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Methodenartikel

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

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DOI:

10.3791/57466

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10. August 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Postgraduate institution, Guangzhou Medical University, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, 3Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopaedic Engineering, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 4Department of Chemistry, Chinese University of Hong Kong, 5Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.

Zusammenfassung

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind die wichtigsten Zelle Quelle für zellbasierte Therapien. MSCs von Gelenkflüssigkeit Gelenk Hohlraum könnte für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe verwendet werden. MSCs von Gelenkflüssigkeit (SF-MSCs) sind viel versprechende Kandidaten für die artikuläre Regeneration betrachtet worden, und ihre möglichen therapeutische Nutzen hat sie ein wichtiges Forschungsthema des späten. SF-MSCs aus dem Knie Hohlraum der New Zealand white Kaninchen können als eine optimierte translationale Modell eingesetzt werden, menschliche regenerativen Medizin zu beurteilen. Mittels CD90-basierte magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (MACS) Technologien dieses Protokoll erfolgreich erhält Kaninchen SF-MSCs (RbSF-MSCs) von diesem Kaninchen-Modell und voll zeigt den MSC-Phänotyp dieser Zellen durch veranlassen, zu unterscheiden Adipozyten Osteoblasten und Chondrozyten. Daher kann dieser Ansatz in Zelle Biologie Forschung und Tissue Engineering mit einfachen Mitteln und Verfahren angewendet werden.

Einleitung

MSCs sind als wertvolle Quelle für die regenerative Medizin, speziell für Knorpel Läsionen vorgeschlagen worden. MSCs, einschließlich Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Skelett Myozyten und viszeralen Stromazellen Zellen erweitern im großen und ganzen die Bereiche für stammzelltransplantationen wegen ihrer hohen Ausdehnung Rate und Multi-Linie Differenzierung potenzielle1. MSCs können von den skelettartigen Muskel, Synovialis, dem Knochenmark und Fettgewebe2,3,4isoliert werden. Erkenntnisse haben auch bestätigte die Anwesenheit von MSCs in Gelenkflüssigkeit und die bisherige Forschung hat als aussichtsreiche Kandidaten für artikuläre Regeneration5,6synovial Flüssigkeit abgeleitet MSCs (SF-MSCs) identifiziert.

Forschung und präklinischen Erprobung auf humanen Proben unterliegen jedoch viele ethische Fragen. Stattdessen, Kaninchen wurden und auch weiterhin die am häufigsten verwendeten Tierarten nachweisen, dass die Transplantation von MSCs Knorpelschäden zu reparieren. In den letzten Jahren eine wachsende Zahl von Forschern untersuchten Kaninchen mesenchymalen Stammzellen (RbMSCs) beide in Vitro und in Vivo, als diese Zellen sind ähnlich wie menschliche MSCs in ihrer Biologie und Gewebe Zellphysiologie. Ebenso sind die RbMSCs in der Lage, des Festhaltens an Kunststoffoberflächen, Spindel-Fibroblasten Morphologie wie menschliche MSCs anzeigen. Darüber hinaus sind Kaninchen mesenchymalen Proben einfach und leicht zu7zu erhalten. Darüber hinaus sind die wichtigsten Punkte, dass RbMSCs oberflächenmarker wie CD44, CD90 und CD105, express und Multi-Linie Differenzierungspotenzial erhalten ist, ist in Übereinstimmung mit den Kriterien für die Identifizierung des MSC Populationen als durch die internationale Gesellschaft für Zelltherapie8,9definiert. Synovial Flüssigkeit Chondroprogenitors sind insbesondere in der Lage, nicht Hypertrophe werden wenn durch TGF-β1, wodurch sie geeignete Zelle Quellen für phänotypisch Gelenkknorpel Regeneration10,11induziert, 12.

