Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Zusammenfassung

Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.

Zusammenfassung

Krebszellen haben routinemäßig zweidimensional (2D) auf einer Kunststoffoberfläche kultiviert worden. Diese Technik, allerdings fehlt die echte Umgebung eines Tumors Masse in Vivoausgesetzt ist. Solide Tumoren wachsen nicht wie ein Blatt aus Kunststoff befestigt, sondern vielmehr als eine Sammlung von klonalen Zellen in eine dreidimensionale (3D) Platz Interaktion mit ihren Nachbarn und mit verschiedenen räumlichen Eigenschaften, wie z. B. die Unterbrechung des normalen zellulären Polarität. Diese Wechselwirkungen verursachen 3D-kultivierte Zellen, morphologische und zelluläre Eigenschaften zu erwerben, die für in Vivo Tumoren relevant ist. Darüber hinaus ein Tumor Masse steht in direktem Kontakt mit anderen Zelltypen wie Stromazellen und immun-Zellen sowie die extrazelluläre Matrix aus anderen Zelltypen. Die Matrix hinterlegt besteht aus Makromolekülen wie Kollagen und Fibronektin.

In einem Versuch, die Übersetzung von Forschungsergebnissen in der Onkologie von Bank zu Bett zu erhöhen haben viele Gruppen begonnen, die Verwendung von 3D Modellsysteme in ihre Droge Entwicklungsstrategien zu untersuchen. Diese Systeme werden gedacht, um mehr physiologisch relevant sein, weil sie versuchen, die komplexe und heterogene Umgebung eines Tumors zu rekapitulieren. Diese Systeme können jedoch sehr komplex sein, und zwar offen für Wachstum in 96-Well-Formate, und einige jetzt auch in 384, sie bieten nur wenige Möglichkeiten für groß angelegte Wachstum und Screening. Dies beobachtete Lücke führte zu die Entwicklung von Methoden, die hier im Detail zu Kultur Tumor Sphäroide in einer Hochdurchsatz-Kapazität im Jahre 1536-Well Platten beschrieben. Diese Methoden stellen einen Kompromiss um die hochkomplexen Matrix-basierte Systeme, die schwer zu Bildschirm und herkömmlichen 2D Assays sind. Eine Vielzahl von Krebszelllinien beherbergen verschiedene genetische Mutationen werden erfolgreich gezeigt, zusammengesetzte Wirksamkeit von kuratierten Bibliotheksbenützung Verbindungen gezielt die Mitogen-Activated Protein Kinase oder MAPK Weg zu untersuchen. Sphäroid Kultur Antworten sind dann im Vergleich zu der Reaktion der Zellen gezüchtet in 2D, und unterschiedliche Aktivitäten berichtet. Diese Methoden bieten ein einzigartiges Protokoll für zusammengesetzte Aktivität in einer Hochdurchsatz-3D-Umgebung testen.

Einleitung

In den letzten zehn Jahren haben immer mehr Studien die Verwendung von 3D zellmodelle Kultur, Konzepte zu verstehen, die nicht vollständig zusammengefaßt sind, durch den Anbau von Zellen in 2D auf Kunststoff umgesetzt. Beispiele für diese Konzepte sind der Wechsel in normalen Epithelzelle Polarität¹ wo die räumliche Orientierung der apikale und basale Schichten von Zellen sind verloren, als auch die Rolle der extrazellulären Matrix bei der Regulierung der Überlebens- und Zelle Schicksal. Onkologie-Forschung hat insbesondere 3D-Modelle verwendet, um die grundlegende Biologie von Krebszellen und die Unterschiede zwischen 2D und 3D Zelle Kultur Systeme^3,4zu verstehen. Die Entwicklung der anspruchsvollere Zelle Kulturtechniken und ihre weitere Anpassung an Multi-gut Formate hat die Suche nach neuen Medikamenten in 3D Einstellungen ermöglicht. Im Gegensatz zu Zellen 2D Bedingungen, 3D-Modelle von Tumoren Palette in ihrer Komplexität von zellulären Schichtsysteme⁵ Single-Cell-Typ Kugeln in verschiedenen Größen, angebaut auf komplexe multi-Zell-Typ Kugeln^{6,7, 8}. die Entdeckung von neuartigen Verbindungen oder Biologics, die potent Zelltod in diesen Systemen 3D-Modell induzieren ist daher von großem Interesse in Drogen-Entwicklung-Kampagnen. Endpunkte dieser Assays sind oft identisch mit denen in 2D Kulturen, Änderungen in der Zellproliferation beurteilen durchgeführt, sondern in einer mehr physiologisch relevanten Umgebung durchgeführt, können sie das wahre Niveau der Abhängigkeit des Zielgens oder Weg zu offenbaren verhört.

