Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

9.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/57410

⸱

20. März 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Zusammenfassung

Die DNA-Schäden als Reaktion (DDR) verwendet eine Vielzahl von Proteinen zu erkennen, zu signalisieren und DNA-Läsionen zu reparieren. Abgrenzung dieser Reaktion ist entscheidend für die Genom-Wartung-Mechanismen zu verstehen. Da Rekrutierung und Austausch von Proteinen bei Läsionen sehr dynamisch sind, erfordert ihre Studie die Fähigkeit, DNA-Schäden schnell und räumlich abgegrenzt zu generieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur DNA-Schäden in den menschlichen Zellen mit einem handelsüblichen Laserscanning-konfokale-Mikroskop verfügt über eine 405 nm Laserlinie lokal zu induzieren. Ansammlung von Genom-Wartung, die Faktoren bei Laser Streifen durch Immunfluoreszenz (IF) oder in Echtzeit bewertet werden können mittels Proteine mit fluoreszierenden Reporter verschlagwortet. Verwendung von phosphorylierten Histon H2A. X (γ-H2A.X) und Replikation Protein A (RPA) als Marker, die Methode bietet ausreichenden Auflösung lokal rekrutiert Faktoren von denen zu unterscheiden, die auf angrenzenden Chromatin verteilt. Wir bieten weitere ImageJ-basierte Skripts effizient überwachen die Kinetik der Protein Relokalisierung DNA Websites beschädigen. Diese Verfeinerungen erleichtern erheblich die Studie der DDR Dynamik.

Einleitung

Zellen sind ständig endogenen und exogenen Quellen von DNA-Schäden ausgesetzt, die ihre genomischen Unversehrtheit bedrohen. Die DDR ist ein Ensemble der Signalwege, die erkennen, zu signalisieren und zu reparieren DNA-Läsionen um Genomstabilität aufrecht zu erhalten. Im DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB), tritt die DDR hauptsächlich auf zwei komplementäre Plattformen: γ-H2A.X-mit der Bezeichnung Chromatin und einer resezierten einzelsträngiger DNA (SsDNA) Region in der Regel mit dem SsDNA-Bindung komplexe RPA1,2beschichtet.

UV-Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen, die bereits mit dem Thymidin analoge 5-Bromo-2' Deoxyuridine (BrdU) oder der Bisbenzimide Ethoxide Trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA-Farbstoff sensibilisiert schafft eine Mischung aus einsträngiger Pausen (einschließlich DNA-Läsionen SSBs) und DSB, die eine lokalisierte DDR auf das Chromatin und SsDNA Plattformen3,4zu entlocken. Vorherigen Arbeiten zeigten, dass die Rekrutierung von Genom Wartungsfaktoren, diese zwei unterschiedlichen Plattformen auf DSB mit hochenergetischen UV-A-Lasern (335-365 nm) kombiniert mit IF2,5diskriminiert werden kann. Mikroskope mit solchen Lasern ausgestattet sind teuer, da sie ein Hochenergie-Laser und spezielle UV-A Übertragung Ziele damit weit weniger verbreitet in akademischen und pharmazeutischen Einstellungen als Laserscanning-konfokale Mikroskope mit 405 nm Laser erfordern Linien. Die Untersuchung von Protein-Rekrutierung und Austausch an Mikro-bestrahlten Standorten ist auch durch die mühsame manuelle Bildanalyse erforderlich, um das dynamische Verhalten des Genoms Wartungsfaktoren beschreiben ausgeschlossen.

