Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

8.8K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/57448

⸱

26. April 2018

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

Zusammenfassung

Tumorigenität ist die Fähigkeit von Krebszellen, einen Tumor bilden Masse. Ein weit verbreiteter Ansatz um festzustellen, ob die Zellen tumorigenic sind wird durch Injektion immungeschwächte Mäuse subkutan mit Krebszellen und die Tumor-Masse zu messen, nachdem es sichtbar und fühlbar wird. Orthotopen Injektionen von Krebszellen sollen die Xenograft in der Mikroumgebung einzuführen, die am ehesten des Gewebes von Ursprung des Tumors untersucht. Gehirn-Krebs-Forschung erfordert intrakraniellen Krebszellen die Tumorbildung und Analyse in der einzigartigen Mikroumgebung des Gehirns zu ermöglichen. Die in-Vivo -Darstellung der intrakraniellen Xenotransplantate überwacht augenblicklich die Tumor-Masse des Orthotopically pfropfte Mäuse. Hier berichten wir über die Verwendung von Fluoreszenz Molekulare Computertomographie (FMT) von Gehirn Tumor Xenografts. Die Krebszellen sind zunächst mit ausgestrahlt, in der Nähe von Infrarot-fluoreszierende Proteine und dann in das Gehirn des immungeschwächte Mäuse injiziert. Die Tiere werden dann gescannt, um quantitative Informationen über die Tumor-Masse über einen längeren Zeitraum hinweg zu erhalten. Zelle vor Kennzeichnung ermöglicht eine kostengünstige, reproduzierbare und zuverlässige Quantifizierung der tumorlast innerhalb jeder Maus. Wir eliminiert die Notwendigkeit für die Injektion bildgebenden Substrate und reduziert den Stress auf die Tiere. Eine Einschränkung dieses Ansatzes wird durch die Unfähigkeit, sehr kleine Massen erkennen dargestellt; Allerdings hat es besseren Auflösung für größere Massen als andere Techniken. Es kann angewendet werden, um die Wirksamkeit einer medikamentösen Behandlung oder genetische Veränderungen von Gliom-Zell-Linien und Patienten stammenden Proben zu bewerten.

Einleitung

Krebs ist eine der führenden Ursachen für krankheitsbedingte Todesfälle beim Menschen in der industrialisierten Welt. Mit einer extrem hohen Todesopfer sind neue Behandlungen dringend erforderlich. Glioblastoma Multiforme (GBM) ist eine extrem tödliche Art von Hirntumoren, bestehend aus heterogenen Bevölkerung von Gehirn, Stromale und immun Tumorzellen. Laut der zentralen Gehirn Tumor Registrierung der USA ist die Inzidenz des primären malignen und nicht-malignen Hirntumoren etwa 22 Fälle pro 100.000. Rund 11.000 Neuerkrankungen werden voraussichtlich in den USA im Jahr 20171diagnostiziert werden.

Präklinische Studie....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Experimentelle forschungstiere und Krankheitserreger, wie z. B. Lentivirus, die Krebszellen transduzieren benötigen Zustimmung vom institutionellen Tierbetreuung Programm und der institutionellen Biosafety-Ausschuss. Dieses Protokoll erfolgt nach den Richtlinien der Pflege der Tiere von der University of California San Diego (UCSD).

1. Kennzeichnung von Glioblastom-Zellen mit FP635 oder FP720 Konstrukt

  1. Zu produzieren Sie und zu reinigen Sie Lentivirus gemäß dem Protokoll von Tiscornia Et Al. beschrieben 12
  2. Kultur ca. 2,0 x 106 Zellen aus einer menschlichen Gliom-Zelllinie mit ....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Glioblastom-Zellen U87EGFRvIII (U87 Zellen zum Ausdruck über der EGF-Rezeptor-Variante III) wurden nach dem Schritt 1.2 kultiviert. Lentivirus wurde produziert und gemäß Schritt 1.1 gereinigt. Die virale Konzentration von p24 bestimmt war ELISA Analyse. Zellen wurden mit Lentivirus mit Infrarot-fluoreszierende Proteine nach Schritt 1,8 ausgestrahlt. Das Plasmid FP72010,11 -Codierung wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt v.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Tumor Xenografts haben ausgiebig in der Krebsforschung verwendet worden und eine Reihe von etablierten bildgebenden Verfahren entwickelt: BLI; Magnetresonanztomographie (MRT); Positronen-Emissions-Tomographie (PET), berechnet Computertomographie (CT); FMT. Jeder dieser Ansätze kommt mit vor- und Nachteile, aber letztlich ergänzen sich mit der Art der bereitgestellten Informationen. Eines der am häufigsten verwendeten in-Vivo imaging-Technologie ist BLI5,6

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center für GBM-PDX neurosphären. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Niederlage GBM Forschung Collaborative, eine Tochtergesellschaft von National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez wurde durch eine Auszeichnung von American Brain Tumor Association (ABTA) unterstützt; Ciro Zanca wurde teilweise durch eine amerikanisch-italienischen Cancer Foundation Postdoc Fellowship unterstützt. Frank Furnari erhält Gehalt und zusätzliche Unterstützung von Ludwig Institute for Cancer Research.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM/Hoher Glukose HyClone/GESH30022.1
DMEM/F12 1:1 Gibco11320-082
FBSHyClone/GESH30071.03
AccutaseInnovative ZelltechnologienAT-104
TrypsinHyClone/GESH30236.01
B27 SupplementGibco17504044
humane rekombinante EGF Stemcell Technologies2633
humane rekombinante FGFStemcell Technologies2634
DPBSCorning21-031-00
FACS-RöhrchenFalcon352235
DAPIThermoFisher Scientific62248
BlasticidinThermoFisher ScientificA1113903
p24 ELISA Clontech632200
XylazinAkornNDC 59399-110-20
KetaminZoetisNADA 043-403Kontrollierte Substanz
SalbeDechronNDC 17033-211-38
Resorbierbares NahtmaterialCpMedicalVQ392
5 ul SpritzeHamilton26200-UKatalognummer wie verkauft von Sigma-Aldrich
Cell SorterSonySH8007
Maus stereotaktischer Rahmen Stoelting51730
Motorisierter stereotaktischer InjektorStoelting53311
Mikromotorischer HandbohrerForedomK1070
Maus-Wärmekissen Ken Scientific CorporationTP-22G
Fluoreszenztomographie-System PerkinElmerFMT 2500 XL
TrueQuant Imaging-Software Perkin Elmer 
Ultra-Zentrifuge Optima L-80 XPBeckman Schar392049
Gewebekultur 100 mmSchalen Olympus Plastics25-202
Gewebekultur 150 mm SchalenOlympus Plastics25-203
Gewebekulturkolben T75Corning430720U
50 mL konische RöhrchenCorning430290
15 mL konische RöhrchenOlympus Plastics28-101
Zentrifuge Avanti J-20Beckman CoulterJ320XP-IM-5
Röhrchen, Polypropylen, dünnwandig, 5,0 mLBeckman Coulter326819
Röhrchen, dünnwandig, Polypropylen, 38,5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter326823
Athymic NacktmäuseCharles River LaboratoriesDehnungs-Code  490 (homozygot)Vorherige Genehmigung durch das Institutional Animal Care Program und das Institutional Biosafety Committee erforderlich.    
7005319

Referenzen

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
  2. Pauli, C., et al.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

ZelltransduktionDurchflusszytometrie-Sortingintrakranielle InjektionTumorüberwachungNahinfrarot-Proteineimmundefiziente MäusePrüfung der Arzneimittelwirksamkeit