vor allem die kontinuierliche Beschickung der DsRNA deutlich von Liposomen verkapselt reduziert den Tubulin-Ausdruck in den Mitteldarm und führte zum Tod von Kakerlaken. Abschließend könnte die Formulierung und Verwendung von DsRNA Lipoplexes, die DsRNA gegen Nukleasen zu schützen, eine praktische Anwendung der RNAi für Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

Einleitung

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RNAi ist durch einen Mechanismus eines Posttranskriptionale stummschaltungs-Signalwegs, ausgelöst durch DsRNA Moleküle in viele Eukaryonten1als eine wirksame Methode, Knockdown Genexpression nachgewiesen. Im letzten Jahrzehnt Studie geworden RNAi ein nützliches Werkzeug, um die Funktionen von Genen aus Entwicklung, Verhalten zu studieren, durch Abbau der Expression bestimmter Gene mittels Injektion und/oder Fütterung von DsRNA in verschiedenen Taxa Insekten2,3. Aufgrund der Spezifität und Robustheit der abbauende Wirkung ist die Anwendung der RNAi derzeit als mögliche Strategie zur Pest Control Management4,5geprüft. Jedoch sehr unterschiedlich die Effizienz der RNAi Insektenarten, je nach den verschiedenen Genen angestrebt und die Versandmethoden. Eine wachsende Zahl von beweisen deutet darauf hin, dass die Instabilität der DsRNA, die durch Ribonuclease abgebaut wird, ein kritischer Faktor bei der begrenzten Wirksamkeit von RNAi5,6 ist. Zum Beispiel hat die geringe Sensitivität der RNAi in Manduca Sexta durch die Tatsache erklärt worden, dass die DsRNA gemischt mit Hämolymphe innerhalb von 1 Stunde7schnell abgebaut wurde. Ebenso ist die Anwesenheit von Alkali Nukleasen in den Mitteldarm die aufgenommenen DsRNA effizient zu degradieren, stark korreliert mit geringe RNAi-Effizienz in verschiedenen Insektenordnungen8,9,10.

Die mündlichen Lieferung von DsRNA ist besonders interessant für die Anwendung der RNAi in einer Pest Control-Strategie, sondern eine Methode, um den Abbau von DsRNA durch Nukleasen in den Mitteldarm verzögern nicht noch entwickelt wurde, die hätten des Potenzials, wirksam sichern RNAi durch Fütterung. Jedoch wurde die Teilnahmslosigkeit der RNAi mündlichen Lieferung von DsRNA berichtet, durch große Menge an DsRNA, z. B. 50 µg in Bombyx Mori, Fütterung oder kontinuierlich füttern für 8 Tage (8 µg DsRNA insgesamt) in der Locust-Spezies. Die Deutsche Schabe, Blattella Germinica, reagiert sehr empfindlich auf RNAi durch die Injektion von DsRNA11,12,13,14, aber ist nicht ansprechend auf DsRNA durch Fütterung. Vor kurzem, Lin Et al. (2017) haben gezeigt, dass die DsRNA mit Liposomen Träger führt zu erfolgreichen RNAi, Zuschlag die α-Tubulin -gen-Expression in den Mitteldarm und Trigger erhebliche Mortalität der deutschen Schabe15gekapselt. Wie der Abbau von DsRNA in den Mitteldarm der limitierende Faktor für mündliche RNAi ist, dienen die Liposomen-Träger als Vehikel DsRNA vor Erniedrigung, zu schützen, die bei anderen Insekten mit starken Nuklease Aktivitäten im Darm leicht anwendbar ist. Der Hinweis, der Grund für die Wahl des bestimmten Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) wir verwendet wie Liposomen Träger in das aktuelle Protokoll ist, dass es für Insekten Zelle Zeile Transfektion mit weniger Toxizität getestet wurde nach dem Anweisungen des Herstellers. Nach dem Vergleich der verschiedenen Liposom Transfection Systeme in Gharavi Et al. (2013) 16, ist die Effizienz der transfecting kleine interferierende RNA (SiRNA) ungefähr gleich zwischen diesem und anderen handelsüblichen Systemen, die für DsRNA-Delivery-Systeme in anderen Insekten17,18 verwendet wurden . Darüber hinaus ist unsere Fütterung Methode vorsichtig genug, um die richtige Menge an DsRNA von jeder Schabe eingenommen wird, und dass die Ergebnisse sind robust und bestätigten zu gewährleisten. Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen die dieses Protokolls und die Ergebnisse, dass mit DsRNA Lipoplexes DsRNA Stabilität verbessert und die Tür für das Design der Strategie mündlichen Lieferung von RNAi öffnet, die ist ein vielversprechender Ansatz zur Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

