Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

Die Retinotectal-Schaltung ist der Hauptbestandteil des Sehsystems Amphibien. Es umfasst die Routinggruppenconnectors im Auge, die ihre Axone, die optic Tectum Projekt wo sie synaptische Verbindungen mit tectal postsynaptischen Neuronen bilden. Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung ist ein beliebtes Entwicklungs Modell Untersuchung neuronaler Schaltkreis Bildung und Funktion. Es gibt viele Attribute dieser Kaulquappe Retinotectal Schaltung, die es ein leistungsfähiges experimentellen Modell^1,2,3machen. Ein wichtiges Attribut, und der Schwerpunkt dieses Artikels ist die Möglichkeit, ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen aus tectal Neuronen, in Vivo oder über eine ganze Gehirn Vorbereitung durchzuführen. Mit einem Elektrophysiologie Rigg ausgestattet mit einem Verstärker, der Spannung und Strom-Klemme Aufnahmemodi unterstützt, können ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen eines Neurons Elektrophysiologie bei hoher Auflösung charakterisiert werden. Infolgedessen haben ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen über die wichtigsten Phasen der Retinotectal Schaltung Bildung ein detailliertes und umfassendes Verständnis für die Entwicklung und Plastizität der intrinsischen^4,5 zur Verfügung gestellt ^{, 6 , 7} und synaptischen^8,9,10,11 Eigenschaften. Kombinieren ganze Zelle Patch Clamp tectal Neuron Aufnahmen, fördert die Möglichkeit, Gene oder Morpholinos Interesse an diesen Neuronen¹²und eine Methode, um visuelle Führung Verhalten über eine etablierte visuellen Vermeidung Test¹³ beurteilen die Identifizierung von Verbindungen zwischen Molekülen, Kreislauf-Funktion und Verhalten.

Es ist wichtig zu beachten, dass die hohe Auflösung, die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen gewonnenen Daten nicht mit neueren bildgebenden Ansätze wie die genetische Kalzium-Anzeige GCaMP6, da geht obwohl Kalzium Indikatoren mit die Bildgebung erlaubt von Calcium Dynamik über große Populationen von Neuronen gleichzeitig, es gibt keine direkte oder naheliegender Weise, dass die spezifischen elektrischen Parameter erhalten Sie durch die Messung der Fluoreszenz-Delta in den Somata, und es keine Möglichkeit, Spannung gibt Klemme das Neuron nach Maß Strom-Spannungs-Beziehungen. Klar, diese zwei unterschiedliche Ansätze, elektrophysiologische Aufnahmen und Kalzium Imaging, besitzen nicht überlappende stärken und erzeugen verschiedene Arten von Daten. Somit hängt der beste Ansatz von experimentellen konkret in Angriff genommen.

Hier beschreiben wir unsere Methode für den Erwerb der ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Neuronen der Kaulquappe optic Tectum mit einer in Vivo -Vorbereitung, ganze Gehirn Vorbereitung und eine neuere verändert ganze Gehirn-Vorbereitung, die in unserem Labor^{14 entwickelt wurde} . Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse zeigen wir die experimentelle Vorteile jeder Vorbereitung und die verschiedenen Arten von Daten, die abgerufen werden können. Die Grenzen und Stärken der verschiedenen Zubereitungen, sowie Tipps zur Fehlerbehebung, sind in die Diskussion Abschnitt enthalten.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Wyoming genehmigt. Alle Verfahren, einschließlich elektrophysiologische Aufnahmen erfolgt bei Zimmertemperatur ca. 23 ° C. Alle hier beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber¹⁵) optimiert.

