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Biochemistry

मालदी द्वारा माउस ऊतक निष्कर्षों में विशिष्टता को छेड़ने का संकल्प-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री: विशिष्टता परिवर्तन के कारण पीएच हेर-फेर

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57469
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Nihon Pharmaceutical University, 2Department of Clinical Pharmaceutics, Nihon Pharmaceutical University

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए कच्चे चूहे ऊतक निष्कर्षों में विशिष्टता का निर्धारण मालदी-तोफ स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर ।

Abstract

कई जैविक कार्य है, प्रोटीन सक्रियण/निष्क्रियता और खाद्य पाचन सहित । की पहचान छेड़ने विशिष्टता समारोह का खुलासा करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि मैट्रिक्स का उपयोग अद्वितीय सब्सट्रेट के आणविक भार को मापने के द्वारा विशिष्टता को निर्धारित करता है-असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization समय की उड़ान (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री । सब्सट्रेट iminobiotin होते हैं, जबकि सट साइट में अमीनो अम्ल होते हैं, और स्पेसर के पास पॉलीथीन के ग्लाइकोल होते हैं. सट सब्सट्रेट एक अद्वितीय आणविक वजन एक सट एमिनो एसिड का उपयोग कर उत्पन्न होगा । इस विधि की खूबियों में से एक यह है कि कच्चे तेल के नमूनों का उपयोग कर एक बर्तन में किया जा सकता है, और यह भी कई नमूनों का आकलन करने के लिए उपयुक्त है । इस अनुच्छेद में, हम एक सरल प्रयोगात्मक माउस फेफड़ों के ऊतकों से निकाले गए नमूनों के साथ अनुकूलित विधि का वर्णन, ऊतक निष्कर्षण सहित, नमूनों में पाचन सब्सट्रेट की नियुक्ति, अलग पीएच शर्तों के तहत पाचन सब्सट्रेट की शुद्धि , और सब्सट्रेट ' आणविक वजन की माप मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर. संक्षेप में, इस तकनीक को कच्चे तेल ऊतक मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री, जो आसानी से कई नमूना प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया जा सकता है का उपयोग कर निष्कर्षों से व्युत्पंन में विशिष्टता की पहचान के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

teases प्रोटीन सट द्वारा शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित, और विशिष्ट समय और स्थानों पर छेड़ने गतिविधि की दीक्षा1विनियमित है । । । इसलिए यह अभिव्यक्ति और स्थानीय रूप से विनियमित रहे हैं कि ऊतकों की गतिविधि की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और एक उपंयास विधि का पता लगाने के लिए का विकास करने के लिए । इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि का उद्देश्य का पता लगाने के लिए समानांतर में चिढ़ा विशिष्टता की पहचान करना है ।

वहां की विशिष्टता का पता लगाने के लिए कुछ तरीके हैं । azocasein विधि अच्छी तरह से2 का पता लगाने में इसके उपयोग के लिए जाना जाता है, लेकिन इसकी क्षमता में और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए सीमित है । Zymography एक और व्यापक चिढ़ाने का पता लगाने विधि है कि3को छेड़ने के आणविक वजन निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन यह सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । चिढ़ा विशिष्टता spectrometric परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, ऐसे पी के रूप में सब्सट्रेट का उपयोग-nitroanilide4, और fluorometric परख, अनंतमूलि सब्सट्रेट का उपयोग कर5 या प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) परख6। इन तरीकों में निहित सब्सट्रेट के एकल विशिष्टता का पता लगाने के एक अच्छी तरह से सक्षम. वर्तमान अध्ययन में, ऊतक निष्कर्षों की चिढ़ा विशिष्टता विभिंन शर्तों के तहत जांच की है, के रूप में इन निष्कर्षों में कई टीज़ होते हैं । तंग गतिविधि पीएच, coenzymes, कृत्रिम समूहों, और आयन ताकत सहित कई कारकों, द्वारा विनियमित है । हाल ही में, प्रोटियोमिक् आधारित तरीकों को छेड़ने की विशिष्टता की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; उदाहरण के लिए, Biniossek एट अलद्वारा रिपोर्ट की गई विधि । 7 proteome का उपयोग करता है भी कच्चे तेल के अर्क में सब्सट्रेट विशिष्टता का निर्धारण और कई एमिनो एसिड अनुक्रम8पहचान की है कि टीज़ की दरार गतिविधि का सही निर्धारण की अनुमति देता है । हालांकि, इस विधि के कई नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । इसके विपरीत, हमारी विधि एकाधिक नमूनों के एक साथ प्रसंस्करण, और मैट्रिक्स की सहायता लेजर Desorption/Ionization समय की उड़ान (मालदी-तोफ) के उपयोग के लिए सक्षम बनाता है नमूना विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के तेजी से और आसान पता लगाने की सुविधा Substrates.