Hier zeigen wir, dass die Pre-Sensibilisierung der Zellen mit BrdU oder BBET Nukleinsäure-Fleck gefolgt von Mikro-Bestrahlung mit einem 405 nm-Laser auf eine gemeinsame confocal Mikroskop ermöglicht die Überwachung des Genoms Wartung Faktor Dynamik bei DNA-Läsionen. Mit γ-H2A.X oder RPA komplexe Untereinheiten als Plattform Marker zusammen mit Z-Stapeln für größere Schärfentiefe und Dekonvolution für verbesserte Auflösung ermöglicht den Experimentator, Faktoren zu unterscheiden, die lokal zu DSB von denen geworben werden, die zu verbreiten großen Chromatin Domains rund um die ersten Läsion. Diese Untergliederungen nach unterschiedlichen Intra nuklearen Fächer hilft die möglichen Rollen des Fußgelenkes Proteine rekrutiert zu Mikro-bestrahlt Websites zu verfeinern. Wir bieten bequeme Protokolle und optimiert Rohrleitungen um die Dynamik des Genoms Wartungsfaktoren mit Open-Source-Software Fidschi (eine ImageJ-Verteilung)6,7,8schnell zu analysieren. Diese Verfeinerungen zu aktuellen Mikro-Bestrahlung Methoden ermöglichen die Studie der DDR in praktisch jedem Labor.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Pre-Sensibilisierung der Zellen

  1. 24 h vor der Mikro-Bestrahlung Experiment seed 40.000 U2OS Zellen pro Bohrloch in 1 X DMEM mit 10 % FBS in 8-Well Kultur mit 170 µm dicken Deckglas-wie Glas/Kunststoff-Böden gleitet zu gewährleisten maximale Durchlässigkeit von 405 nm Laserlicht und exzellente Bildgebung mit einem Laser-scanning invertiert confocal Mikroskop. Wenn ein 8-Brunnen-Objektträger, verwenden Sie 500 µL Medien oder Lösungen pro Bohrloch für alle nachfolgenden Behandlungen und waschen Schritte des Protokolls.
    Hinweis: Durch ihre flache Morphologie, gute Haftung und große Kerne, U2OS Zellen erleichtern den Nachweis von Protein-Rekrutierung an Mikro-bestrahlten Standorten aber andere adhärenten Zelltypen können je nach Bedarf verwendet werden. Zellen sollten im Idealfall werden rund 80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikro-Einstrahlung auf die Zahl der bestrahlten Zellen pro Versuch. Sehr hohe Zusammenfluss kann Zellzyklus Änderungen ergeben, die spezifische Reparatur Wege wie homologe Rekombination stattfindet während der Phasen des Zellzyklus9S und G2 durcheinanderbringen können.
  2. Brüten die Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2, und dann die Zellen mit (Schritt 1.3) vorab zu sensibilisieren BrdU oder (Schritt 1.4) BBET (Hoechst 33342).
    Hinweis: Um live Rekrutierung eines Proteins von Interesse (POI), DNA-Läsionen zu beobachten, transfizieren Sie oder transduzieren Sie Plasmid-DNA tragen eine Verschmelzung eines fluoreszierenden Proteins und ein POI-24 h nach Aussaat der Zelle. 24 h post-transfection/Transduktion, vorab zu sensibilisieren und Mikro-bestrahlen die Zellen um die Rekrutierung des POI an DNA-Schäden-Standorten in Echtzeit zu überwachen.
  3. Um die Zahl der DSB durch Exposition gegenüber der 405 nm-Laser erzeugt fügen Sie 10 µM von BrdU an die Medien für 24 h vor dem Mikro-Bestrahlung hinzu. Spülen Sie vor dem Mikro-Bestrahlung, mit einer Mikropipette Zellen zweimal mit Medium ohne Phenol Red für maximale Belichtung der Zellen an den 405 nm Laser gewährleisten.
  4. Alternativ behandeln Sie Zellen für 15 min mit BBET bei 10 µg/mL in das entsprechende Medium in einer Zellkultur Inkubator bei 37 ° C. Spülen Sie nach der Behandlung zweimal mit Medium ohne Phenol rot vor Mikro-Bestrahlung.

