Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.
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Methodenartikel
Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
RNA-Interferenz (RNAi) hat für die Aufdeckung der biologischen Funktionen von zahlreichen Genen weit angewendet worden und hat als eine Pest Control Tool betriebliche durch Störung der wesentlichen Genexpression vorgesehen. Obwohl verschiedene Methoden, wie Injektion, füttern und Tränken, für die erfolgreiche Durchführung der doppelsträngige RNA (DsRNA) gemeldet worden sind, ist die Effizienz der RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA hochvariablen unter verschiedenen Insektengruppen. Die Deutsche Schabe, Blattella Germanica, ist sehr empfindlich auf die Injektion von DsRNA, wie von vielen bisher veröffentlichten Studien gezeigt. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode, um nachzuweisen, dass die DsRNA gekapselt mit Liposomen Träger ausreichen, um den Abbau von DsRNA Mitteldarm Fruchtsaft zu verzögern. Vor allem die kontinuierliche Beschickung der DsRNA deutlich von Liposomen verkapselt reduziert den Tubulin-Ausdruck in den Mitteldarm und führte zum Tod von Kakerlaken. Abschließend könnte die Formulierung und Verwendung von DsRNA Lipoplexes, die DsRNA gegen Nukleasen zu schützen, eine praktische Anwendung der RNAi für Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.
Einleitung
RNAi ist durch einen Mechanismus eines Posttranskriptionale stummschaltungs-Signalwegs, ausgelöst durch DsRNA Moleküle in viele Eukaryonten1als eine wirksame Methode, Knockdown Genexpression nachgewiesen. Im letzten Jahrzehnt Studie geworden RNAi ein nützliches Werkzeug, um die Funktionen von Genen aus Entwicklung, Verhalten zu studieren, durch Abbau der Expression bestimmter Gene mittels Injektion und/oder Fütterung von DsRNA in verschiedenen Taxa Insekten2,3. Aufgrund der Spezifität und Robustheit der abbauende Wirkung ist die Anwendung der RNAi derzeit als mögliche Strategie zur Pest....
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Protokoll
(1) Synthese und Vorbereitung der dsRNA
- DsRNA-Ziel-Sites in der 3' untranslatierten Region der Zielgene zu identifizieren. Die DsTub dient zur Ausrichtung auf das α-Tubulin (Wanne) Gen (GenBank Zbl-Nummer: KX228233), und DsEGFP wie ein negativer DsRNA-Steuerelement aus der Abfolge von konzipiert ist grüne Fluoreszenz-Protein (EGFP; GenBank Zbl-Nummer: LC311024).
- Führen Sie standard PCR Verstärkung um die DsRNA-Vorlagen mit Gen-spezifische Primer, enthält die T7 promotorsequenz synthetisieren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). Die PCR-Amplifikation Zustände und Primer-Informationen verwendet sind die gemeldeten Lin Et Al. (2017)
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Ergebnisse
Ein vereinfachtes Schema des Protokolls für die mündlichen Lieferung von DsRNA präsentiert sich in Abbildung 1, wo die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes gezeigt werden.
Um den Schutz von Liposomen Trägern auf DsRNA Abbau in den Mitteldarm Saft B. Germanica, ein ex-Vivo -Test wo DsTub Lipoplexes mit Mitteldarm Saft inkubiert wurden durchgeführt wurde und.......
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Diskussion
Dieses Protokoll stellt eine Methode für wirksame RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA Lipoplexes, denen Schutz gegen Ribonuklease Verdauung in den Mitteldarm Saft der deutschen Schabe. Wie in anderen Studien in verschiedenen Insektenarten gezeigt, der Armen RNAi-Effekt durch mündliche Lieferung von DsRNA vor allem durch den Abbau von DsRNA8,9,10entfallen. Dieses Protokoll produziert Liposomen, die als schützende Fahrzeuge i.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Taiwan (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, 100-2923-B-002-002-MY3 und 106-2313-B-002-011-MY3, H.J.L.), der Tschechischen Republik (gewähren Agentur der Südböhmischen Universität, GAJU gewähren Y.H.L 065/2017/P), und Spanien ( Gewähren Sie spanischen Wirtschaftsministerium und Wettbewerbsfähigkeit, räumt CGL2012-36251 und CGL2015-64727-P X.B. und der katalanischen Regierung 2014 SGR 619 X.B.); Es erhielt auch finanzielle Unterstützung aus dem Europäischen Fonds für wirtschaftliche und Regionalentwicklung (FEDER Mittel zu X.B.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| GenJe Plus DNA in vitro Transfektionsreagenz | SignaGen | SL100499 | zur Herstellung von Lipoplexen |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | für PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | für qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | für die 3' UTR-Identifizierung |
| MEGAscript T7 Transkriptionskit | Invitrogen | AMB13345 | für die dsRNA-Synthese |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | DNA-Template aus dsRNA entfernen |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion |
| RQ1 RNase-freie Dnase | Promega | M6101 | DNA-Template aus Gesamt-RNA entfernen |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion |
| Diethylpyrocarbonat, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | für RNasefreie Wasseraufbereitung |
| Glukoselösung | Sigma-Aldrich | G3285 | zur Herstellung von Lipoplexen |
| Natriumchlorid, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Insektensalzpufferformel |
| Kaliumchlorid, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | Insektensalzpufferformel |
| Calciumchlorid, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Insektensalzpufferformel |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | Insektensalzpuffer Formel |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Enzym-Inhibitor |
| Präparierschere | F.S.T. | Kakerlaken-Präparierung | |
| feine Pinzette | F.S.T. | Kakerlaken-Dissektion | |
| flexible Pinzette | F.S.T. | Kakerlaken-Holding | |
| Pipettierer | RAININ | P10 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Axygen | MCT175C, PCR02C | für Probenvorbereitung |
| Pipettenspitze | Axygen | Probenvorbereitung | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | Probenvorbereitung |
| Minispin Zentrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | für Liquid Spin Down |
| Zentrifuge | ALC | PK121R | |
| pH-Messgerät für Probenvorbereitung | JENCO | 6071 | für pH-einstellbares |
| Mikrovolumen-Spektrophotometer | Quawell | Q3000 | Nukleinsäuren quantitative |
| PCR Thermocycler | ABI | 2720 | für die Template-PCR oder dsRNA-Synthese Inkubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | Genexpression quantitative |
| Zentrifugal-Vakuumkonzentratoren | eppendorf | 5301 | für dsRNA- oder Gesamt-RNA-Extraktion |
| Multipette | eppendorf | xstream | für die Beladung von Real-Time-PCR-Proben |
| Agarose I | amresco | 0710 | für Nukleinsäureelektrophorese |
| Tub Gen specfifc Forward Preimer | Tri-I Biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| Tub Gene Specfifc Reverse Preimer | Tri-I Biotech | TCC TGC TCC TCC TGT CTC GCT | |
| GA dsTub Template Forward Primer | Tri-I Biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub Template Reverse Primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP Template Forward Preimer | Tri-I Biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP Template Reverse Preimer | Tri-I Biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA | |
| CC tub qPCR Forward Primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT | |
| GGC tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR Forward Primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
Referenzen
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