यह कागज एक विधि मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए अद्वितीय सब्सट्रेट के आणविक वजन को मापने के लिए के रूप में विशिष्टता का मूल्यांकन करने की रूपरेखा । उनके सैद्धांतिक आणविक भार के साथ-साथ, सट सब्सट्रेट के आणविक रूपों, चित्रा 1 और तालिका 1में दिखाए जाते हैं । पिछले अध्ययनों में polyglycine स्पेसर और9बायोटिन युक्त सब्सट्रेट का इस्तेमाल किया है; हालांकि, इन सब्सट्रेट दोषपूर्ण है क्योंकि polyglycine अनुक्रम एंजाइमों कि glycine अनुक्रम पहचान से सट जा सकता है । साथ ही, उच्च समानता avidin और बायोटिन के बीच एक कम पुनर्प्राप्ति दर करने के लिए लीड हो सकता है । इन कमियों पर सुधार करने के लिए, इस अध्ययन में हम एक अद्वितीय सब्सट्रेट, जो पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), iminobiotin, और एक एमिनो एसिड है कि दरार साइट (चित्रा 1) की पहचान सकता है से बना था संश्लेषित. समान आणविक भार के अमीनो अम्लों के बीच भेदभाव करने के लिए, डी-serine को खूंटी स्पेसर और सट साइट पर अमीनो अम्ल के बीच जोड़ा गया था.

सब्सट्रेट के एन टर्मिनल iminobiotin के साथ लेबल किया गया था, जो कच्चे तेल के नमूनों से समानता शुद्धि सक्षम बनाता है. बायोटिन की बजाय iminobiotin का उपयोग महत्वपूर्ण है; बायोटिन avidin के साथ एक मजबूत संबंध है, जो avidin राल से बायोटिन-लेबल सब्सट्रेट की कम वसूली दर में परिणाम है, जबकि avidin के लिए iminobiotin के संबध पीएच द्वारा बदला जा सकता है । Iminobiotin-लेबल सब्सट्रेट पीएच 9 से ऊपर की स्थितियों में avidin के लिए बाध्य करेगा, जबकि avidin विज्ञप्ति Iminobiotin-4 पीएच नीचे की स्थितियों में सब्सट्रेट लेबल । इसलिए अपनत्व शुद्धि के लिए iminobiotin का प्रयोग किया गया10. संक्षेप में, हम अद्वितीय सब्सट्रेट का उपयोग कर का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।

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Protocol

पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल Nihon दवा विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और Nihon दवा विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया । प्रोटोकॉल ICR चूहों से व्युत्पंन ऊतक निष्कर्षों के लिए समायोजित किया गया है । ICR चूहों निप्पॉन एसएलसी लिमिटेड से खरीदा गया था (Shizuoka, जापान)

1. Iminobiotin-लेबल सब्सट्रेट की तैयारी

सब्सट्रेट 9-fluorenylmethyloxycarbonyl समूह (Fmoc) का उपयोग ठोस चरण संश्लेषण से गुजरती है-11के नीचे वर्णित के रूप में एमिनो एसिड की रक्षा की. Fmoc-यौगिक का इस्तेमाल किया, वांछित अमीनो एसिड और संश्लेषण की अवस्था के आधार पर निर्धारित करने के लिए तालिका 2 का उपयोग करें ।