2. Micro-Bestrahlung von Zellen

  1. Wählen Sie eine geeignete Laserscanning-confocal Mikroskop.
    Hinweis: Die hier vorgestellten Experimente wurden auf einem Mikroskopsystem verfügt über eine 50 mW 405 nm Laserlinie und ein 63 X 1.4 numerische Apertur Öl Ziel durchgeführt. Um DSB zu generieren, Zellen wurden Mikro-bestrahlt, bei 1 X Scan Zoom bei 1.024 x 1.024 Pixel/Field (0,21 µm/Pixel bei 63 X Vergrößerung) und im unidirektionalen Modus 8 µs/Pixel. Die Laserleistung verwendet wurde bzw. 25 % und 80 % für BBET - und BrdU-Pre-sensibilisiert Zellen. Damit können Benutzer ihr System konfigurieren, war der Laser macht nach dem Ziel auf dem vorgestellten System mit einem Leistungsmesser gemäß Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Messungen entsprechen 2,6 mW und 7.0 mW für BBET - und BrdU-Pre-sensibilisiert Zellen, beziehungsweise.
  2. Schalten Sie das Mikroskop und die Klimakammer.
    1. Legen Sie der Kammers auf 37 ° C mit 5 % CO2 , bevor Proben sich in den auf der Bühne Brutkasten befinden, unnötigen Stress zu den Zellen zu vermeiden und homogenen DDR Kinetik in Experimenten zu gewährleisten.
  3. Wählen Sie Felder mit gut verteilten Zellen aus, stellen Sie den Fokus und registrieren Sie ihre Position zur Bildaufnahme nach dem IF-Protokoll zu erleichtern. Erwerben Sie mindestens ein Bild, das als Bezugspunkt zu überwachen, die Kinetik der Protein-Einstellung nach der Mikro-Bestrahlung vor Schäden dienen wird.
    Hinweis: Gerasterten Kulturgefäße können auch verwendet werden, um die Lokalisierung von Mikro-bestrahlten Zellen in nachfolgenden Schritten zu erleichtern.
    1. Stellen Sie für IF-Experimente mit BBET-markierten Zellen den Fokus auf Zellen unter Verwendung der 405 nm-Laser bei der niedrigsten Laserleistung ausreichen, um die Zellen zu visualisieren um ungerechtfertigte DNA-Schäden zu vermeiden.
      1. Vermeiden Sie die Verwendung Weitfeld Fluoreszenz zur Scharfeinstellung auf BBET-gefärbten Zellen wie UV-Licht von der Lampe abgegebenen DNA-Schäden an beleuchteten Orten induziert wird.
    2. Wenn BrdU-markierten Zellen verwenden, stellen Sie den Fokus mit differential Interferenz-Kontrast (DIC) oder Phasenkontrast-Bildgebung durch Sub-atomaren Funktionen wie Nukleolen betrachten.
    3. Wenn Sie Zellen mit dem Ausdruck Eindringmittel beschriftet POIs zu verwenden, wählen Sie eine Brennebene mit repräsentativen Fluoreszenzintensität.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Zellen, die sehr hohe Niveaus des POI zu äußern, wie starke Überexpression Serums Lokalisierung führen kann. Darüber hinaus wählen Sie Zellen, die den POI bei vergleichbarem ausdrücken (Auswahl der stabile Klone wird dringend empfohlen, um Variationen des POI Ausdruck und Rekrutierung zu minimieren).
  4. Konfigurieren Sie das Mikroskop für den Mikro-Bestrahlung Schritt mit dem Fluoreszenz-Recovery nach Immunofluoreszenz (FRAP) _module des Systems.
    Hinweis: Die wichtigsten Parameter zu berücksichtigen, wenn das Mikroskopsystem Einrichtung für Mikro-Bestrahlung Experimente sind: die Ausgangsleistung der 405 nm Laser, Anzahl der Iterationen (d.h. die Anzahl der Zeiten, der Laser wird über dieselben Koordinaten gehen), Anzahl der Pixel/Feld (63 X Vergrößerung und 1.024 x 1.024 Auflösung, 1 Pixel = 0,21 µm), und Verweilzeit pro Pixel. All diese Faktoren wirken sich die Menge an Energie, die Zellen zu erleben und damit die Menge und Art der DNA schädigen generierten (siehe Diskussion weitere Dosis-Optimierung).
  5. Mit dem FRAP-Modul von Mikroskopsystem, Mikro-bestrahlen Sie die Zellen.
    Hinweis: Auf den meisten Systemen kann Mikro-Bestrahlung mehrerer Zellen in einem einzelnen Feld als Punkte oder Linien/Rechtecke (in der Regel 1-2 µm Breite) durchgeführt werden. Bei live-Imaging von Eindringmittel-markierten Proteinen sofort nach dem Schaden Sie, beschränken Sie die Mikro-Einstrahlung auf eine kleine Anzahl von Zellen pro Feld zu, da der Zeitaufwand für die Mikro-bestrahlen jede Zelle zu einer verzögerten Induktion der DDR führt. Dies ist besonders wichtig, bei der Überwachung von Proteinen, die sehr schnell zu DNA-Läsionen rekrutiert werden.
  6. Nach der Mikro-Bestrahlung, setzen Sie wieder den Multi-auch Folien oder Platten in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für die erforderliche Dauer vor der Proben für die Verarbeitung, wenn (Ziff. 5) oder gehen Sie sofort mit live-Imaging (Abschnitt 3).
    1. Als ersten Schritt beheben Sie die Zellen innerhalb von wenigen Minuten und bis zu ein paar Stunden nach Bestrahlung für das IF-Protokoll. Je nach der POI variieren Rekrutierung Kinetik. In der Regel Proteine, die im DSB und SSBs Chromatin verbunden sind werden sehr schnell auf die Läsion lokalisiert und werden manchmal innerhalb von 5 min. entfernt. Einige Faktoren wie diejenigen, die am SsDNA versammeln werden zu späteren Zeitpunkten rekrutiert werden, sobald die Resektion Maschinen engagiert hat und verbleiben dort für Stunden (siehe Abbildung 1 und Referenz4).

