Bewertung der Auswirkungen der Proteinaggregation auf zellulären oxidativen Stress in der Hefe

Zusammenfassung

Proteinaggregation entlockt zellulären oxidativen Stress. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Überwachung der intrazellulären Staaten von Amyloidogenic Proteinen und den oxidativen Stress zugeordnet werden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der Ansatz dient zur Untersuchung des Verhaltens von löslichen und Aggregation neigende Varianten des β-Amyloid Peptids.

Zusammenfassung

Protein misfolding und Aggregation in Amyloid Konformationen haben an der Entstehung und Progression von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Allerdings gibt es noch wenig Informationen über wie unlöslichen Protein Aggregate ihre toxische Wirkung in Vivoausüben. Einfaches Modell der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen, wie Bakterien und Hefen, trugen wesentlich zur unsere gegenwärtigen Verständnis der Mechanismen hinter der intrazellulären Amyloid Bildung, Aggregate Ausbreitung und Toxizität. In diesem Protokoll bezeichnet man die Verwendung von Hefe als ein Modell, um die Beziehung zwischen der Entstehung von Protein-Aggregate und ihre Auswirkungen auf die zellulären oxidativen Stress zu sezieren. Die Methode verbindet die Erkennung der intrazellulären löslich/aggregiert Bundesstaat ein Amyloidogenic Protein mit der Quantifizierung der zellulären oxidativen Schäden, die aus ihren Ausdruck mit Durchflusszytometrie (FC). Dieser Ansatz ist einfach, schnell und quantitative. Die Studie zeigt die Technik durch Korrelation der zellulären oxidativen Stress, verursacht durch eine große Anzahl von Amyloid-β-Peptid-Varianten mit ihren jeweiligen inneren Aggregation Neigungen.

Einleitung

Proteostase ist eine wesentliche Determinante des Zellprozesse Fitness und Alterung. In den Zellen bleibt Protein Homöostase durch anspruchsvolle Protein-Qualitätskontrolle, die Netzwerke zielte darauf ab, sicherzustellen, das richtige umfaltung fehlgefaltete Protein Konformere durch Chaperone und/oder ihre gezielten Proteolyse mit mehreren gut erhaltenen Mechanismen^{1 ,2,3,4,5}. Eine große Anzahl von Studien unterstützen die Verbindung zwischen der Entstehung und Progression von ein breites Spektrum von Erk....

Protokoll

1. S. Cerevisiae Kulturen und Protein-Expression

Hinweis: Aβ-Varianten weisen unterschiedliche relative Aggregation Neigungen aufgrund einer Mutation in einem einzigen Rückstand an Position 19 (Phe19) des Aβ42 Peptid (Abbildung 1A). Diese Peptid-Varianten sind mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP), fungiert als eine Aggregation Reporter (Abbildung 1)²⁹versehen.

1. Plasmide, die Codierung für 20 Aβ42-GFP-Varianten in Hefezellen mit einem BY4741 elterlichen Hintergrund (MATa seine3Δ1 Leu2Δ0 traf15Δ0 ura3Δ0....

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Sammlung von 20 Varianten des Peptids Aβ42 zu beschäftigen, wo Phe19 auf alle natürliche proteinogene Aminosäuren²⁸mutiert worden ist. Die theoretische Aggregation Neigungen dieser Proteine können mit zwei verschiedenen bioinformatische Algorithmen (AGGRESCAN und TANGO^31,32) analysiert werden. In beiden Fällen macht diese Analyse eine progressive Abstufung der Aggregati.......

Diskussion

Eine Vielzahl von Krankheiten ist die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine in zellulären Einlagen^6,7,8,33verbunden. Wurden viele Anstrengungen unternommen, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die das Auftreten dieser Krankheiten mit rechnerische Ansätze, die nicht ins Konto proteinkonzentrationen nehmen, auslösen oder in-vitro- Ansätze, in denen die Proteinkonzentration währen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hefezellen BY4741	ATCC	201388	Genotyp: MATa his3Δ 1 leu2Δ 0 met15Δ 0 ura3Δ 0
pESC(-Ura)-Plasmid	Agilent Genomics	217454	Hefeexpressionsplasmid mit einem Gal-Promotor. Wählbarer Marker URA3
Hefe Synthetisches Drop-out-Medium Ergänzungen	Sigma	Y1501	Pulver
Hefe Stickstoff Base ohne Aminosäuren	Sigma	Y0626	Pulver
Raffinose	Sigma	R7630	Pulver
Glukose	Sigma	G7021	Pulver
Galaktose	Sigma	G0750	Pulver
Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Lösung 10X
CellROX Deep Red Reagenz	Life Technologies	C10422	Fluoreszenzsensor mit freien Radikalen, der im reduzierten Zustand nicht fluoreszierend ist und bei Oxidation durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eine helle Fluoreszenz aufweist, mit Absorptions-/Emissionsmaxima bei 644/665 nm.
Reagenz zur Y-PER-Proteinextraktion	Thermo Scientific	78990	Flüssiger Zelllysepuffer
Acrylamid/Bis-Acrylamid	Sigma	A6050	Lösung
Bradford-Farbstoffreagenz	Bio-Rad	5000205	Farbstoffreagenz zur einstufigen Bestimmung der Proteinkonzentration
beta;-Amyloid-Antikörper 6E10	BioLegend	803001	Maus IgG1. Das Epitop liegt innerhalb der Aminosäuren 3-8 von Beta-Amyloid (EFRHDS).
Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat für Ziegen	Bio-Rad	1721011
Membran Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Vorgemischtes, gebrauchsfertiges chemilumineszierendes HRP-Nachweisreagenz
Phenylmethansulfonylfluoridlösung (PMSF)Sigma		93482	Proteaseinhibitor. Gelöst bei 0,1 m in Ethanol
FACSCanto Durchflusszytometer	BD Biosciences	657338	Ausgestattet mit einem 488  nm blauer Laser für die Detektion von GFP und 635  nm roter Laser / 530/30 nm BP-Filter und 660/20 BP-Filter
Mini Trans-Blot Elektrophorese Transferzelle	Bio-Rad	1703930	Proteintransfersystem
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems	Bio-Rad	1658000FC	Elektrophoresesystem