  1. Fmoc के Swill ०.२ जी-NH-एक संश्लेषण कॉलम में एन, एन dimethylformamide (DMF) के 10 मिलीलीटर के साथ साल राल ।
  2. DMF में 30% piperidine की 5 मिलीलीटर डालें । Fmoc-समूह सट करने के लिए 10 मिनट के लिए समाधान रॉक ।
  3. trinitrobenzenesulfonic एसिड के साथ Fmoc दरार की जाँच करें (TNBS) टेस्ट12: TNBS में 1% DMF के 10 µ एल जोड़ें और µ के 10 diisopropylethylamine एल (DIPEA) एक 10 x ७५ mm2 ग्लास ट्यूब करने के लिए, तो ग्लास ट्यूब करने के लिए राल की एक छोटी राशि हस्तांतरण. Fmoc-सट राल एक नारंगी रंग विकसित करना चाहिए ।
    1. दोहराएं चरण 1.2-1.3 यदि यह परिणाम ऋणात्मक है ।
  4. DMF के 5 मिलीलीटर के साथ राल को तीन बार धो लें ।
  5. Fmoc-यौगिक 2 तालिका में सूचीबद्ध के ०.३ mmol युक्त DMF के 5 मिलीलीटर जोड़ें (1 चरण में इस्तेमाल किया यौगिक के साथ शुरू), ०.३ mmol के O-(6-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-1-benzotriazol-१-yl)-n, n, n ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), ०.३ mmol of 1- Hydroxy-ज-benzotriazole, मोनोहाइडे (HOBt), और ०.६ mmol के diisopropylethylamine (DIPEA) । 30 मिनट के लिए यह राल के साथ जोड़ी के लिए समाधान रॉक ।
    1. TNBS परीक्षण के साथ इस चरण की जाँच करें । यदि परिणाम सकारात्मक है, इसका मतलब यह प्रतिक्रिया पर्याप्त प्रगति नहीं की है और यह कदम दोहराया जाना चाहिए ।
  6. DMF के 5 मिलीलीटर के साथ राल को तीन बार धो लें ।
  7. दोहराएं चरण 1.2-1.6, Fmoc-यौगिक चरण १.५ में तालिका 2के अनुसार उपयोग किया गया परिवर्तित करके बढ़ाव प्रतिक्रिया दोहराएँ ।
  8. २.५% पानी, 1% triisopropylsilane (टिज), और २.५% ethanedithiol (EDT) के trifluoroacetic एसिड में 1 मिलीलीटर राल और सुरक्षा समूहों से पेप्टाइड्स सट करने के लिए जोड़ें । ६० मिनट के लिए समाधान रॉक ।
  9. फ़िल्टर, और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में निस्पंदन इकट्ठा ।
  10. ठंड diethyl इथेनॉल के ४० मिलीलीटर जोड़ें और-20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान ।
  11. 30 मिनट के लिए-20 ° c पर ४,००० x g केंद्रापसारक गोली ले लीजिए ।
  12. diethyl ईथर को दूर करने के लिए 3 ज के लिए एक desiccator का प्रयोग करें ।
  13. पानी के लिए ५०% acetonitrile की 1 मिलीलीटर जोड़ें और कच्चे पेप्टाइड्स भंग । trifluoroacetic अम्ल को दूर करने के लिए समाधान Lyophilize । इस चरण को कई बार दोहराएं ।
  14. एक C18 कारतूस कॉलम का उपयोग कर पेप्टाइड्स शुद्ध ।
    1. acetonitrile (ACN) के 3 मिलीलीटर का उपयोग C18 कारतूस कॉलम में राल को सक्रिय करें ।
    2. 5 मिलीलीटर की 5% ACN के साथ Equilibrate, ०.१% TFA में एच2हे ।
    3. C18 कारतूस कॉलम में क्रूड सिंथेटिक पेप्टाइड्स लोड ।
    4. 5% ACN के 10 मिलीलीटर, ०.१% TFA में एच2ओ के साथ धो लें ।
    5. Elute ने नमूनों को 3 मिलीलीटर से ६०% ACN, ०.१% TFA को एच2ओ में ।
  15. मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर अपने आणविक वजन को मापने के द्वारा पेप्टाइड्स की जाँच करें.
    1. एक लक्ष् य प्लेट पर eluent के पिपेट 1 µ l तुरंत जोड़ संतृप्त α-cyano-4-hydroxycinnamic अम्ल (CHCA) समाधान में ५०% acetonitrile में ०.१% trifluoroacetic अम्ल
    2. हवा सूखने से मिश्रण सघन ।
    3. साधन निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार नमूनों की विपुल स्पेक्ट्रा मोल ।
      1. मैंयुअल रूप से सेट मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए एक सकारात्मक प्रतिबिंबित मोड ।
      2. CHCA का उपयोग करते हुए जन स्पेक्ट्रोमीटर जांचना, bradykinin टुकड़ा 1-7 (monoisotopic आणविक भार = ७५६.३९९७ दा), और एन्जियोटेन्सिन द्वितीय (monoisotopic आणविक भार = १,०४५.५४२३ दा).
      3. सिंथेटिक पेप्टाइड्स के विपुल स्पेक्ट्रा प्राप्त, और फिर सैद्धांतिक आणविक वजन के साथ तुलना करके मूल्यांकन.

