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In den vergangenen 20 Jahren haben Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie große Fortschritte mit Hilfe chemischer Genetik Ansätze, sowohl vorwärts als auch rückwärts, gemacht, ein besseres Verständnis der Zellwand Biosynthese, Zellskelett, Hormon-Biosynthese und Signalisierung, Gravitropismus, Pathogenese, Purin-Biosynthese und Endomembrane Handel mit1,2,3,4,5. Einsatz nach vorne Chemische Genetik Techniken ermöglicht die Identifizierung von Phänotypen von Interesse und erlaubt es den Forschern, die genotypischen Grundlagen für bestimmte Prozesse zu verstehen. Im Gegensatz dazu sucht reverse Chemische Genetik Chemikalien, die mit einer vorher festgelegten Protein Ziel6interagieren. Arabidopsis hat an der Spitze dieser Entdeckungen in Pflanzenbiologie, weil sein Genom klein abgebildet und kommentiert. Es hat eine kurze Generationszeit, und es gibt mehrere Mutant/Reporter Zeilen zur Verfügung, um die Identifizierung von aberranten subzelluläre Maschinen7zu erleichtern.
Es gibt zwei große Engpässe, die verlangsamen den Fortschritt der vorwärts chemische genetische Bildschirme, die ersten screening-Prozess und bestimmen das Ziel der Verbindung von Interesse8. Eine große Hilfe bei der Erhöhung der Geschwindigkeit des kleinen Molekül-Auswahl ist die Verwendung von Automatisierung und automatisierte Anlagen9. Liquid Handling-Roboter sind ein hervorragendes Instrument für den Umgang mit großen Bibliotheken von kleinen Molekülen und maßgeblich voran in den biologischen Wissenschaften10gewesen. Die hier vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um den Engpass zugeordneten Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von bioaktiven kleine Moleküle mit einer schnellen Rate. zu lindern Diese Technik verringert die Last der Arbeit und Zeit im Auftrag des Betreibers und auch gleichzeitig die wirtschaftliche Kosten für die Prinzip-Ermittler.
Bisher haben die meisten chemische Bibliotheken analysiert zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, einige mit mehr als 150.000 andere mit nur 709,11,12,13,14, statt. 15 , 16. das Protokoll hier eingeführt wurde auf einer kleinen Molekül-Bibliothek von 50.000 Verbindungen (siehe Tabelle der Materialien) umgesetzt, die größeren vorwärts Chemische Genetik Bildschirme durchgeführt auf Arabidopsis bis heute. Dieses Protokoll passt mit dem aktuellen Trend zu mehr Effizienz und Geschwindigkeit betreffend vorwärts Chemische Genetik, zumal es bezieht sich auf Fungizid, Herbizid Entdeckung, Insektizid Entdeckung entdecken, drug Discovery und Krebsbiologie17 ,18,19,20,21. Obwohl hier mit Arabidopsis implementiert, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden Zellkulturen, Sporen und möglicherweise sogar Insekten im flüssigen Medium innerhalb 96, 384 oder 1536-Well Platten. Aufgrund seiner geringen Größe ist Arabidopsis zugänglicher Screening in 96-well-Platten. Verteilung von Saatgut gleichmäßig auf alle Brunnen ist jedoch eine Herausforderung. Aussaat von Hand genau, aber arbeitsintensiv ist, und zwar gibt es Geräte, die Samen in 96-Well Platten zu verzichten, sie sind teuer in der Anschaffung. Hier zeigen wir, wie dieser Schritt mit nur einem kleinen Verlust an Genauigkeit umgangen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode war eine große chemische Bibliothek gegen Arabidopsis mehr überschaubar, ohne Kompromisse bei der Genauigkeit, über die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter screening zu machen. Die Verwendung dieser Methode verbessert die Effizienz des Forschers durch verringern den Zeitaufwand für die anfängliche Verdünnung Serie Management und nachfolgenden phänotypischen Bildschirmen ermöglicht schnelle Visualisierung der Proben unter dem sezierenden Mikroskop und schnelle Runden Identifizierung neuer bioaktiver kleiner Moleküle. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses Protokolls in 4 Schritten.

Abbildung 1: allgemeine Workflow des Bildschirms nach vorne Chemische Genetik. Einen Überblick über das Protokoll für jedes der 4 wichtigsten Schritte mit einigen Details beschrieben werden. 1: Erhalt der chemischen Bibliothek, 2: die Verdünnung Bibliothek, 3: macht die Screening-Platten und 4: Inkubation und Visualisierung der Screening-Platten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.