1. in-Vivo -Vorbereitung

1. Die Kaulquappe zu betäuben.
   1. Legen Sie die Kaulquappe in eine kleine Petrischale mit Steinbergs Lösung mit 0,01 % MS-222 für ca. 5 Minuten.
      Hinweis: MS-222 aka "Tricaine" ist eine gemeinsame Fische und Amphibien Narkose. Die Kaulquappen sind aufgewachsen in der Steinberg-Lösung in mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca (NO₃)₂•4H₂O, 0.083 MgSO₄•7H₂O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
   2. Sicherstellen Sie, dass die Kaulquappe tief betäubt (nicht mehr reagiert und nicht mehr schwimmen) bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.
2. Sichern Sie den narkotisierten Kaulquappe zu einem versunkenen Silikon Block auf dem Boden der Schale sezieren/Aufnahme.
   1. Verwenden eine Einweg-Transferpipette narkotisierter Kaulquappe auf eine Dissektion/Aufnahme-Schale mit externen Aufzeichnungslösung verschieben (115 mM NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl₂, 3 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 1 mM Glukose; justieren pH bis 7,25 mit 10 N NaOH, Osmolarität 255 mOsm).
      1. Zur Minimierung von spontanen Muskel zuckt, Hinzufügen der Acetylcholin-Rezeptor-Blocker, Tubocurarin (100 µM), die externe Lösung. (In der Regel geschieht dies durch die Verwendung einer 200 µL Pipette 10 mL externe Lösung 100 µL einer 10 mM Tubocurarin Aktie hinzu).
   2. Mit Hilfe der Insekten Pins, sichern die Kaulquappe, Rückenseite, einem untergetauchten Block aus Silikon-Elastomer (z. B. Sylgard 184, siehe Materialtabelle für Details), die hat auf den sezierenden Gericht Boden geklebt worden.
      Hinweis: Die Platzierung der Pins ist kritisch: Legen Sie sie auf beiden Seiten des Gehirns, zu vermeiden, durchbohrt die afferenten RGC Axone ausreichend kaudalen dieses Projekt aus dem Auge und geben das Gehirn nur anterior optic Tectum (Abb. 1A).
3. Filet im Gehirn entlang der Mittellinie.
   1. Entfernen Sie für eine klare Sicht auf das Gehirn die Haut über das Gehirn durch einen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie mit einer sterilen Nadel 25 G.
   2. Filetieren Sie und das Gehirn entlang der gleichen Mittellinie Achse durch Einsetzen der Nadel in das Neuralrohr und ziehen sanft nach oben (dorsal) solche, die der dorsale Teil des Rohres sauber (abgetrennten) geschnitten wird beim Verlassen der Bodenplatte intakt (Abbildung 1B).
      Hinweis: Es ist wichtig, dass die Bodenplatte des Neuralrohrs intakt gelassen werden, weil die afferenten sensorischen Inputs über die Bodenplatte der Tectum eingeben.
4. Entfernen Sie die transparente ventrikuläre Membran, die die tectal Neuronen deckt.
   1. Bewegen Sie die Aufnahme Schale Elektrophysiologie-Rig und eine zerbrochenes Glas-Pipettenspitze, um ventrikuläre Membran darüberliegenden tectal Neuron Zelle stellen zu entfernen. Brechen Sie die Spitze von leicht über eine heikle Aufgabe Scheibenwischer ziehen.
   2. Schrauben Sie die Pipette in die Pipette Halterung und senken Sie es hinunter die optic Tectum über dem Mikromanipulator.
   3. Verwenden Sie die defekte Pipette um zu schälen die ventrikuläre Membran von der Tectum.
      Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Membran aus der gesamten Tectum entfernen; ein kleines Fenster wird genügen und den Zugriff auf viele Neuronen.
5. Erhalten Sie die gesamte Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen.
   Hinweis: Der Ansatz von diesem Punkt an ist ähnlich Durchführung ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Maus Gehirnscheiben beschriebenen Segev, Et al. ¹⁶ (Abbildung 1C).
6. Zeichnen Sie die tectal Neuron Antworten auf ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert.
   1. Um ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut zu projizieren, platzieren Sie eine Glasfaser neben der Kaulquappe Auge. Am anderen Ende der optischen Faser ist eine LED im Einklang mit einem Variablen Widerstand, der für die leichte Leuchtdichte kontrolliert werden kann. Auslöser der LED durch den digitalen Ausgang des Verstärkers. Auf diese Weise aufgezeichnet ganze Feld, das Lichtblitze unterschiedlicher Intensität des Lichts werden können (Abb. 4A).