2. ऊतक निष्कर्षों की तैयारी

  1. Anesthetize पुरुष एक isoflurane साँस लेना चैंबर में चूहों ICR और पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से संज्ञाहरण गहराई की पुष्टि. चूहों को ग्रीवा विस्थापन करके Euthanize.
  2. कैंची का प्रयोग, असिरूप प्रक्रिया तक फैली त्वचा के माध्यम से एक midline पेट चीरा बनाते हैं ।
  3. डायाफ्राम के माध्यम से काटें और सभी फेफड़ों के ऊतकों को इकट्ठा । ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट लें ।
  4. तीन बार बर्फ ठंडा ५० mM Tris-बफर खारा (पीएच ७.४) के साथ ऊतक धो लो ।
  5. ऊतकों का वजन और एक 12 x ७५ mm2 ग्लास ट्यूब के ऊतकों के बारे में १०० मिलीग्राम के हस्तांतरण ।
  6. ०.३ मिलीलीटर निष्कर्षण बफ़र (५० mM Tris-बफ़र, pH ७.४, जिसमें ०.१% पाली (oxyethylene) octylphenyl ईथर) जोड़ें ।
  7. Homogenize एक मिश्रण homogenizer का उपयोग कर फेफड़ों के ऊतकों के नमूने ।
    1. बर्फ पर नमूने ठंडा ।
    2. Homogenize एक ब्लेंडर में 30 एस के लिए २०,००० rpm पर नमूने । यह चरण तब तक दोहराएं जब तक नमूने पूरी तरह सजातीय न हो जाएं ।
      नोट: तापमान में वृद्धि से बचने के क्रम में, लगातार 1 मिनट से अधिक समय तक homogenize न करें ।
  8. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए homogenate के १,००० µ एल स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  9. एक नया १.५ एमएल प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए supernatant के ५०० µ एल स्थानांतरण ।
  10. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए नमूने के 10 µ l का उपयोग करें, जैसे कि bicinchoninic एसिड (बीसीए) या Coomassie प्रतिभाशाली नीला (CBB) विधि का प्रयोग ।
  11. ठंड को रोकने के लिए, ५०% ग्लिसरॉल के अंतिम एकाग्रता के लिए नमूनों में ८०% ग्लिसरॉल जोड़ें ।
  12. -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान आगे का उपयोग करें ।

3. मॉडल को छेड़ो और ऊतक निष्कर्षों में सब्सट्रेट के पाचन

  1. जोड़ें 10 µ l के ०.१ µ g/µ l के N-tosyl-l-फेनिलएलनिन chloromethyl कीटोंन (TPCK)-trypsin, ०.१ µ g/µ l की Staphylococcus aureus V8 की चिढ़ाना, या 10 µ g/µ l ऊतक अर्क के ८९० µ l में एक पाचन बफर.
    1. पीएच के आधार पर विशिष्टता में अंतर स्पष्ट करने के लिए, पीएच 3, 5, 7, और 9 के लिए समायोजित बफ़र्स का उपयोग करें । पाचन बफ़र की संरचना तालिका 3में दिखाया गया है ।
    2. एक नकारात्मक नियंत्रण बाहर ले जाने के लिए ऊतक निष्कर्षों में निष्क्रिय छेड़ने का उपयोग, उबलते पानी में गर्मी (या १०० डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग) द्वारा तैयार 10 मिनट के लिए ।
  2. iminobiotin के 10 µ एल जोड़ें-लेबल सब्सट्रेट (dimethyl sulfoxide (DMSO) में भंग, अंतिम एकाग्रता = १०० pmol/10 µ एल).
  3. iminobiotin-लेबल वाले सब्सट्रेट को पचाने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए मशीन ।
  4. मशीन के बाद, उबलते पानी के साथ सब्सट्रेट के पाचन बंद (या १०० डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग द्वारा) 10 मिनट के लिए ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर 5 मिनट के लिए पचा सब्सट्रेट केंद्रापसारक ।
  6. एक नया १.५ एमएल ट्यूब में supernatant स्थानांतरण ।