3. live-Imaging von Eindringmittel-markierten Proteinen

  1. Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung der Mikro-bestrahlten Zellen. Für Proteine, die sind sehr schnell zu Läsionen rekrutiert, ein paar Sekunden pro Frame ist ideal, für Proteine, die auf den beschädigten Bereich später (z.B. Resektion Faktoren), Erwerb lokalisieren können jedoch alle 1 – 2 Minuten durchgeführt, bis ein Plateau erreicht wird.
    Hinweis: Minimieren Sie die Laserleistung für die Bildaufnahme, Bleichen so weit wie möglich zu vermeiden und sicherzustellen, dass Protein Rekrutierung Standorten Schaden nicht Sättigung erreicht das Signal Quantifizierung ausschließen würde und anschließende analysiert (siehe Datenanalyse (Siehe Abschnitt 4). Auf dem vorgestellten System erfolgte die Bildgebung mit einem 63 X / 1,4 Öl-Objektive verwenden eine Verweilzeit 8 µs/Pixel, Auflösung 1.024 x 1.024, 1 X Zoom und Mittelung der 2. Beachten Sie, dass diese Parameter müssen für andere Systeme und/oder verschiedenen Experimenten optimiert werden können.
  2. Mikro-bestrahlen die Zellen in weiteren Feldern bis Kinetik Messungen für 15-30 Zellen gewonnen werden. Wiederholen Sie die Experimente mindestens 3 Mal in biologischer Replikate, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Rekrutierung Kinetik zu gewährleisten.
    Hinweis: Wenn dieses Protokoll zu einem bestimmten konfokale System anzupassen, es möglicherweise sinnvoll, durch die Überwachung der Rekrutierung Kinetics von einem bekannten Fluoreszent-Label Genom Wartungsfaktor beginnen (z. B., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). Mit live-Imaging zur Mikro-Bestrahlungsbedingungen Optimierung ermöglicht dem Benutzer, schnell mehrere Parameter zu testen.