Da oben eingeführt, wurde eine Vielzahl von Modellsystemen entwickelt, um die Droge Reaktionen in 3D Culture Systeme zu studieren, aber die meisten verwenden entweder 96 oder 384-Well Mikrotiterplatten und sind nicht leicht anpassbar an häufig verwendeten im Hochdurchsatz-screening (HTS) Formate Drogen-Entdeckung-Screening-Kampagnen. Solche Systeme umfassen die Verwendung von hängenden Tropfen Technologien, Sphäroid Kulturen, pulsierende Zellen mit magnetischen Partikeln induzieren Levitation und Kulturen unter Einbeziehung natürlicher oder synthetischer Gele wie Kollagen, Matrigel oder Polyethylenglykol (PEG)² . Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierte Methoden einer zuvor entwickelten Technik, 3D Sphäroid Kulturen von etablierten Zelllinien in einem Format von 1536-Well-Platte zu produzieren. In diesem Protokoll wird ein hoch definierte Medium die verhindert, die Befestigung der normalerweise adhärente Zellen Linien^{9 dass}verwendet. Dieses System hat Grenzen (d. h., es kann nicht vollständig rekapitulieren, ein komplexes Modellsystem von Krebs), aber dennoch, diese Tests ermöglichen eine Hochdurchsatz-Screening von großen Sammlungen von kleinen Molekülen und quer Vergleiche der Medikamente zwischen 2D und 3D Kulturen gegen eine Vielzahl von Zell-Linien und Verbindungen.

Die Zell-Linien ausgewählt, um den Methoden in diesem Artikel zeigen alle Hafen Mutationen in Genen, die im Zusammenhang mit der MAPK Signalweg, einen Pfad hoch Dysregulated bei Krebs ist und für welche viele Therapeutika stehen zur Verfügung. Viele der Linien verfügen über Aktivierung von Onkogenen Mutationen in der Kirsten Ratte Sarkom-Virus auch genannt KRAS, Neuroblastom RAS oder NRB Harvey Ratte Sarkom Virus Onkogen oder HRAS und der damit verbundenen Kinasen rasant beschleunigt Fibrosarcomas, auch bekannt als RAFs. Neuere Literatur legt nahe, dass die Inhibitoren der verschiedenen Knoten dieses Pfades eindeutig wirksamer in eine Teilmenge der Zell-Linien beim Anbau unter 3D Bedingungen^{9,10 sind}. Eine Studie hat herausgefunden, dass wenn Krebszellen mit aktiven RAS in 3D gezüchtet wurden, sie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber MAPK-Inhibitoren zeigten, und ferner, dass dieser Ansatz konnte Wege identifizieren und gezielt Inhibitoren, die in der traditionellen 2D verpasst Einstellung. Das Ziel dieser Studie ist es, die Methoden verwendet, um diese Zelllinien Kultur zu präsentieren, und weiter, um das Differential zu demonstrieren Reaktionen auf diese Inhibitoren, die Sie beachten können, nur bei Verwendung von 3D zellsystemen Kultur.