4. Iminobiotin-लेबल सब्सट्रेट की शुद्धि

  1. 1 M Tris में ५०% streptavidin sepharose मोतियों की ५० µ एल जोड़ें-बफर (pH 9) जिसमें ०.१% पाली (oxyethylene) octylphenyl ईथर ।
    1. पीएच परीक्षण कागज का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि समाधान पीएच 9 के आसपास है । यदि समाधान का पीएच कम है, यह 1 मीटर Tris-बफर (ph 9) युक्त ०.१% पाली (oxyethylene) octylphenyl ईथर जोड़कर लगभग पीएच 9 के लिए समायोजित करें । यह कदम महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह iminobiotin के बाध्यकारी-streptavidin को सब्सट्रेट लेबल शामिल है ।
  2. streptavidin करने के लिए iminobiotin-लेबल वाले सब्सट्रेट को बाइंड करने के लिए एक रोटेटर व्हील पर निरंतर कोमल मिश्रण के साथ 4 ° c पर रातोंरात मशीन. मोतियों की गर्मी में निलंबित रहना चाहिए ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
  4. इस प्रकार के रूप में पांच बार मोतियों को धो लें:
    1. एक धोने बफर के १,००० µ एल जोड़ें (५० mM Tris-बफर, पीएच 9) मोतियों को ।
    2. एक रोटेटर व्हील पर लगातार कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए धो लें । मोतियों की गर्मी में निलंबित रहना चाहिए ।
    3. 4 ° c पर १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant निकालें ।
  5. मोतियों को ०.२% trifluoroacetic एसिड की १०० µ एल जोड़ें ।
    1. का प्रयोग करें पीएच परीक्षण कागज सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान पीएच 2 के नीचे है । यदि समाधान का पीएच उच्च है, 1% trifluoroacetic एसिड जोड़कर पीएच को 2 से नीचे समायोजित करें ।
  6. एक रोटेटर व्हील पर लगातार कोमल मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० एक्स जी में 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक, तो एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।

5. नमूना तैयारी और मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री)

नोट: निंनलिखित चरणों में सभी समाधान उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ तैयार किया जाना चाहिए (HPLC)-ग्रेड या एमिनो एसिड अनुक्रमण ग्रेड पानी ।

  1. पिपेट ५०० एक C18 राल पर acetonitrile के µ एल इसे सक्रिय करने के लिए । उपयोग किए गए acetonitrile को निकालें । इस चरण को तीन बार दोहराएं ।
  2. Equilibrate ने ०.१% trifluoroacetic अम्ल के १०० µ l के साथ C18 राल को । eluent निकालें । इस चरण को तीन बार दोहराएं ।
  3. नमूने लोड करने के लिए, एक पिपेट का उपयोग कर राल के लिए नमूने बांध ।
  4. ०.१% trifluoroacetic एसिड की 20 µ एल के साथ राल धो लो । इस चरण को पांच बार दोहराएं ।
  5. नमूनों को ०.१% trifluoroacetic अम्ल में ६०% acetonitrile के 3 µ l के साथ Elute । पिपेट को मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक लक्ष् य प्लेट पर eluent । तुरंत ०.१% acetonitrile एसिड में ५०% trifluoroacetic में संतृप्त α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) समाधान जोड़ें ।
  6. हवा सूखने से मिश्रण सघन ।
  7. साधन निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार नमूनों की विपुल स्पेक्ट्रा मोल.
    1. मैंयुअल रूप से सेट मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए एक सकारात्मक प्रतिबिंबित मोड ।
    2. CHCA का उपयोग करते हुए जन स्पेक्ट्रोमीटर जांचना, bradykinin टुकड़ा 1-7 (monoisotopic आणविक भार = ७५६.३९९७ दा), और एन्जियोटेन्सिन द्वितीय (monoisotopic आणविक भार = १,०४५.५४२३ दा).
    3. नमूनों की विपुल स्पेक्ट्रा प्राप्त, ७०० से जन स्पेक्ट्रा के करीब ध्यान देने के लिए ९०० दा करने के लिए बायोटिन-लेबल सब्सट्रेट के सट फार्म के लिए.
  8. तालिका 1का उपयोग करके खोजे गए चोटियों की पहचान करें । उपयुक्त आणविक वजन का पता लगाने के सी पर दरार इंगित करता है-प्रासंगिक अमीनो एसिड की टर्मिनस ।