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Protokoll

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(1) Synthese und Vorbereitung der dsRNA

  1. DsRNA-Ziel-Sites in der 3' untranslatierten Region der Zielgene zu identifizieren. Die DsTub dient zur Ausrichtung auf das α-Tubulin (Wanne) Gen (GenBank Zbl-Nummer: KX228233), und DsEGFP wie ein negativer DsRNA-Steuerelement aus der Abfolge von konzipiert ist grüne Fluoreszenz-Protein (EGFP; GenBank Zbl-Nummer: LC311024).
  2. Führen Sie standard PCR Verstärkung um die DsRNA-Vorlagen mit Gen-spezifische Primer, enthält die T7 promotorsequenz synthetisieren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). Die PCR-Amplifikation Zustände und Primer-Informationen verwendet sind die gemeldeten Lin Et Al. (2017) 12 (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Fahren Sie mit DsRNA Vorbereitung mit einer T7 Transkription Kit (siehe Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Hohe Quantität DsRNA, mischen zwei Reaktionen in einem Rohr (in insgesamt 40 µL), und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  4. Fügen Sie 2 µL DNase (siehe Tabelle der Materialien) in DsRNA Proben für 15 min bei 37 ° C zu verdauen DNA-Vorlagen.
  5. Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.
  6. Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
  7. Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.
  8. Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.
  9. Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
  10. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.
  11. Entfernen Sie das Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min, dann Aufschwemmen Sie DsRNA mit RNase-freies Wasser.
  12. Bestimmen Sie die Menge der gereinigten DsRNA mit einem Mikro-Volume UV-Vis Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers und Anpassung an die gewünschte Konzentration (z.B., 0,25 µg/µL für Zubereitung von DsRNA Lipoplexes).
  13. Speichern Sie die DsRNA Proben bei-20 ° C für bis zu 3 Monaten.

2. Vorbereitung des DsRNA Lipoplexes

  1. Verdünnen Sie 4 µL des Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung verdünnt werden. Verdünnen Sie 4 µL DsRNA (1 µg) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung.
  2. Hinzufügen der verdünnten Liposomen Reagenzlösung unmittelbar in die verdünnte DsRNA-Lösung auf einmal. Vortex kurz zu vermischen, dann 15 Minuten bei 25 ° c inkubieren
    Hinweis: Verwechseln Sie nicht die Lösungen in umgekehrter Reihenfolge.
  3. DsRNA Lipoplexes sind einsatzbereit. Innerhalb von 1 Stunde Vorbereitung, und verwerfen nach 1 Stunde.
    Hinweis: Nach den Anweisungen des Herstellers sollte so bald wie möglich den Lipoplexes verwendet werden.

3. Sammlung von extrazellulären Enzyme vom Hämolymphe und Mitteldarm Saft

  1. Insekt-saline-Puffer (10 X verfügbar)
    1. Mischen Sie 900 mL mit 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl und 6,3 g CaCl28,3 g MgCl2·6H2O. Doppeltes destilliertes Wasser
    2. Passen Sie pH-Wert auf 6,8 an, und füllen Sie bis zu 1.000 mL.
  2. Hämolymphe Sammlung
    1. Betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich 3 Minuten lang nicht bewegen.
    2. Halten Sie die Schabe mit zwei Fingern (Daumen und Zeigefinger) und auftauchen Sie der Bauchseite die Schabe.
    3. Verwenden Sie die sezierenden Scheren aus der Spitze von einer Coxa ein Hinterbein abgeschnitten.
      Hinweis: Schneiden Sie die angeschlossenen Schnittpunkt zwischen Coxa und Trochanter. Die Exzision des anderen Teils Coxa war weniger effizient, Hämolymphe zu sammeln.
    4. Drücken Sie den Bauch sanft mit Mittelfinger und sammeln Sie die Hämolymphe Blutungen aus der Schnitt mit einer 10 µL Mikropipette.
    5. Die Hämolymphe aus mehreren Kakerlaken (5 Personen) in einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln.
      Hinweis: Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, Melanization zu verhindern. Das durchschnittliche Volumen der Hämolymphe erhalten von einem männlichen Schabe ist ca. 2-3 µL.
    6. Spin-down der Hämolymphe kurz mit einem Benchtop-Zentrifuge für 10 s.
    7. Übertragen Sie gewünschte Lautstärke der Hämolymphe (d.h. 10 µL) zu, und mischen Sie es mit 50 µL 1 X Insekt saline Puffer.
    8. Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, unten Hemocytes zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.
    9. Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.
    10. Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).
  3. Mitteldarm Saft Sammlung
    1. Die Kakerlaken auf dem Eis zu betäuben. Repariere die Kakerlaken Bauchseite auf der Dissektion Platte mit kalten 1 X Insekt saline Puffer mit Insekt Pins.
    2. Zerlegen Sie den Bauch mit einer feinen Pinzette. Gesamte Darm (einschließlich des vorderen Mitte und Hinterbeinen Darms) auf einen frischen Teller mit 1 x Insekt saline Puffer zu entfernen.
    3. Entfernen Sie den vorderen und hinteren Darm und schnelle Übertragung der Mitteldarm zu einem Microcentrifuge Schlauch, der 100 µL Insekt saline Puffer enthält.
    4. Bündeln Sie die Midguts von sechs Kakerlaken im gleichen Rohr und Wirbel für 10 s.
    5. Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, die Hemocytes und Darm Gewebe zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.
    6. Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.
    7. Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).

