Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Zusammenfassung

Inflammasomes sind angeborene immun Signalisierung Plattformen, die für die erfolgreiche Bekämpfung vieler pathogenen Organismen sind erforderlich, sondern auch fördern entzündliche und Autoimmun-Krankheiten. Inflammasomes werden durch cytosolische Muster Anerkennung Rezeptoren, einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder aktiviert. Diese Rezeptoren oligomerize auf den Nachweis der mikrobiellen oder Schäden verbundenen Reize. Nachträgliche Einstellung des Adapter-Proteins ASC bildet eine mikroskopisch sichtbaren Inflammasome Komplex, die Caspase-1 durch Nähe-induzierte Auto-Aktivierung aktiviert. Nach der Aktivierung spaltet Caspase-1 Pro-IL-1β und Pro-IL-18, zur Aktivierung und Sekretion dieser Pro-inflammatorische Zytokine. Caspase-1 vermittelt auch entzündliche Form des Zelltods bezeichnet Pyroptosis, verfügt über den Verlust der Membran Integrität und Zell-Lyse. Caspase-1 spaltet Gasdermin D, die N-terminale Fragment, das Plasmamembran Poren bildet die Freigabe zu osmotische Lyse.

In Vitro, die Aktivierung von Caspase-1 kann durch Knochenmark stammenden Makrophagen mit der Caspase-1 Aktivität Sonde FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und Etikettierung der Zellen mit Antikörpern gegen das Adapter-Protein ASC ermittelt werden. Diese Technik ermöglicht die Identifikation von Inflammasome Bildung und Aktivierung der Caspase-1 in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Pyroptotic Zelltod kann durch Messung der Veröffentlichung der cytosolischen Laktat-Dehydrogenase in das Medium erkannt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und in einer 96-Well-Platte-Format, so dass die Anpassung für das Screening durchgeführt. In dieser Handschrift zeigen wir, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome von Nigericin bis zur Co Lokalisierung der Adapter Protein ASC und aktive Caspase-1, führt zu Pyroptosis.

Einleitung

Inflammasome-vermittelte Entzündung zugrunde liegt auch die Ursache von vielen Krankheiten²ist ein wesentlicher Bestandteil der Abwehr pathogener Organismen¹ Die entzündliche Reaktion auf eine Vielzahl von Infektionen ausgelöst durch cytosolische Nachweis des Erregers verbunden molekulare Muster (PAMPs) oder Schäden verbunden molekulare Muster (DAMPs). Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRR), einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder oligomerize auf den Nachweis dieser PAMPs und DAMPs. Dies löst die Bildung eines Multi-Protein-Komplex bezeichnet die Inflammasome, die die PRR, Adapter Protein Ap....

Protokoll

Alle tierische Verfahren geprüft und bei der Universität von Washington institutionelle Animal Care und Use Committee Richtlinien durchgeführt.

(1) die Ernte des Knochenmarks

1. Aseptisch Femur und Tibia aus einer Maus herausnehmen und Reinigen der Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamicin Sulfat + 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin + 10 % fetalen bovine Serum (FBS, DMEM-10 komplette) und inkubieren Sie die Rohr für 15 min auf Eis.
2. Entfernen Sie die proximalen und distale....

Ergebnisse

Um Caspase-1 Aktivierung nach der Exposition gegenüber Nigericin zu erkennen, wurden die Zellen verarbeitet, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Wir kombinierten FAM-YVAD-FMK und ASC Etikettieren Antikörper um zu zeigen, dass ASC und aktive Caspase-1 Co lokalisieren nach Aktivierung des NLRP3-vermittelten Inflammasome. Abbildung 1A zeigt, dass Wildtyp Makrophagen ausgesetzt 5 μM Nigericin Bildung von einer ASC-Fokus in der perinukleären Region. Diese Schw.......

Diskussion

In dieser Handschrift haben wir zwei Techniken untersuchen Inflammasome Aktivierung und die Folge der Aktivierung der Caspase-1 nach NLRP3 Stimulation in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet vorgestellt. Die erste Technik ermöglicht den Forscher, die Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis mit fluoreszierenden Reporter FAM-YVAD-FMK bestimmen. Dieser Reporter ist hochspezifisch für die Bindung der Caspase-1-Familie von Enzymen, wie durch das Fehlen der Färbung in Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen gese.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
E-MEM	ATCC	30-2003	Für die Züchtung von L929-Zellen
NCRC-Klon 929 (L929)	ATCC	CCL-1
Fixierungs-/Permeabilisierungskit	BD Biosciences	554714	Enthält Fixierungs- und Permeabilisierungslösung sowie Waschpuffer. Proprietäre Formulierungen. Enthält 4,2 % Formaldehyd
Glycin,	Biorad	161-0718
Cytotox96, nicht-radioaktiver Zytotoxizitätsassay	Fisher Scientific	PR-G1780	Enthält eine Substratmischung und einen Assay-Puffer; Proprietäre Formulierungen. Stopplösung ist 1 M Essigsäure
FAM-YVAD-FMK	Immunocytochemistry Technologies	98
DMEM, hohe Glukose, kein Glutamin	Invitrogen	11960044
DMEM, hohe Glukose, kein Glutamin, kein Phenolrot	Invitrogen	31053028
Dulbecco's PBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Invitrogen	14190144
fötales Rinderserum, qualifiziert,	Invitrogen	26140079	inaktiviert bei 55°; C für 50 min
Gentamicin	Invitrogen	15750060
ProLong Gold Eindeckmedium	Invitrogen	p36934	Proprietäre Formulierung. Aushärtendes Einbettmedium. Härtet gegen den Refraktärindex von 1,46
Ziegen-Anti-Maus-ALEXA555	Invitrogen	A-21422
HEPES (Ultra Pure)	Invitrogen	11344041
L-Glutamin	Invitrogen	21051024
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
TO-PRO-3 Iodid	Invitrogen	T3605	dunkelrot fluoreszierend Nukleinsäure-Färbung
C57BL/6J Maus	Jackson Laboratoy	000664
Caspase-1/11-/- Maus	Jackson Laboratory	016621
Leica SP8X Konfokalmikroskop	Leica
Ultrapure LPS aus Salmonella minnesota R595 (Re)	List Biologicals	434
Anti-ASC Klon 2EI-7	Millipore-Sigma	04-417
Beta-Mercapto-Ethanol	Millipore-Sigma	M6250-10ML
DMSO	Millipore-Sigma	D2650-5X10ML
EDTA	Millipore-Sigma	E5391
Spectramax M3 Plattenleser	Molecular Devices	5000414

, , aus den USA Hitze