Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.
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Methodenartikel
Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind die wichtigsten Zelle Quelle für zellbasierte Therapien. MSCs von Gelenkflüssigkeit Gelenk Hohlraum könnte für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe verwendet werden. MSCs von Gelenkflüssigkeit (SF-MSCs) sind viel versprechende Kandidaten für die artikuläre Regeneration betrachtet worden, und ihre möglichen therapeutische Nutzen hat sie ein wichtiges Forschungsthema des späten. SF-MSCs aus dem Knie Hohlraum der New Zealand white Kaninchen können als eine optimierte translationale Modell eingesetzt werden, menschliche regenerativen Medizin zu beurteilen. Mittels CD90-basierte magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (MACS) Technologien dieses Protokoll erfolgreich erhält Kaninchen SF-MSCs (RbSF-MSCs) von diesem Kaninchen-Modell und voll zeigt den MSC-Phänotyp dieser Zellen durch veranlassen, zu unterscheiden Adipozyten Osteoblasten und Chondrozyten. Daher kann dieser Ansatz in Zelle Biologie Forschung und Tissue Engineering mit einfachen Mitteln und Verfahren angewendet werden.
Einleitung
MSCs sind als wertvolle Quelle für die regenerative Medizin, speziell für Knorpel Läsionen vorgeschlagen worden. MSCs, einschließlich Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Skelett Myozyten und viszeralen Stromazellen Zellen erweitern im großen und ganzen die Bereiche für stammzelltransplantationen wegen ihrer hohen Ausdehnung Rate und Multi-Linie Differenzierung potenzielle1. MSCs können von den skelettartigen Muskel, Synovialis, dem Knochenmark und Fettgewebe2,3,4isoliert werden. Erkenntnisse haben auch bestätigte die Anwesenheit von MSCs in Gelenkf....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden entsprechend den regionalen Ethik-Kommission Leitlinien durchgeführt, und alle tierische Verfahren von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Shenzhen zweite Krankenhaus, Shenzhen-Universität angenommen wurden.
(1) isolieren und Kultur der RbSF-MSCs
-
Vorbereitungen für das Tier Verfahren
- Bereiten Sie skelettartig Reifen weiblichen Neuseeland weiße Kaninchen für die Sammlung von RbSF-MSCs Perform eine klinische Untersuchung der Kaninchen einen Tag vor Ablauf der Anästhesie und gelenkpunktion.
Hinweis: körperliche Untersuchungen gehören Gewicht (2,0-2,5 kg), ....
- Bereiten Sie skelettartig Reifen weiblichen Neuseeland weiße Kaninchen für die Sammlung von RbSF-MSCs Perform eine klinische Untersuchung der Kaninchen einen Tag vor Ablauf der Anästhesie und gelenkpunktion.
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Ergebnisse
Isolierung, Reinigung und Kultur der RbSF-MSCs:
Dieses Protokoll verwendet MACS, um RbSF-MSCs, basierend auf dem Ausdruck des MSC Oberfläche Markers CD90 zu isolieren. Ein Ablaufdiagramm RbSF-MSCs Isolierung, Charakterisierung, Reinigung, und die in-vitro- Kultur-Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
Zellmorphologie nach magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (.......