4. DsRNA Abbau Assay

  1. Frisch bereiten Sie 4 µL des nackten DsRNA oder DsRNA Lipoplexes (1 µg zu).
  2. Mischen Sie DsRNA Lösungen mit 10 µL Insekt saline Puffer (Kontrolle), extrahiert Enzyme vom Hämolymphe oder Mitteldarm Saft.
  3. Fügen Sie 2 µL RNase-freies Wasser oder EGTA (20 mM), Proben als Steuerelemente für die Hemmung der Enzym-Aktivitäten zu trennen.
  4. 1 Stunde oder länger (6, 12 oder 24-Stunden) bei 25 ° c inkubieren
  5. Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.
  6. Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
  7. Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.
  8. Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.
  9. Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
  10. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.
  11. Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min. Aufschwemmen DsRNA mit 10 µL RNase-freies Wasser zu entfernen.
  12. Überprüfen Sie die Integrität der behandelten DsRNA per Gelelektrophorese auf einem 1,5 % Agarose-Gel.

(5) die orale Verabreichung von dsRNA

  1. Kakerlaken auf eine Ad Libitum Ernährung Trockenfutter (Hund Chow) zu erhalten. Wasserversorgung von den Kakerlaken DsRNA Einnahme Experimente am Vortag zu berauben.
  2. Halten Sie eine Kakerlake, packte seine Flügel mit der flexiblen Zange (Abbildung 1, Schritt 5).
    Hinweis: Berühren Sie nicht die Körperteile von Kakerlaken.
  3. Vorbereiten der DsRNA Lipoplexes sowie nackt DsRNA, Fütterung, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
    Hinweis: DsRNA Lipoplexes sollte vor der Fütterung frisch zubereitet werden.
  4. Futter 4 µL DsRNA Lipoplexes oder nackt DsRNA (250 ng) mit einer Mikropipette.
  5. Langsam pipettieren der Tropfen der DsRNA-Lösung die Mundwerkzeuge der Kakerlaken in der Nähe und lassen Sie die Kakerlaken aufnehmen des tröpfchens komplett.
  6. Durchführen Sie zweimal täglich (1 h nach Lichter auf und 1 h vor dem Licht aus) die Einnahme Experimente, für 8 oder 16 Tage kontinuierlich.
    Hinweis: Alle Kakerlaken erworben Wasser nur durch manuelles zuführen mit DsRNA Lösung oder Kontrolle Reagenzien (z. B.Nuklease freies Wasser, Glukoselösung und Liposomen Reagenz) während der Einnahme Experimente.
  7. Die Kakerlaken ermöglichen Sie Wasserflaschen nach 16 Tagen der Einnahme von DsRNA Experimente.

6. beurteilen Knockdown

  1. Gewählten Zeitpunkt Punkte (2, 9 und 17 Tage nach DsRNA Einnahme Assay), die DsEGFP und DsTub-behandelten Insekten sammeln und sezieren die gewählten Gewebe (z.B. Mitteldarm).
  2. Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR). Die qRT-PCR-Amplifikation Bedingungen und Primer-Informationen wie Lin Et al.berichtet. (2017) 12.
  3. Beurteilen Sie die Kontrolle und DsRNA-behandelte Insekten täglich Sterblichkeit zu überprüfen und entfernen die Kakerlaken, die nicht mehr in Bewegung sind.

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Ergebnisse

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Ein vereinfachtes Schema des Protokolls für die mündlichen Lieferung von DsRNA präsentiert sich in Abbildung 1, wo die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes gezeigt werden.

Um den Schutz von Liposomen Trägern auf DsRNA Abbau in den Mitteldarm Saft B. Germanica, ein ex-Vivo -Test wo DsTub Lipoplexes mit Mitteldarm Saft inkubiert wurden durchgeführt wurde und...