4. Einstellung Kinetik Analyse

  1. Installieren Sie die Microirradiation Analyse Plugin10 in Fidschi Bild Analyse Software11.
  2. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in Fidschi. Wählen Sie "The Schaden Analyzer" aus dem Pulldown-Plugins-Menü in der Microirradiation Analyse-Suite. Folgen Sie die Anweisungen, um eine Hintergrund-Region von Interest (ROI) (in der Regel 3 x 3 µm) und nicht bestrahlt und bestrahlten ROIs in jeder Mikro-bestrahlten Zelle definieren.
    1. Verwendung ROIs gleicher Größe zu minimieren mögliche Verzerrungen in meine Signalintensitäten. Gehören Sie für importierte Bilder auch mindestens ein Pre-Bestrahlung-Frame die Rekrutierung an Mikro-bestrahlten Standorten zu überwachen als Grundlage verwendet werden.
    2. Sobald alle Daten der ROI über die volle Zeitraffer Serie gesammelt wurden, speichern Sie die Datei durch das Plugin enthält die Ergebnisse als Csv (Komma getrennte Datei) oder Txt Datei (Registerkarte "getrennt") erstellt. Diese Datei enthält die Messungen der mittleren Intensität für jeden Zeitpunkt und jeden ROI (meine Intensität Hintergrund, meine Intensität nicht bestrahlt, und meine Intensität bestrahlt).
      Hinweis: Das Plugin automatisch subtrahiert die Hintergrundintensität (ichb) von der Intensität des bestrahlten ROIs (ichs) und die nicht bestrahlten ROIs (ichn). Es berechnet auch ein Verhältnis zwischen beiden Werten (siehe die folgende Formel) um für Immunofluoreszenz (Irradiated/Non-bestrahlt) zu korrigieren.
      figure-protocol-1
      Das Plugin auch berechnet eine Normalisierung zwischen den ersten Zeitpunkt (Wert auf 1 gesetzt) und all den anderen Zeitpunkten für jeden Kern (Verhältnis relativ zum ersten Zeitpunkt). Weitere Informationen finden auf der Plugin-Webseite-10.
  3. Führen Sie die Analyse mit dem Plugin für alle Mikro-bestrahlten Zellen (mindestens 15 – 30) und darstellen Sie die mittlere relative Anreicherung am Mikro bestrahlten Regionen im Laufe der Zeit grafisch. Berechnen Sie die Standardfehler des Mittelwerts für jeden Punkt und Plotten sie.
    1. Bestätigen Sie Unterschiede in der Einstellung Kinetik zwischen zwei Versuchsbedingungen durch Ausführen des Schülers t-Tests für jeden Datenpunkt.