2. ganzes Gehirn Vorbereitung

1. Führen Sie Schritte 1.1 bis 1.3.
   Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit für Tubocurarin in die externe Lösung für dieses Präparat.
2. Das Gehirn zu isolieren.
   1. Verwenden Sie eine 25-G-Nadel Hinterhirn (Abb. 2A) zu durchtrennen.
   2. Um das ganze Gehirn von der Kaulquappe zu isolieren, führen Sie die Nadel sanft unter das Gehirn in einer kaudalen, rostral Richtung alle lateralen und ventralen Bindegewebe und Nervenfasern zu durchtrennen.
3. Sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer.
   1. Sobald völlig befreit, sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer indem man eine Nadel durch eines der olfaktorischen Birnen und einem anderen Stift durch das Hinterhirn (Abbildung 2B). Dies ist die optimale Konfiguration für die Aufnahme von tectal Neuronen.
4. Verschieben Sie die Schale mit der fixierten ganze Gehirn Vorbereitung vom sezierenden Anwendungsbereich der Elektrophysiologie-Rig. Entfernen Sie die ventrikuläre Membran mit einer Pipette Glasscherben, wie unter Punkt 1.4 beschrieben.
5. Legen Sie eine bipolare Elektrode anregendste auf Optik Chiasmus (wo kreuzen die Axon-Traktate von jedem Auge im Mittelhirn) um die RGC Axone direkt zu aktivieren.
   1. Ort der bipolaren anregende Elektrode rostral und fast neben dem großen mittleren Ventrikel. Die Optik Chiasmus befindet sich unmittelbar rostral zum großen mittleren Ventrikel (Abbildung 2B).
      1. Senken Sie sanft die anregende Elektrode nach unten auf die Optik Chiasmus derart, dass eine kleine Delle im Gewebe gebildet wird. Die bipolare Elektrode treibt ein Puls-Stimulator ermöglicht die Stärke der Stimulation genau kontrolliert werden.
6. Führen Sie die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme (Abbildung 2C), wie durch Segev, Et Al. beschrieben ¹⁶

3. horizontale Gehirn Slice Vorbereitung

1. Führen Sie Schritte 2.1 bis 2.3.
2. Verwenden Sie eine Rasierklinge, Verbrauchsteuern am seitlichen viertes (welche in Vivo am dorsalen vierten entspricht) von einer Seite von einem optic Tectum. Dieser Schnitt erfolgt parallel zur rostral-kaudalen Ebene, wie in Abbildung 3dargestellt.
3. Neu pin das Gehirn auf die Seite der Silikon-Elastomer mit den in Scheiben geschnittenen Seite nach oben (so dass die Somata und Neuropil direkt für die Aufnahme zur Verfügung steht) und die ventrikuläre Oberfläche des Gehirns abgewandten des Silikon-Elastomer-Blocks (Abbildung 3 B) (so, dass eine bipolare Elektrode auf die Optik Chiasmus platziert werden kann).
4. Durchführen Sie die ganze Zelle Patch Clamp oder lokale eingereichten mögliche Aufzeichnung (Abb. 3C), wie beschrieben durch Segev, Et al. ¹⁶

Um Licht-evozierten Antworten zu erfassen ist ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert, während die resultierende Reaktion von einzelnen tectal Neuronen (Abb. 4A) erfasst wird. Dieses besondere Protokoll wurde entwickelt, um sowohl die Reaktion des Neurons, das Licht einschalten ("On" (Antwort) und dann ausschalten 15 Messen s später zu messen, die "Off-Antwort." Tectal Neuronen weisen in der Regel robuste ein- und Ausschalten Antworten (gezeigt hier aufgenommenen in Klammer Spannungsmodus, mit dem Neuron geklemmt, - 60mV, um synaptische Strom (Abbildung 4B) zu messen). Die Höhe der synaptischen Antrieb erhielt von jedem eine Nervenzelle kann durch spontane synaptische Ereignisse (Abb. 4C) quantifiziert werden. Strom-Spannungs-Beziehungen (Spannungs-Kurven) können aus der gleichen Neuron durch den Ausbau des Neurons, zunehmend depolarisiert Potentiale generiert und Aufzeichnung der resultierende Spannung aktiviert Na+ und K+ Strömungen, bezeichnet als "aktuelle gemischt Recordings"(Abbildung 4D, E). Es wurde gut etabliert, die für diese Amphibien Neuronen peak Na+ und K+ Ströme über gemischte aktuelle Aufnahmen quantifiziert werden können, weil der Gipfel nicht zeitlich miteinander4,7überschneiden.