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Diskussion

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Dieses Protokoll stellt eine Methode für wirksame RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA Lipoplexes, denen Schutz gegen Ribonuklease Verdauung in den Mitteldarm Saft der deutschen Schabe. Wie in anderen Studien in verschiedenen Insektenarten gezeigt, der Armen RNAi-Effekt durch mündliche Lieferung von DsRNA vor allem durch den Abbau von DsRNA8,9,10entfallen. Dieses Protokoll produziert Liposomen, die als schützende Fahrzeuge i...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Taiwan (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, 100-2923-B-002-002-MY3 und 106-2313-B-002-011-MY3, H.J.L.), der Tschechischen Republik (gewähren Agentur der Südböhmischen Universität, GAJU gewähren Y.H.L 065/2017/P), und Spanien ( Gewähren Sie spanischen Wirtschaftsministerium und Wettbewerbsfähigkeit, räumt CGL2012-36251 und CGL2015-64727-P X.B. und der katalanischen Regierung 2014 SGR 619 X.B.); Es erhielt auch finanzielle Unterstützung aus dem Europäischen Fonds für wirtschaftliche und Regionalentwicklung (FEDER Mittel zu X.B.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GenJe Plus DNA in vitro TransfektionsreagenzSignaGenSL100499zur Herstellung von Lipoplexen
Blend Taq plusTOYOBOBTQ-201für PCR
Fast SYBR Green Master MixABI 4385612für qPCR
FirstChoice RLM-RACE KitInvitrogenAM1700für die 3' UTR-Identifizierung 
MEGAscript T7 TranskriptionskitInvitrogenAMB13345für die dsRNA-Synthese
TURBO DNaseInvitrogenAM2239DNA-Template aus dsRNA entfernen
TRIzolInvitrogen15596018für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion
RQ1 RNase-freie DnasePromegaM6101DNA-Template aus Gesamt-RNA entfernen
Chloroform Sigma-AldrichC2432für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion
2-PropanolSigma-AldrichI9516für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion
EthanolSigma-Aldrich24102für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion
Diethylpyrocarbonat, DEPCSigma-AldrichD5758für RNasefreie Wasseraufbereitung
GlukoselösungSigma-AldrichG3285zur Herstellung von Lipoplexen
Natriumchlorid, NaClSigma-AldrichS7653Insektensalzpufferformel
Kaliumchlorid, KClSigma-AldrichP9333Insektensalzpufferformel
Calciumchlorid, CaCl2Sigma-AldrichC1016Insektensalzpufferformel
Magnesiumchlorid-Hexahydrat, MgCl2.6H2OSigma-AldrichM2670Insektensalzpuffer Formel
EGTA Sigma-AldrichE3889Enzym-Inhibitor
PräparierschereF.S.T.Kakerlaken-Präparierung
feine PinzetteF.S.T.Kakerlaken-Dissektion
flexible PinzetteF.S.T.Kakerlaken-Holding 
PipettiererRAININP10
MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT175C, PCR02Cfür Probenvorbereitung
Pipettenspitze AxygenProbenvorbereitung
vortexterDigisystemvm1000Probenvorbereitung
Minispin ZentrifugeThe Gruffin GroupGMC 206für Liquid Spin Down 
ZentrifugeALCPK121R
pH-Messgerät für ProbenvorbereitungJENCO6071für pH-einstellbares
Mikrovolumen-SpektrophotometerQuawellQ3000Nukleinsäuren quantitative
PCR ThermocyclerABI 2720für die Template-PCR oder  dsRNA-Synthese Inkubation 
quantitative real-time PCRABI StepOne plusGenexpression quantitative
Zentrifugal-Vakuumkonzentratoreneppendorf5301für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion
Multipette eppendorfxstreamfür die Beladung von Real-Time-PCR-Proben 
Agarose Iamresco0710für Nukleinsäureelektrophorese
Tub Gen specfifc Forward PreimerTri-I BiotechGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
Tub Gene Specfifc Reverse PreimerTri-I BiotechTCC TGC TCC TCC TGT CTC GCT
GA dsTub Template Forward PrimerTri-I BiotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTub Template Reverse Primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP Template Forward PreimerTri-I BiotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP Template Reverse PreimerTri-I BiotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA
CC tub qPCR Forward Primertri-I biotechGGA CCG CAT CAG GAA ACT
GGC tub qPCR reverse preimertri-I biotechCCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR Forward Primertri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimertri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G
für Probenvorbereitung

Referenzen

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Schlagwörter

German CockroachMidgut JuiceTubulin ExpressionHemolymph CollectionEnzyme InhibitionContinuous Feeding

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