Die Isolation der SF-MSCs ist jedoch sehr unterschiedlich zu anderen Geweben, einschließlich der Nabelschnur, Fettgewebe, peripherem Blut und Knochenmark. Derzeit sind die am häufigsten verwendeten Ansätze für die Reinigung und Sortierung von SF-MSCs Durchflusszytometrie und Immunomagnetic Wulst-basierte Sortierung, obwohl die Flow-zytometrie-Methode eine spezielle Umgebung und sehr teure Instrumente13 erfordert.

Dieser Artikel stellt ein Verfahren für die einfache und minimal-invasive Entnahme von Proben von Gelenkflüssigkeit aus Neuseeland weiße Kaninchen. Während des Verfahrens der RbSF-MSCs sind stabil erweiterten in-vitro- und dann mit CD90 positive magnetische Wulst-basierte Verfahren isoliert. Das Protokoll zeigt schließlich, wie MSCs mit hoher Reinheit und Wirtschaftlichkeit aus den geernteten Zelle Quellen zu erreichen.

In diesem Protokoll zeichnen sich die isolierte RbSF-MSCs anhand ihrer Morphologie, Ausdruck spezifischer Marker und Pluripotenz Stammzellen zu gewinnen. Flow Cytometry-basierte Immunphänotypisierung zeigt einen signifikanten positive Ausdruck CD44 und CD105, während der Ausdruck von CD45 und CD34 negativ ist. Schließlich zeigt ein in-vitro- Test für RbSF-MSCs osteogene adipogenen und Chondrogenic Differenzierung der Zellen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden entsprechend den regionalen Ethik-Kommission Leitlinien durchgeführt, und alle tierische Verfahren von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Shenzhen zweite Krankenhaus, Shenzhen-Universität angenommen wurden.

