Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.
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Methodenartikel
Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.
Einleitung
Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.
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Protokoll
Alle tierische Verfahren wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle und Animal Care Committee von der University of South Alabama und wurden in Übereinstimmung mit allen Bundes-, Landes- und lokalen Vorschriften durchgeführt. Primärkulturen von Ratte pulmonalen mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) wurden von der Zelle Kultur Core Facility der University of South Alabama Center für Lunge Biologie erhalten. Zellen wurden mit der zuvor beschriebenen Verfahren16zubereitet.
1. Generation von zytotoxischen Überstände
Hinweis: Hier verwenden wir zwei verschiedene Stämme von p. A....
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Ergebnisse
Eine einfache in-vitro- Test wurde entwickelt, um auf das Vorhandensein von Zellgiften in Überstände von Zellen infiziert mit dem Bakterium p. Aeruginosaassay. Grundsätzlich Kulturmedium aus infizierten Zellen ist 4 h nach bakteriellen Zugabe gesammelt, die Bakterien werden durch Filter Sterilisation der Überstand Kultur entfernt und dann der sterile Überstand wird hinzugefügt, um eine neue Population von Zellen. Die Zellen sind dann 21-24 h nach der Zugabe des Überstand.......
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Diskussion
Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und
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Offenlegungen
Nichts zu berichten.
Danksagungen
Diese Forschung wurde in Teilen von NIH-Stipendien HL66299 TS, RB und SL, HL60024, TS und HL136869 MF finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kaninchen Anti-Beta-Amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 Amyloid-Oligomer-Antikörper | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 Anti-Tau-Oligomer-Antikörper | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0,22 Mikron Spritzenvorsatzfilter | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Ziegen-Antikaninchen IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Stämme PA103 und Δ PcrV | Diese Stämme von P. aeruginosa wurden von Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia | Lektin Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia | Lektin Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0,22 Mikron Nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | gewonnen |
| Kollagenase Typ 2 | Worthington | LS004176 | |
| Fötales Rinderserum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Dinatriumsalz | Sigma | C1389 | |
| Mikrozedrifugationskonzentratoren - 10.000 MW Cutoff-Gehalt | Millipore | UFC801008 | |
| Kaliumphosphat zweibasisch | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesiumphosphat-Heptahydrat | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Zitronensäure | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automatisierter Zellzähler | Invitrogen | C10277 |
Referenzen
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