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Representative Results

मॉडल को छेड़ने के द्वारा चिढ़ा विशिष्टता की पहचान के लिए विधि का मूल्यांकन

इस प्रणाली की क्षमता का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था TPCK-trypsin और V8 चिढ़ाना, जिसका सब्सट्रेट विशिष्टता प्राप्त किया गया था । TPCK-trypsin और वी 8 को छेड़ो lysine और arginine अवशेषों के सी-टर्मिनल पर अमीनो एसिड अनुक्रम सट करने के लिए, और carboxy एसिड और एसपारटिक एसिड अवशेषों के glutamic पक्ष में क्रमशः का अनुमान लगाया गया । तालिका 1 सब्सट्रेट और पचा विशिष्ट के द्वारा सट टुकड़े के सैद्धांतिक आणविक वजन से पता चलता है । सब्सट्रेट पाचन TPCK-trypsin का उपयोग कर सट टुकड़े का उत्पादन किया, जिनमें से दो ८३९.८१ दा और ७९६.७६ दा पर पाया जा सकता है (चित्र 2a) । इन टुकड़ों के आणविक भार lysine और arginine के सी-टर्मिनल से सट गए अंशों के सैद्धांतिक आणविक भार के साथ बारीकी से कतार में थे, क्रमशः. इसके अलावा, V8 को अपने सट फार्म में कनवर्ट किए गए अग्रदूत सब्सट्रेट, ७६९.७८ दा और ७५५.६२ दा (चित्रा बी8), जो क्रमशः glutamic एसिड और एसपारटिक एसिड के सैद्धांतिक एम/जेड मिलान के आणविक भार के साथ । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस विधि को सफलतापूर्वक मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ चिढ़ा विशिष्टता की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

माउस फेफड़ों के अर्क का उपयोग कर अलग पीएच स्तर पर सब्सट्रेट विशिष्टता का मूल्यांकन

इस तकनीक के फायदों में से एक यह था कि नमूनों की एक बड़ी संख्या एक साथ कार्रवाई की जा सकती है । इस अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि सब्सट्रेट विशिष्टता पीएच स्तर के अनुसार बदल (चित्रा 3) । अम्लीय स्थितियों में (चित्र 3 बी; पीएच 5), एक सट टुकड़ा का आणविक भार ७७०.१३ दा था और ८२६.६६ डा. इन परिणामों से संकेत दिया कि फेफड़े के ऊतकों को glutamic एसिड और tryptophan के सी-टर्मिनस पर सट करने की क्षमता के साथ शामिल है । के रूप में pH का स्तर धीरे से वृद्धि हुई, glutamic एसिड और tryptophan से सट टुकड़े की चोटियों धीरे-धीरे कमी आई है, जबकि arginine और lysine द्वारा सट टुकड़े की चोटियों धीरे-धीरे वृद्धि हुई (चित्रा 3सी, डी; पीएच 7 और 9). इन परिणामों से संकेत दिया कि फेफड़ों निकालने दो या अधिक है कि विभिंन इष्टतम पीएच और दरार विशिष्टता थी ।