(1) isolieren und Kultur der RbSF-MSCs

  1. Vorbereitungen für das Tier Verfahren
    1. Bereiten Sie skelettartig Reifen weiblichen Neuseeland weiße Kaninchen für die Sammlung von RbSF-MSCs Perform eine klinische Untersuchung der Kaninchen einen Tag vor Ablauf der Anästhesie und gelenkpunktion.
      Hinweis: körperliche Untersuchungen gehören Gewicht (2,0-2,5 kg), Geschlecht (weiblich), und Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz. Parameter-Intervalle für klinisch gesunde Kaninchen sind 30-50 min für Atmung, Herzfrequenz 220-280 min und 38-39 ° C für die Körpertemperatur.
    2. Schnell die Tiere für 6 Stunden vor der Narkose.
  2. Vorbereitungen und das Verfahren für die tierischen Anästhesie
    1. Die Kaninchen mit Käfig zurückhalten (siehe Tabelle der Materialien), und dann 3 % Pentobarbital-Natrium in die Vene marginal Ohr bei einer Dosis von 1 mL/kg für die Vollnarkose zu injizieren.
    2. Legen Sie die Kaninchen in einer bequemen Position dorsal-Liegerad.
    3. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Herzfrequenz und Körpertemperatur des Kaninchens während der Narkose.
    4. Verwenden Sie ophthalmologische Salbe auf seine Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    5. Die Tiefe der Narkose nach Guedel Klassifizierung14zu beurteilen.
  3. Vorbereitung für MSCs Isolierung und Kultivierung
    1. Um RbSF-MSCs zu kultivieren, 500 mL von kommerziellen Kulturmedium vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt mit 10 % kommerzielle ergänzen (siehe Tabelle der Materialien), 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
    2. Inkubieren Sie das Nährmedium bei 37 ° C im Wasserbad.
    3. Zelle Isolation und Zelle waschen 500 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten.
    4. Das Knie Hohlraum gelenkpunktion Verfahren 100 mL isotonischer Kochsalzlösung vorbereiten.
  4. Sammlung von Gelenkknorpel synovialen fl Uid vom Knie des Kaninchens
    1. Wählen Sie einen Bereich ca. 5 x 5 cm in der Größe um das Knie und das Kaninchen Haar aus diesem Bereich mit einem Elektrorasierer Sicherheit.
    2. Abwechselnd, desinfizieren die Prozedur Website 3 X mit Povidon-Jod-Lösung und 75 % Ethanol. Wenden Sie dann sterile Tüchern, nach Bereich gründlich getrocknet ist.
    3. Injizieren Sie 3-4 x 1-2 mL Isotonische Kochsalzlösung, eine sterile Injektionsspritzen (2 mL), in die Knie gelenkspalt aus dem lateralen Gelenk Raum, bewegen Sie mit Hilfe des Knies zu, und dann saugen Sie die Gelenkflüssigkeit bei Raumtemperatur.
    4. Filtern der synovialen Geruchsbelastung durch ein 40 µm Nylon Zelle Sieb, Ablagerungen innerhalb von 4 Stunden zu entfernen.
  5. Kultur der RbSF-MSCs
    1. Sammeln Sie die gefilterten Geruchsbelastung in 50 mL Zentrifuge Tuben und Zentrifuge bei 1.500 u/min für 10 min bei Raumtemperatur.
    2. Den überstand nach der Zentrifugation zu verwerfen, das Pellet mit PBS waschen Aufschwemmen der Pellets mit dem kompletten Kulturmedium und dann Platte des Mediums in 100 mm Schalen.
    3. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2.
    4. Ergänzen Sie nach 48 h die Gerichte mit frischen Medium, nicht-adhärenten Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das Medium zweimal pro Woche für 2 Wochen als Durchgang 0 (P0).
      Hinweis: Sollte ca. 1 x 104 adhärente Zellen. Lebensfähige Zellen/ml in San Francisco sind etwa 2 x 102/mL.
    5. Nach 14 Tagen nach der ersten Beschichtung sollten viele Kolonien in den Kultur-Gerichten gebildet haben. Wählen Sie aus die Kolonien, die größer als 2 mm Durchmesser. Markieren Sie die ausgewählten Kolonien befinden sich durch ihren Umfang auf der Unterseite der Schüssel nachzeichnen.
    6. Die Kolonien < 2 mm breit, mit Zelle Schaber zu verwerfen. Verdauen Sie die ausgewählten Kolonien mit etwa 5 µL 0.25 % Trypsin, mit einem Klon Zylinder und übertragen Sie die Kolonien auf ein neues Gericht als Durchgang 1 (P1).
  6. Postoperative Pflege der Tiere
    1. Folgen Sie institutionelle operativen Standardverfahren für die postoperative Überwachung und Erholung aus der Narkose.
    2. Überwachen Sie die Vitalfunktionen des Kaninchens alle 10 Minuten, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat. Schließlich übertragen Sie das bewusste Tier in den Käfig. Ein Kaninchen, die Operation, um die Gesellschaft anderer Tiere durchlaufen hat, bis es vollständig erholt hat nicht zurück.
    3. Nach der Operation, Desinfizieren Sie die Website mit 0,1 % Povidon-Jod, 2 x pro Tag für 3 Tage.