Direkte Aktivierung der RGC Axone in die Optik Chiasmus umgeht alle vorgelagerten Berechnung und Verarbeitung von visuellen Reizen, die stattfinden im Auge und kann für das Studium der synaptischen Übertragung zwischen präsynaptischen RGC Axone und tectal postsynaptischen Neuronen in seiner die meisten reinen und reduzierter Form. Tectal Neuron Antworten auf RGC Aktivierung entstehen aus Routinggruppenconnectors angeregt durch Licht oder direkt über eine bipolare anregende Elektrode, bestehend aus zwei Komponenten: einer monosynaptischen Komponente (der synaptischen Direkteingabe von aktivierten Routinggruppenconnectors) und einen polysynaptischen Komponente (die wiederkehrenden Ortsnetz Aktivität Fütterung wieder auf das Neuron aufgenommen wird). Bei den leichten evozierten Antworten überschneiden sich die monosynaptischen und polysynaptischen Komponenten miteinander durch gewisse unbestimmbar. Diese zeitliche Überlappung begrenzt, was über synaptische Übertragung zwischen der Netzhaut und optic Tectum abgeschlossen werden kann. Mit eine Gesamt-Hirn-Vorbereitung und Aktivierung des RGC Axon Trakts direkt über eine Elektrode platziert auf der Optik Chiasmus (Abb. 5A), erzeugt jedoch ein Mono- und polysynaptische Komponente, die im Wesentlichen nicht-überlappende rechtzeitig. Die anregende Kraft der bipolare Elektrode kann eingestellt werden. Da die stimulierende Kraft erhöht wird, gibt es eine größere Anzahl von RGC Axone aktiviert (Abb. 5B). Eine minimale Stimulation Protokoll bestimmt die synaptische Stärke von einem einzelnen RGC Axon auf eine einzelne tectal Neuron; eine maximale Stimulation Protokoll spiegelt die Summe oder maximum, synaptische Input von allen die RGC Axone kombiniert (Abbildung 5C). Das richtige Verhältnis von exzitatorischen zu hemmenden Synapsen Eingang (E: Ich Verhältnis) erhielt von einer Einzelperson tectal Neuron ist entscheidend für die normale Sehfunktion18. Abbildung 5 D zeigt ein Beispiel der RGC-evozierten exzitatorischen und inhibitorischen aktuelle Spuren aufgezeichnet von einer einzelnen tectal Neuron. Die Wahrscheinlichkeit, dass der Sender-Veröffentlichung von RGC präsynaptischen Axon Terminals wird durch gekoppelte Puls Aufnahmen gemessen. Hierzu ist der postsynaptischen tectal Neuron in Klemme Spannungsmodus zu synaptischen Ströme zu messen, während die RGC Axone nacheinander aktiviert werden, getrennt durch ein Zeitintervall von 50 ms (Abbildung 5E) aufgezeichnet.

Ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen können von tectal Neuronen mit Wohnsitz in jeder somatischen Ebene durchgeführt werden. Ähnlich wie das ganze Gehirn Vorbereitung können RGC Axone aktiviert werden, indem man eine bipolare Aufnahme-Elektrode auf die Optik Chiasmus(Abbildung 6). Alle Aufnahmen in das ganze Gehirn Vorbereitung durchgeführt können auch mit dieser horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung durchgeführt werden. Abbildung 6 B zeigt eine Beispiel-Ablaufverfolgung aufgezeichnet von einem Neuron in der oberflächlichen Schicht RGC-evozierten Reaktion. Dieses Präparat ermöglicht auch das räumliche Muster der RGC synaptischen Eingang auf die tectal Dendriten gemessen werden. Hierzu werden Feld RGC-evozierten Potentiale erfasst jeden 10 µm entlang der Achse des Medial-laterale (d.h. der distalen proximalen Achse) der Neuropil (Abbildung 6C). Dies erzeugt eine hochauflösende Profil des Musters der funktionalen RGC-Eingang. Die Feld-Potenziale können dann in aktuellen Quelle dichten durch die Berechnung der zweiten räumliche Derivative14 umgewandelt werden und die aktuelle Quelle dichten können wiederum in einen Plot Bild umgewandelt werden. Das Bild-Grundstück in Abbildung 6C zeigt, dass die stärksten RGC-Eingabe mehr distalen Bereich der Neuropil richtet.