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Diskussion
Das Vorhandensein von MSCs in Gelenkflüssigkeit bietet eine Alternative für zellbasierte Therapien. Frühere Studien haben gezeigt, dass Verletzungen Websites höhere Mengen an mesenchymalen Stammzellen in die Gelenkflüssigkeit enthalten, die mit dem posttraumatischen Periode5positiv korreliert werden kann. Die MSCs in Gelenkflüssigkeit können Gewebe für die Verbesserung der spontanen Heilung nach einer Verletzung18,19hilfreich sein. Die kli.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Natural Science Foundation of China (Nr. 81572198; (Nr. 81772394); der Fonds für hohe Niveau medizinische Disziplin Bau von Shenzhen-Universität (Nr. 2016031638); die medizinische Forschung Grundlage der Guangdong Provinz, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschaft und Technologie-Projekte (No. JCYJ20170306092215436; Nein. JCYJ20170412150609690; Nein. JCYJ20170413161800287; Nein. SGLH20161209105517753; Nein. JCYJ20160301111338144).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 &de; C Wasserbad vor Gebrauch |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Bestandteil des MSCs-Kulturmediums |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs Differenzierungsmedium |
| Isotonische Kochsalzlösung | Litai, China | 5217080305 | Kavitätenarthrozenteseverfahren Reagenz |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, frei von Ca2+/Mg2+ |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Bestandteil des MSCs-Kulturmediums |
| Povidon-Jod-Lösung | Guangdong, China | 150605 | Sterilisationsmittel |
| 75 % Ethanol | Lircon, China | 170917 | Sterilisationsmittel |
| 0,25 % Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Reagenz für Zelldissoziation |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Bestandteil des MSC-Mediums |
| MACS Laufpuffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mMEDTA |
| CD90 Antikörper konjugierte MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | Für die magnetisch aktivierte Zellsortierung |
| Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | P2256 | Bestandteil von MSCs chondrogen Differenzierung |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D1756 | Bestandteil der osteogenen Differenzierung |
| von MSCs ITS | BD | 354352 | 1%, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs |
| L-Prolin | Sigma-Aldrich | P5607 | 0,35 mM, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs |
| L-Ascorbinsäure-2-phosphat | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin | Sigma-Aldrich | I5879 | 0,5 mM, Bestandteil der adipogenen Differenzierung |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Bestandteil der adipogenen Differenzierung |
| TGFβ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/ml, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs |
| α-Glycerophsphat | Sigma-Aldrich | G6751 | Bestandteil der osteogenen Differenzierung von MSCs |
| CD34 Polyklonaler Antikörper, FITC konjugierter | Bioss | bs-0646R-FITC | Marker für hämatopoetische Stammzellen |
| Antikaninchen-CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1-Membran Glykoprotein (MSCs-Marker) |
| CD45 (monoklonaler Antikörper) | Bio-Rad | MCA808GA | Marker für hämatopoetische Stammzellen |
| CD105 Antikörper | Genetex | GTX11415 | MSCs-Marker |
| Isopropylalkohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Ausfällungen RNA-Extraktion organische Phasen |
| Trichlormethan | Wenge, China | 61553 | Extrakt Gesamt-RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolat Gesamt-RNA |
| SYBR grüner Mastermix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR-Test |
| cDNA-Synthesekit | Takara Bio, Japan | RR047A | Rückwärtstranskribiert auf komplementäre DNA |
| Alizarin Rot | Sigma-Aldrich | A5533 | Färbung von Calciumverbindungen |
| Toluidinblau | Sigma-Aldrich | 89640 | Färbung von Knorpelgewebe |
| Öl Rot O Lösung | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipidvakuolenfärbung |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | Für magnetisch aktivierte Zellsortierung |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | Für magnetisch aktivierte Zellsortierung |
| MS Säulen | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | Für die magnetisch aktivierte Zellsortierung |
| Zellsieb | FALCON Inc. | 352340 | 40 μ m Nylon |
| Hämozytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Zellzählung |
| Falcon 100 mm Schale | Corning | 353003 | Zellkulturschale |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraktions- und PCR |
| Zentrifugenröhrchen | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilisierte |
| Hochgeschwindigkeitszentrifuge | Eppendorf | 5804R | Zentrifugenzellen |
| Kohlendioxid-Zelle Inkubator | Thermo scientific | 3111 | Zellkultur |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative Polymerase-Kettenreaktion |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | 342975 | Zellanalysator |
| Pipettierer | Eppendorf | O25456F | Transfer der Flüssigkeit |
| Klonierungszylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolierung und Entnahme einzelner Zellkolonien |
| Sterile Injektionsspritze | Doppeltaube, China | 131010 | Arthrozentese-Verfahren |
| Kaninchenkäfig | Zhike, China | ZC-TGD | Fixieren Sie das Kaninchen |
Referenzen
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