2. CD90-Positive magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS) des RbSF-MSCs und Primärkultur

  1. Vorbereitung der Probe
    1. Wenn die Zellen herum erreichen 80 % Konfluenz Aspirieren Sie das Medium, und fügen Sie 1-2 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA, jedes Gericht.
    2. Inkubieren Sie die Gerichte für 2 – 3 min. zur Ablösung der Zelle zu ermöglichen.
    3. Sobald die Zellen getrennt sind, fügen Sie eine gleiche Menge des Kulturmediums, die Trypsin zu inaktivieren.
    4. Die Zellsuspension durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren, das Filtrat in einem 15 mL Röhrchen zu sammeln und dann spin-down der Zellen bei 600 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
    5. Aufschwemmen der Zelle Pellet in MACS mit Puffer (PBS, pH 7,2, 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM EDTA) und zählen Sie die Anzahl von Zellen.
  2. Magnetische Kennzeichnung
    Hinweis: Sortieren der RbSF-MSCs mit einer magnetischen aktiviert Zelle Sortieren Kit mit Spalten, einem Ständer und Separatoren (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer.
    2. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie völlig überstand.
    3. 80 µL Wiederfreisetzung Puffer pro 107 total Zellen hinzufügen.
    4. Fügen Sie für 107 total Zellen 20 µL Microbeads mit einem monoklonalen Anti-Kaninchen CD90 Antikörper konjugiert.
    5. Mischen Sie die magnetische Beads und Zellen gleichmäßig in den Röhren, dann inkubieren sie bei 4 ° C für 15 Minuten im Dunkeln.
    6. Das Rohr 1 mL Puffer pro 107 Zellen hinzu, und Zentrifugieren Sie es bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C, die Zellen zu waschen. Entsorgen Sie den überstand nach der Zentrifugation.
    7. Das Pellet in 500 µL Puffer pro 107 Zellen aufzuwirbeln.
  3. Magnetische Trennung
    1. Setzen Sie die Säule mit der Spalte Flügel nach vorne in das Magnetfeld der Magnetabscheider.
    2. Spülen Sie die Spalte Magnetabscheider (MS) mit 500 µL Puffer pro 107 Zellen.
    3. Übertragen Sie die einzigen Zellsuspension in der Spalte. Lassen Sie die negativen Zellen durchlaufen das magnetische Feld um diese unbeschrifteten Zellen zu verwerfen.
    4. Waschen der Spalte 1-2 X mit 500 µL Puffer pro 107 Zellen und entsorgen Sie den Durchfluss.
    5. Übertragen Sie die Spalte in ein Zentrifugenröhrchen (15 mL).
    6. Fügen Sie 1 mL des Puffers pro 107 Zellen der Spalte, und schieben Sie dann sofort den Kolben in die Spalte zu spülen, die magnetisch markierten Zellen.
    7. Wiederholen Sie die vorgenannten Verfahren mit ein zweite MS Column die Reinheit des CD90 erhöhen+ Zellen, die der eluierten Bruchteil bereichern können.
    8. Die Zellsuspension bei 300 × g für 10 min zentrifugieren, überstand Aspirieren und mit dem Kulturmedium Aufschwemmen.
  4. Kultur von der CD90+ RbSF-MSCs
    1. Die Zellen in 100 mm Schalen nach magnetisch aktivierte Zellsortierung zu impfen.
    2. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C in einem befeuchteten Zelle Inkubator mit 5 % CO2.
    3. Bei 80-90 % Zusammenfluss von der Primärkultur, bei etwa 7-10 Tage erreicht wird, verdauen die adhärenten Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA und Passage bei einer Verdünnung von 1:2 zu Abschnitt 2 (P2).
    4. Verwenden Sie dieselbe Methode, die Zellen, die Passage 3 (P3) übergeben, die für die in-vitro- Tests verwendet werden kann.
      Hinweis: Nach der Subkultur und Reinigung, werden ca. 1 x 107 RbSF-MSCs gewonnen.