Figure 1
चित्र 1: को छेड़ने की विशिष्टता का पता लगाने के लिए स्कीमा. (क) iminobiotin की संरचना-विशिष्टता को छेड़ने के लिए लेबल सब्सट्रेट । (ख) सब्सट्रेट्स iminobiotin था, एक पॉलीथीन ग्लाइकोल स्पेसर, और एक सट एमिनो एसिड साइट. (ग) iminobiotin-लेबल किए गए सब्सट्रेट्स का स्पेक्ट्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विधि का मूल्यांकन करने के लिए एक शुद्ध एंजाइम का उपयोग कर विशिष्टता का निर्धारण । (क) iminobiotin के लिए स्पेक्ट्रा-लेबल TPCK-trypsin के साथ इलाज किया सब्सट्रेट. ८३९.८१ और ७९६.७६ चोटियों lysine और arginine के सी-टर्मिनल की ओर, क्रमशः दरार द्वारा उत्पन्न विखंडन के सैद्धांतिक आणविक भार मिलान किया । (B) iminobiotin-लेबल किए गए सब्सट्रेट के साथ V8 को छेड़ने के लिए स्पेक्ट्रा । ७६९.७८ और ७५५.६२ चोटियों glutamic एसिड और एसपारटिक एसिड, क्रमशः के सी-टर्मिनल पक्ष में दरार द्वारा उत्पन्न विखंडन के सैद्धांतिक आणविक वजन का मिलान किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: विधि का मूल्यांकन करने के लिए ऊतक निष्कर्षों का उपयोग कर विशिष्टता का निर्धारण । iminobiotin के लिए स्पेक्ट्रा-लेबल एक फेफड़े के ऊतकों को निकालने के साथ इलाज किया सब्सट्रेट । इन स्पेक्ट्रा दिखाएं चोटियों (एक) पीएच 3, (ख) पीएच 5, (सी) पीएच 7, और (घ) पीएच 9 में प्राप्त की । (E) iminobiotin-लेबल किए गए सब्सट्रेट ऊतक निकालने के साथ गर्म उपचार के लिए गैर विशिष्ट पाचन का मूल्यांकन करने के लिए निष्क्रिय कर दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक्स अग्रदूत सट फॉर्म
जी ८८६.५८ ६९७.५८
ए ९००.६० ७११.६०
एस ९१६.५९ ७२७.५९
पी ९२६.६१ ७३७.६१
वी ९२८.६३ ७३९.६३
टी ९३०.६१ ७४१.६१
सी १००३.५७ ८१४.५७
मैं १०१३.६४ ८२४.६४
एल ९४२.६४ ७५३.६४
एन १०१४.६० ८२५.६०
डी ९४४.५९ ७५५.५९
Q ९५७.६२ ७६८.६२
K १०२८.६५ ८३९.६५
ई ९५८.६० ७६९.६०
मी १०३१.६० ८४२.६०
एच ९६६.६२ ७७७.६२
एफ ९७६.६३ ७८७.६३
आर ९८५.६६ ७९६.६६
वाई ९९२.६२ ८०३.६२
W १०१५.६४ ८२६.६४
*: डी-Ser-Xaa फार्म

तालिका 1: iminobiotin के सैद्धांतिक आणविक वजन-लेबल सब्सट्रेट और की उंमीद आणविक वजन के टुकड़े । तारांकन (*) पॉलीथीन स्पेसर और सट एमिनो एसिड के बीच डी-serine के अलावा संकेत ।

Xaa: Gly, ाला, Ser, प्रो, वैल, आला, लियू, एएसपी, Gln, Glu, आमा, Phe, Arg, Tyr
चरण Fmoc-यौगिक
1 Fmoc-मिनी-PEG3-OH
2 Fmoc-Xaa-OH
3 Fmoc-मिनी-PEG3-OH
4 Fmoc-मिनी-PEG3-OH
5 Iminobiotin
Xaa: Cys, इले, Asn, Lys, मुलाकात, टीआरपी
चरण Fmoc-यौगिक
1 Fmoc-मिनी-PEG3-OH
2 Fmoc-Xaa-OH
3 Fmoc-D-Ser (tBu)-OH
4 Fmoc-मिनी-PEG3-OH
5 Fmoc-मिनी-PEG3-OH
6 Iminobiotin

तालिका 2: क्रमिक सूची सब्सट्रेट संश्लेषण के लिए उपयोग किया गया एजेंट की.

फोन संरचना
9 ५० एमएम Tricine युक्त ०.१ मीटर NaCl और 10 एमएम CaCl2
7 ५० मिमी Tris-एचसीएल युक्त ०.१ मीटर NaCl और 10 एमएम CaCl2
5 ५० एमएम सोडियम एसीटेट युक्त ०.१ मीटर NaCl और 10 एमएम CaCl2
3 ५० मिमी साइट्रिक एसिड युक्त ०.१ एम NaCl और 10 मिमी CaCl2