5. wenn Protokoll

  1. Bereiten Sie IF Lösungen. Pre/post-extraction Lösung vorbereiten (eiskalte 1 X PBS mit 0,25 % Triton x-100), Waschlösung (1 X PBS mit 0,05 % Tween-20), blockiert Lösung (1 X PBS mit 3 % BSA und 0,05 % Tween-20), und Fixierung Lösung (Paraformaldehyd 3 % + 2 % Saccharose mit PBS-Puffer 1 X) in konischen Polypropylenröhrchen.
    Hinweis: Für eine einzelne 8-Brunnen-Objektträger werden 10 mL Pre/post-extraction-Lösung, 50 mL Lösung, blockierende Lösung 10 mL und 5 mL der Lösung Fixierung zu waschen benötigt.
    1. Bereiten Sie die Fixierung-Lösung.
      1. Unter einer chemischen Haube mix 400 mL bidestilliertem Wasser (DdH2O) mit 15 g Paraformaldehyd und 30 µL 10 N NaOH in einem 1 L-Erlenmeyer-Kolben.
      2. Schließen Sie die Container und Wärme bei 65 ° C auf einer Herdplatte Magnetrührer unter Rühren auf die Paraformaldehyd vollständig zu lösen.
      3. Mit einer 25-mL-Pipette, 50 mL 10 X PBS, rühren und mit einem 0,45 µm-Filter Filter hinzugeben.
      4. 10 g Saccharose und komplett bis 500 mL mit DdH2O.
      5. Aliquoten die Lösung 15 mL konische Röhrchen; bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
    2. Bereiten Sie die Kerne Färbelösung durch Verdünnung der Stammlösung von 1 mg/mL von 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) 1:1,000 mit 1 X PBS-Puffer.
  2. Mit einer Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig die Medien aus den Brunnen des Multi-gut Mikroskopie Folien oder Platten und sofort waschen mit 500 µL IF Waschlösung durch Ändern der Lösung zweimal ohne lange Wartezeiten.
    Hinweis: Die hier vorgestellten Daten IF wurden unter Verwendung von Zellen, die in 8-Brunnen-Mikroskopie-Folien, die gewaschen und in 500 µL aller Lösungen inkubiert wurden angebaut. Mengen sollten je nach verwendeten von Experimentatoren Zelle-Kultur-Behälter angepasst werden. Darüber hinaus führen Sie die IF-Protokoll mit äußerster Sorgfalt wie Zellen aus Glas/Kunststoff unten leicht lösen können. Verwenden einer Mikropipette für alle Lösung Änderungen Zellverlust zu minimieren.
  3. Inkubation auf Eis für 5 min mit 500 µL des eiskalten wenn Pre/post-extraction Lösung und Wirbel sanft mit der Hand für 15-30 s vor Extraktion durchführen, die Schritt die meisten zytoplasmatischen und nucleoplasmic Proteine entfernt und das Signal von Chromatin maximiert / DNA-assoziierte Faktoren.
  4. Zweimal mit 500 µL IF Waschlösung abwaschen.
  5. 15 min bei Raumtemperatur in 500 µL IF Fixierung Lösung inkubieren. Alternativ können Sie eine vorgefertigte Paraformaldehyd-Lösung (3 – 4 %) für die Fixierung Schritt.
  6. Zweimal mit 500 µL IF Waschlösung abwaschen.
  7. Brüten auf Eis für 5 min in 500 µL eiskalte IF Pre/post-extraction Lösung und schwenken Sie die Folie vorsichtig von Hand um die Permeabilisierung Schritt auszuführen.
  8. Zweimal mit 500 µL IF Waschlösung abwaschen.
  9. Inkubieren Sie mindestens 30 min bei Raumtemperatur mit 500 µL IF blockierende Lösung.
  10. Entfernen Sie blockierende Lösung mittels einer Mikropipette und inkubieren Sie über Nacht in eine feuchte Kammer bei 4 ° C mit 250 µL Primärantikörper in blocking-Lösung verdünnt.
    Hinweis: Es empfiehlt sich, führen Sie die Inkubation mit primären Antikörper gegenüber dem Vorquartal um mögliche Artefakte der Co Lokalisierung zu vermeiden. Sobald entsprechende Kontrollen durchgeführt wurden, inkubieren Sie gleichzeitig Primärantikörper um den Prozess zu beschleunigen.
  11. Vier Mal für 5 min in 500 µL IF Waschlösung mit sanften Agitation (60 Rpms auf ein Rotator) waschen.
  12. 1 h bei 37 ° C mit 250 µL Sekundärantikörper verdünnt in blockierende Lösung in eine feuchte Kammer inkubieren.
    Hinweis: Schützen Sie die Proben vor Licht auf Zugabe von Eindringmittel-markierten Sekundärantikörper.
  13. Waschen Sie vier Mal jeweils für 5 min in 500 µL IF Waschlösung mit sanften Agitation.
  14. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min in 500 µL 1 X PBS mit 1 µg/mL DAPI, Kerne zu beflecken.
  15. Zweimal mit 500 µL 1 X PBS waschen Sie und lassen Sie Zellen in 500 µL 1 x PBS-Lösung für die Bildgebung.