3. Identifizierung von RbSF-MSCs

  1. Surface Marker Bestätigung der RbSF-MSCs durch Durchflusszytometrie
    1. Wenn die MSCs 80-90 % Zusammenfluss bei P3 sind, die Zellen mit PBS waschen und behandeln sie mit 0,25 % 1 mL Trypsin-EDTA. MSCs bei 37 ° C für ca. 2-3 min inkubieren dann, bis die Zellen gelöst werden.
    2. Ernte der Zellen mit 10 mL PBS, übertragen Sie sie in einem konischen Rohr (15 mL) und Zentrifugieren sie 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Entsorgen Sie die Überstände. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL PBS und in einem 1,5 mL-Tube zu übertragen.
    4. Inkubieren Sie eine 1: 100 Verdünnung von FITC konjugiert und PE-konjugierten Antikörpern (Isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) für 1 h im Dunkeln bei 4 ° c
    5. Zentrifugieren Sie dieses Gemisch bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min jedes Mal zu. Entsorgen Sie die Überstände.
    6. Aufschwemmen der Zellen in 500 µL PBS, übertragen die Zellsuspension in ein Rundboden Röhrchen (5 mL) und es mit einem Durchflusszytometer analysiert.
      Hinweis: Daten auf eine Cytometer ausgestattet mit zwei Fluoreszenz Kanäle erwerben: 533/30 und 585/40. Verwenden Sie für jedes Isotype Fluoreszenz die Isotype-Steuerelement, um die geeigneten Laser-Spannung einstellen, und stellen Sie die minimale Intensität erforderlich, um ein Fluoreszenz-Histogramm zu erhalten, die linken und rechten Ränder der Spitze zeigt. Ein Minimum von 10.000 Veranstaltungen für die statistischen Analysen zu sammeln.
  2. Multidifferentiation von der RbSF-MSCs
    Hinweis: Verwendung P3 RbSF-MSCs für in-vitro- multidifferentiation Assays.
    1. Osteogene Differenzierung
      1. Bereiten Sie das osteogene Induktion Medium: DMEM Basic (1 X) mit 50 mM L-Ascorbinsäure-Säure-2-Phosphat, 10 mM von α-glycerophosphat und 100 nM von Dexamethason.
      2. Samen der Zellen bei 103 Zellen/cm2 in einer Gewebekultur 6-Well-Platte und Kultur sie mittelfristig osteogene Induktion.
      3. Ändern der Induktion Mittel alle 3 Tage für 3 Wochen.
      4. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur nach Abschluss der Differenzierung, die Zellen färben mit 1 % Alizarin rot für 5 min und dann waschen Sie 3 X mit PBS15.
    2. Adipogenen Differenzierung
      1. Vorbereiten der adipogenen Induktion Medium: DMEM Basic (1 X) bestehend aus 100 mM von Indometacin, 10 mg/mL rekombinante Humaninsulin und 1 mM von Dexamethason 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin.
      2. Die P3-RbSF-MSCs für 3 Wochen in der adipogenen Induktion Medium zu behandeln.
      3. Färben Sie nach 3 Wochen die neutral Lipid Vakuolen mit Öl Rot O adipogenen Differenzierung zu bestätigen. Die Zellen in einer 4 % Formaldehyd-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur zu beheben, und wasche sie dann 3 X mit PBS16.
    3. Chondrogenic Differenzierung
      1. Vorbereiten der Chondrogenic Induktion Medium: DMEM Basic (1 X), bestehend aus 10 ng/mL TGFβ1, 1 % seiner Ergänzung, 0,35 mM L-Prolin, 100 nM von Dexamethason, 50 mM L-Ascorbinsäure Säure-2-Phosphat und 1 mm Natrium Pyruvat.