तालिका 3: उपयोग किए गए बफ़र समाधानों की रचनाएं ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए कच्चे तेल ऊतक निष्कर्षों से व्युत्पंन नमूनों में विशेष रूप से की पहचान और आसानी से कई नमूना प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया जा सकता है । विशेष रूप से, हम पीएच हेरफेर सब्सट्रेट विशिष्टता में परिवर्तन का कारण है ।

avidin-बायोटिन परिसर (एबीसी) विधि है, जो व्यापक रूप से अपनी बाध्यकारी विशिष्टता के कारण जैव रसायन में इस्तेमाल किया गया है, हमारे प्रोटोकॉल में उपयोग किया गया था । एबीसी के मजबूत संबंध के कारण, बायोटिन के लिए avidin के बंधन लगभग अपरिवर्तनीय है । ABCs के लिए अपनत्व शुद्धि इसलिए अत्यधिक अकुशल है. इस कारण से, हम रिपोर्ट करते हैं कि बायोटिन-लेबल वाले सब्सट्रेट के लिए वसूली दर कम होने की उम्मीद है. इस अध्ययन में, हम केवल एक कम पीएच स्तर के लिए रेफरेंस का इस्तेमाल किया; हालांकि, deglycosylated avidin-राल13 या monomeric avidin-राल14 भी बायोटिन-लेबल सब्सट्रेट शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि अलग प्रयोगात्मक प्रणालियों और अनुप्रयोगों के लिए समायोजित किया जा सकता है; मन में असर है कि मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर मात्रात्मक विश्लेषण का संचालन करने में असमर्थ है. एक बार सब्सट्रेट विशिष्टता निर्धारित किया गया है, यह spectrometric परख, fluorometric परख, या प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग कर ठहराव प्रदर्शन करने के लिए बेहतर हो सकता है.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अंशांकन इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम था । ऐसे मामलों में जहां समान आणविक भार के साथ सब्सट्रेट का पता लगाया जाता है, परिणामों की सटीकता को पूर्ववर्ती के आणविक भार को जोड़कर सुधारा जा सकता है.

के बाद से एंजाइम प्रतिक्रिया समय के साथ बढ़ाया है, यह प्रतिक्रिया समय का विस्तार करने के लिए संभव है अगर एंजाइम का पता नहीं लगाया जा सकता. हालांकि, दे प्रतिक्रिया की ओर प्रतिक्रियाओं में अधिक से अधिक 24 एच परिणाम के लिए जारी है कि अवांछित चोटियों उत्पन्न करते हैं । इसलिए, यह करने के लिए 18 घंटे के लिए प्रतिक्रिया बाहर ले या गर्मी उपचार नमूनों का उपयोग कर परीक्षण को नियंत्रित करने के लिए सलाह दी जाती है । यह प्रक्रिया trypsin के कुछ femtomol के भीतर करने के लिए चिढ़ा विशिष्टता निर्धारित कर सकता है ।

अंत में, हम एक सुविधाजनक तरीका है कि iminobiotin-लेबल का उपयोग करता है को छेड़ने विशिष्टता मूल्यांकन सब्सट्रेट परिचय । इस विधि के कई नमूनों की एक साथ प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है और करने के लिए जांच छेड़ने सरल इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

यह काम Nihon फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट द्वारा Nihon फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी (२०१६) और MEXT KAKENHI ग्रांट नंबर JP17854179 के हिस्से में सपोर्ट किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)
aminomethyl]phenoxy resin)		 Watanabe Chemical Co., Ltd. A00102
N,N-dimethylformamide (DMF) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00185
piperidine Watanabe Chemical Co., Ltd. A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) WAKO Chemical 209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00014
diisopropylethylamine (DIPEA) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00030
triisopropylsilane (TIS) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00170
ethanedithiol (EDT) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00057
trifluoroacetic acid (TFA) Millipore S6612278 403
acetonitrile Kokusan Chemical 2153025
C18 cartridge column Waters WAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl ether WAKO Chemical 168-11805 Triton X-100
mixing homogenizer Kinematica PT3100 polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 Nakarai Chemical 094-09
glycerol Nakarai Chemical 170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin Sigma-Aldrich T1426
dimethyl sulfoxide (DMSO) WAKO Chemical 043-07216
streptavidin sepharose GE Healthcare 17-511-01
ZipTipC18 Millipore ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich C2020
MALDI-TOF mass spectrometry Bruker Daltonics, Germany autoflex
2-iminobiotin Sigma-Aldrich I4632
Fmoc-amino acids Watanabe Chemical Co., Ltd.

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References

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Yamamoto, H., Sawaguchi, Y., Kimura, M. The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes. J. Vis. Exp. (135), e57469, doi:10.3791/57469 (2018).

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