Abbildung 1. In vivo Vorbereitung Verfahren. (A) Kaulquappe festgenagelt auf ein Stück Silikon-Elastomer. Pins sind durch weiße Pfeile angedeutet. Beachten Sie, die mehr kaudalen Pin Positionierung zur Vermeidung von optischen Flächen durchbohrt. Die weiße gestrichelte Linie zeigt die Mittellinie. (B) Zoomed-Ansicht des gesamten Gehirns nach dem Schneiden entlang der dorsalen Mittellinie und überstehende Haut entfernen. (C) Whole-Cell Patch-Clamp Aufnahme in Vivo. (L: Lateral. M: Medial. R: Rostral. C: kaudalen. D: Dorsal. V: Ventral. OB: Riechkolben. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Gesamte Gehirn Vorbereitung Verfahren. (A) Nachdem das Gehirn entlang der Mittellinie, das Hinterhirn filetiert wird durchtrennt. (B) das gesamte Gehirn seziert und festgenagelt, die Silikon-Elastomer. Das weiße Sternchen zeigt die Nadel in der linken Riechkolben. Das rote Feld zeigt im mittlere Drittel der Tectum, d. h., der Zielbereich für die Aufnahme. (C) ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme mit Gesamt-Hirn Vorbereitung. Der schwarze Stern gibt die Fläche der UN-geschabt ventrikuläre Membran wo Zellen für die Aufnahme nicht zugegriffen werden kann. Wo die Membran erfolgreich entfernt wurde, erscheinen die Somata deutliche und definiert. Der Pfeil zeigt eine ungesunde Neuron. (PZ: Proliferative Zone. LMV: Große mediale Ventrikel. OB: Riechkolben. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn. L: Lateral. M: Medial. R: Rostral. C: kaudalen. D: Dorsal. V: Ventral). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . Horizontale Gehirn Slice Vorbereitung Verfahren. (A) die meisten seitlichen Teil des einseitig die optic Tectum wird werden in Scheiben geschnitten (angegeben durch die gestrichelte Linie) nach der Gesamt-Hirn Zubereitung. (B) horizontale Gehirn Slice Vorbereitung nachdem er festgenagelt an der Seite des Silikon-Elastomer. Doppelte weiße Linien repräsentieren eine anregende Elektrode platziert auf der Optik Chiasmus. (C) Zoomed-Ansicht der Soma Schichten und Neuropil mit einer horizontalen Gehirn Slice Zubereitung. Gestrichelte Kurve zeigt die Grenze zwischen Soma Schichten und Neuropil. Diese Zahl wurde von Hamodi, Et Al. modifiziert 14 (L: Lateral. M: Medial. R: Rostral. C: kaudalen. D: Dorsal. V: Ventral. OB: Riechkolben. OC: Optik Chiasmus. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . Aufnahmen aus einem in-Vivo -Vorbereitung. (A) Schaltplan zeigt die typische Konfiguration einer in-Vivo -Aufnahme. (B) Licht hervorgerufen Reaktionen einschließlich Licht an und Licht aus Antworten. Inset Spuren sind vergrößerte Ansicht der auf - und ab-Response, beziehungsweise. (C) spontane exzitatorischen postsynaptischen Ströme aufgenommen. (D) Na+ und K+ Strömungen in Reaktion auf Spannung Klemme Schritte von-60 mV bis 30 mV aus ein einzelnes Neuron. (E) IV Grundstücke aus Spuren in (D) generiert. Alle Aufnahmen erfolgten mit der Neuron statt bei-60 mV außer in (D) zum Generieren von IV-Grundstücke; Neuronen sind trat an zunehmend mehr depolarisiert Potenziale, in Schritten von 10 mV, spannungsabhängige Strömungen zu aktivieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 . Aufnahmen von einem ganzen Gehirn Vorbereitung. (A) Schaltplan zeigt die typische Konfiguration des Gesamt-Hirn Aufnahme einschließlich einer anregenden Elektrode platziert auf der Optik Chiasmus (grüne und rote Linien repräsentieren RGC Axone). (B) Überlagerung Spuren der RGC Reaktionen auf Änderungen der RGC Stimulation Stärke. (C) maximale Stimulation (links) und minimale Stimulation Antwort (rechts). (D) eine RGC-evozierten erregenden und hemmenden Antwort auf ein einzelnes Neuron. (E) Paired pulse Moderation der RGC-evozierten Reaktion einer einzelnen Nervenzelle. (OB: Riechkolben. OC: Optik Chiasmus. OT: Optic Tectum). Alle Aufnahmen erfolgten mit der Neuron statt bei-60 mV außer in (D) um die erregenden und hemmenden Eingänge zu messen: der exzitatorische Input wird durch das halten der Neuron das Umkehr-Potential der γ-Aminobuttersäure (GABA) aufgezeichnet-vermittelte Chlorid Strömungen (-45 Mv); die hemmenden Eingabe durch das Neuron auf das Potential der Umkehrung der α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA) halten-Ströme (+ 5 Mv) vermittelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 . Aufnahmen von einem horizontalen Gehirn schneiden Vorbereitung. (A) Schaltplan zeigt die Konfiguration einer horizontalen Gehirn Slice Zubereitung. Beachten Sie, dass obwohl die anregende Elektrode auf der Optik Chiasmus bleibt, die Aufnahme-Pipette ist nun Zugang Zellen über die tectal Ebenen ausgesetzt durch die horizontale Gehirn Slice Vorbereitung positioniert. (B) eine RGC Reaktion eines Neurons mit Wohnsitz in der oberflächlichen Schicht der Tectum. (C) Feld Potenziale über das Neuropil und die konvertierten aktuelle Quelle dichten (CSDs) zeigt Bild Plot Heatmaps aufgezeichnet. (OC: Optik Chiasmus. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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