      2. Verwenden Sie Pellet Kultivierung für die Chondrogenic Induktion. Zentrifugieren Sie 5 × 10-5 P3-RbSF-MSCs bei 1500 u/min für 10 min in einem Polypropylen Röhrchen (15 mL), eine Kugel zu bilden.
      3. Die Pellets für 3 Wochen mit dem Chondrogenic-Induktion-Medium-Kultur.
      4. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage für 3 Wochen.
      5. Nach 3 Wochen Induktion, die Zelle Pellet mit Paraffin einbetten, in 4 mm Scheiben Abschnitt, und Färben sie mit 0,1 % Toluidin blau für 30 min bei Raumtemperatur-17.
  3. Insgesamt RNA-Extraktion und Analyse durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
    1. Isolieren der gesamte-RNS der Zellen nach 3 Wochen Differenzierung Induktion über die kommerzielle RNA-Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Entfernen Sie das Kulturmedium in der Kulturschale zu, und fügen Sie 1 mL Reagenz isoliert.
      2. Lyse der Zellen durch wiederholte pipettieren, bis die Lösung homogen ist. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur 3 min.
      3. Übertragen Sie die Zelle lysate zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
      4. Fügen Sie 100 µL Chloroform hinzu, schütteln Sie sie von Hand 15 X und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur 3 min.
      5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C. Übertragen Sie die Überstände zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
      6. Fügen Sie 500 µL Isopropanol und überstürzen Sie sich die RNA für 10 min bei Raumtemperatur.
      7. Zentrifuge bei 12.000 × g für 10 Minat 4 ° C. Die RNA-Pellet sollten an der Unterseite des Rohres sichtbar.
      8. Entfernen Sie den überstand zu, und fügen Sie dann 500 µL 75 % Ethanol. Kurz drehen Sie das Rohr für einige Sekunden die RNA-Pellet zu waschen. Zentrifugieren sie bei 7.500 × g für 5 min bei 4 ° C.
      9. Entfernen Sie die restliche Ethanol.
      10. Lösen Sie die RNA-Pellet in 10 µL DEPC-Wasser auf und die Rohre auf Eis.
    2. Reverse Transkription total RNA in cDNA mit einer DNA-Synthese kit (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Führen Sie die folgenden Verfahren auf Eis.
      1. Vorbereiten der reversen Transkription-master-Mix.
      2. Jedes Rohr mit 1 µg RNA 25 µL RNA DNase-behandelten hinzufügen.
      3. Inkubieren Sie die Mischung bei folgenden Temperaturen mit einer PCR-Thermocycler: 26 ° C für 10 min (um die zufällige Hexamers zu tempern zu ermöglichen), 42 ° C für 45 min. (reverse Transkription) und 75 ° C für 10 min (zu inaktivieren die Reverse Transkriptase).
      4. Sofort analysieren Sie die resultierende cDNA durch quantitative Echtzeit-PCR oder bei-20 ° c Lagern
    3. Führen Sie die Genanalyse Ausdruck mit einem quantitative Echtzeit-PCR-System.
      1. QRT-PCR Master Mix zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) PCR durchführen. Die PCR-Primer für GAPDH, Runx2, Agg und PPARγ sind in Tabelle 1aufgeführt.
      2. Gen-Expression mit 2−ΔΔCT Methode zu berechnen.
      3. Führen Sie eine statistische Analyse mit statistischen Standardsoftware. Verwenden Sie einen unabhängige Stichproben t-Test, um die Gruppe Mittel vergleichen.