  16. Mit gerasterten Folien oder registrierte Bühne Positionen, finden die Mikro-bestrahlten Zellen mit einem gut charakterisierten DNA-Schäden-Marker (z.B., γ-H2A.X, RPA32, etc.).
  17. Bild der Multi-gut Kultur Folien oder Platten in alle relevanten Kanäle mit den entsprechenden Einstellungen am konfokale Laserscanning-Mikroskop.
    Hinweis: Auf dem vorgestellten System die Bildgebung erfolgte mit einem 63 X / 1,4 Öl-Objektive verwenden eine Verweilzeit 8 µs/Pixel, Auflösung 1.024 x 1.024, 1 X Zoom und Mittelung der 2. Beachten Sie, dass diese Parameter müssen für andere Systeme und/oder verschiedenen Experimenten optimiert werden können.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Nach Mikro-Bestrahlung dürfen Zellen für einen bestimmten Zeitraum abhängig von der Art des Genoms Wartung Proteine1,12zu erholen. DSB werden bearbeitet von Nukleasen, weitgehend in den S und G2-Phasen des Zellzyklus, eine begrenzte Region SsDNA erstellen, die schnell von RPA und andere Genom Wartung Faktoren9beschichtet ist. SsDNA Region ist umgeben von Chromatin, die ausgiebig in der DDR, die Rekrutierung...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Verwenden die oben beschriebenen Methoden, ermöglicht 405 nm Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen mit BBET oder BrdU bereits sensibilisiert die lokalisierte Erzeugung von DNA-Läsionen einschließlich der DSB in den Kernen der anhaftende menschliche Zellen. Kinetik der DDR bei diesen DSB ähneln denen generiert mit anderen Methoden in eukaryotischen Zellen9,18,19. DSB-Resektion an Mikro-bestrahlten Standorten führt zu SsDNA-Generatio...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada [Discovery Grant 5026 bis Uhr] und eine nächste Generation von Wissenschaftlern Stipendium von der Cancer Research Society [21531 bis Uhr] unterstützt. Wir danken Jean-François Lucier bietet hervorragende Qualitätskontrolle der Fidschi-Python-Skripten und Ratschläge zur statistischen Analyse. Wir danken Dr. Stephanie A. Yazinski für IF Fixierung Lösung Rezept. Wir danken Paul-Ludovic Karsenti für Hilfe bei Lasermessungen macht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Olympus FLUOVIEW FV3000 konfokales Resonanzlaser-Scanning-MikroskopOlympus
FluoView FV3000 Software (Version 2.1)Olympus
405 nm LaserKohärenteStrahlungsquelle
Mikroskop Inkubator AIO-UNO-OLYUS-1OkolabOKO-UNO-1
60X /1.4 ObjektivOlympusÖl Immersionsobjektiv
8-Well-Kulturobjektträger auf Deckglas (X-Well)Sarstedt94.6190.802
U2OS-Osteosarkom humane ZelllinieATCCHTB-96Stabile Zelllinien 
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)ThermoFisherD1306Achtung toxisches
5-Brom-2′-Desoxyuridin ( BrdU) Sigma-Aldrich59-14-3
ParaformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4Achtung toxisches
Bisbenzimid H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
Rinderserumalbumin (BSA)ThermoFisherBP1600-100
Trypsin EDTA 0,1% ThermoFisher15400-054
Triton X-100 BioShopTRX777.100
Tween-20 ThermoFisherBP337-500
Saccharose BioShopSUC507
JetPRIME Transfektionsreagenz Polyplus114-07
ProLong Diamond Eindeckmittel mit DAPI ThermoFisherP36962
DMEM 1X, + phenolrotWisent 319-005-CL
DMEM 1X, - phenolrotWisent319-051-CL
Fötales Rinderserum (FBS)Wisent 080-150
Maus anti-RPA32 AntikörperAbcamab21751:500 für IF
Kaninchen anti-& gamma;-H2A. X AntikörperZell-Signalgebung 9718S1:500 für IF
Kaninchen Anti-53BP1 AntikörperZellsignalisierung 4937S1:500 für IF
Kaninchen Anti-PRP19 AntikörperAbcamab276921:500 für IF
Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 647Cell Signaling 4414S1:250 für IF
Ziege Anti-Maus  IgG Alexa Fluor 488 Signalübertragung der Zellen 4408S1:250 für IF
Fidschi Bildanalyse-Open-Source-Software https://fiji.sc
1918-K Leistungsmesser mit 918D-SL-0D3 SensorNewport

Referenzen

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237(2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

DNA-SchadensantwortKonfokalmikroskopieHiston H2AXReplication Protein AImageJ-AnalyseFRAP-ModulImmunfluoreszenz-Protokoll
Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.