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Ergebnisse

Isolierung, Reinigung und Kultur der RbSF-MSCs:
Dieses Protokoll verwendet MACS, um RbSF-MSCs, basierend auf dem Ausdruck des MSC Oberfläche Markers CD90 zu isolieren. Ein Ablaufdiagramm RbSF-MSCs Isolierung, Charakterisierung, Reinigung, und die in-vitro- Kultur-Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.

Zellmorphologie nach magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (...

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Diskussion

Das Vorhandensein von MSCs in Gelenkflüssigkeit bietet eine Alternative für zellbasierte Therapien. Frühere Studien haben gezeigt, dass Verletzungen Websites höhere Mengen an mesenchymalen Stammzellen in die Gelenkflüssigkeit enthalten, die mit dem posttraumatischen Periode5positiv korreliert werden kann. Die MSCs in Gelenkflüssigkeit können Gewebe für die Verbesserung der spontanen Heilung nach einer Verletzung18,19hilfreich sein. Die kli...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Natural Science Foundation of China (Nr. 81572198; (Nr. 81772394); der Fonds für hohe Niveau medizinische Disziplin Bau von Shenzhen-Universität (Nr. 2016031638); die medizinische Forschung Grundlage der Guangdong Provinz, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschaft und Technologie-Projekte (No. JCYJ20170306092215436; Nein. JCYJ20170412150609690; Nein. JCYJ20170413161800287; Nein. SGLH20161209105517753; Nein. JCYJ20160301111338144).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
MesenGroStemRDMGro-500 1703Warm in 37 &de; C Wasserbad vor Gebrauch
MesenGro SupplementStemRDMGro-500 M1512Bestandteil des MSCs-Kulturmediums
DMEM basicGibco Inc.C11995500BTMSCs Differenzierungsmedium
Isotonische KochsalzlösungLitai, China5217080305Kavitätenarthrozenteseverfahren Reagenz
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, frei von Ca2+/Mg2+
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco Inc.10099-141Bestandteil des MSCs-Kulturmediums
Povidon-Jod-LösungGuangdong, China150605Sterilisationsmittel
75 % EthanolLircon, China170917Sterilisationsmittel
0,25 % Trypsin/EDTAGibco Inc.25200-056Reagenz für Zelldissoziation
1% Penicillin-StreptomycinGibco Inc.15140-122Bestandteil des MSC-Mediums
MACS LaufpufferMiltenyiBiotec5160112089Enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mMEDTA
CD90 Antikörper konjugierte MicroBeadsMiltenyiBiotec5160801456Für die magnetisch aktivierte Zellsortierung
NatriumpyruvatSigma-AldrichP2256Bestandteil von MSCs chondrogen Differenzierung
DexamethasonSigma-AldrichD1756Bestandteil der osteogenen Differenzierung
von MSCs ITSBD3543521%, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs
L-ProlinSigma-AldrichP56070,35 mM, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs
L-Ascorbinsäure-2-phosphatSigma-AldrichA896050 mM, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs
3-Isobutyl-1-methylxanthinSigma-AldrichI58790,5 mM, Bestandteil der adipogenen Differenzierung
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 mM, Bestandteil der adipogenen Differenzierung
TGFβ 1Peprotech100-2110 ng/ml, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs
α-GlycerophsphatSigma-AldrichG6751Bestandteil der osteogenen Differenzierung von MSCs
CD34 Polyklonaler Antikörper, FITC konjugierterBiossbs-0646R-FITCMarker für hämatopoetische Stammzellen
Antikaninchen-CD44Bio-RadMCA806GAThy-1-Membran Glykoprotein (MSCs-Marker)
CD45 (monoklonaler Antikörper)Bio-RadMCA808GAMarker für hämatopoetische Stammzellen
CD105 AntikörperGenetexGTX11415MSCs-Marker
IsopropylalkoholSigma-AldrichI9030Ausfällungen RNA-Extraktion organische Phasen
TrichlormethanWenge, China61553Extrakt Gesamt-RNA
TrizolInvitrogen15596-018Isolat Gesamt-RNA
SYBR grüner MastermixTakara Bio, JapanRR420APCR-Test
cDNA-SynthesekitTakara Bio, JapanRR047ARückwärtstranskribiert auf komplementäre DNA
Alizarin RotSigma-AldrichA5533Färbung von Calciumverbindungen
ToluidinblauSigma-Aldrich89640Färbung von Knorpelgewebe
Öl Rot O LösungSigma-AldrichO1391LLipidvakuolenfärbung
Equipment
MiniMACS SeparatorMiltenyiBiotec130-042-102Für magnetisch aktivierte Zellsortierung
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303Für magnetisch aktivierte Zellsortierung
MS SäulenMiltenyiBiotec130-042-201Für die magnetisch aktivierte Zellsortierung
ZellsiebFALCON Inc.35234040 μ m Nylon
HämozytometerISOLAB Inc.075.03.001Zellzählung
Falcon 100 mm SchaleCorning353003Zellkulturschale
MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-CRNA Extraktions- und PCR
ZentrifugenröhrchenSigma-Aldrich91050Gamma-sterilisierte
HochgeschwindigkeitszentrifugeEppendorf5804RZentrifugenzellen
Kohlendioxid-Zelle InkubatorThermo scientific3111Zellkultur
Real-Time PCR InstrumentLife TechQuantStudioReal-Time quantitative Polymerase-Kettenreaktion
DurchflusszytometerBD Biosciences342975Zellanalysator
PipettiererEppendorfO25456FTransfer der Flüssigkeit
KlonierungszylinderSigma-AldrichC3983-50EAIsolierung und Entnahme einzelner Zellkolonien
Sterile InjektionsspritzeDoppeltaube, China131010Arthrozentese-Verfahren
KaninchenkäfigZhike, ChinaZC-TGDFixieren Sie das Kaninchen

Referenzen

  1. Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
  2. Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
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