Protokoll

(1) Kultivierung von 1536-Well 3D Tumor Sphäroide

1. Bereiten Sie einen frischen 3D Tumor Sphäroid mittlerer Stiel (Zelle Medium + ko-Serum Ersatz + Insulin-Transferrin-Selen) indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM/F12): 1 X Penicillin/Streptomycin, 10 ng/mL des menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 20 ng/mL des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 0,4 % Rinderserumalbumin (BSA) (Teil V), 1 x Insulin-Transferrin-Selen und 1 % Knockout (KO) Serum Ersatz (nicht Frost-Tau-wechseln).
2. Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenverschluss Filter-System.
3. Lösen Sie die Krebs-Zelllinien, die nach empfohlenen Routine Kulturbedingungen, aus den traditionellen Zellkultur Kolben durch Waschen sie gewachsen sind 3 X mit 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und einen angemessenen Betrag von 0,25 % Trypsin (1 mL hinzufügen pro 5 cm²) für 5 min, eine dünne Schicht über die Zellen zu erstellen. Neutralisieren Sie die Trypsin mit 5 x die Menge des Mediums, enthält das Serum zu und fahren Sie mit der Zellen zählen. Z. B. 25 mL Medium für 5 mL Trypsin.
4. Passen Sie die Konzentration der Zelle zu 62,5 x 10⁴ Zellen/mL Lösung um insgesamt 500 Zellen pro Bohrloch in 8 µL Sphäroid Medium in der 1536-Well-Platten Gewebe-Kultur-behandelten Samen.
5. Samen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank die Zellen mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette mit einer peristaltischen Pumpe-basierendes System. Zwischen verschiedenen Zelllinien, spülen Sie den Schlauch von der Kassette mit 1 x PBS und 70 % Ethanol für 10 s.
6. Alternativ, Samen der Zellen unter Verwendung eines liquiden Handlers befindet sich innerhalb eines HEPA-Filtern Raumes mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette und einer peristaltischen Pumpe oder eine angehängte Spritzenpumpe, abhängig von der Anzahl der Platten pro Zelle Zeile benötigt.
7. Versiegeln Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Haftplatte Dichtung entweder manuell oder mit Platte Siegler.
8. Legen Sie die Platten in einem drehenden Inkubator gesetzt bei 10 min und 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO₂) und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit. Lassen Sie die Sphäroide Formular für 3-d.

2. Kultivierung von 1536-Well 2D Krebs Linien

Hinweis: Die 1536-Well-2D Krebs-Linien sollten 24 h vor der Zugabe der Verbindung zu den 3D Platten kultiviert werden.

1. 2D Krebs Zelle Medium vorzubereiten, indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL einer geeigneten Wachstumsmedium für die ausgewählten Positionen: 1 x Penicillin/Streptomycin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS).
2. Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenverschluss Filter-System.
3. Lösen Sie die Krebs-Zelllinien, die nach empfohlenen Routine Kulturbedingungen, aus den traditionellen Zellkultur Kolben durch Waschen sie gewachsen sind 3 X mit 1 x PBS und einen angemessenen Betrag von 0,25 % Trypsin (1 mL pro 5 cm²) für 5 min zum Hinzufügen Erstellen Sie eine dünne Schicht über die Zellen. Neutralisieren Sie die Trypsin mit 5 x die Menge des Mediums, enthält das Serum zu und fahren Sie mit der Zellen zählen. Z. B. 25 mL Medium für 5 mL Trypsin.
4. Passen Sie die Konzentration der Zelle zu 62,5 x 10⁴ Zellen/mL Lösung um insgesamt 500 Zellen pro Bohrloch in 8 µL kompletten Medium in Gewebe-Kultur-behandelten 1536-Well-Platten Samen.
5. Samen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank die Zellen mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette mit einer peristaltischen Pumpe-basierendes System. Zwischen den verschiedenen Zelllinien, spülen Sie den Schlauch von der Kassette mit 1 x sterile PBS und 70 % Ethanol für 10 s.
6. Alternativ, Samen der Zellen unter Verwendung eines flüssigen Handlers befindet sich in einem HEPA-Filtern Robotik-Raum mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette und einer peristaltischen Pumpe oder die angehängte Spritzenpumpe, abhängig vom Umfang der Platten pro Zelle Zeile benötigt.
7. Versiegeln Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Haftplatte Dichtung entweder manuell oder mit Platte Siegler.
8. Legen Sie die Platten in einem drehenden Inkubator auf 10 u/min und 37 ° C für 24 h vor dem zusammengesetzten Zusatz, mit 5 % CO₂ % bis 95 % Relative Luftfeuchtigkeit eingestellt.

(3) zusammengesetzte Zusatz

1. Bereiten Sie 8-Punkt, 3-fach serielle Verdünnungen von MAPK Inhibitoren in 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) sich auf ein Liquid-Handling-Roboter mit einer 10 mM höchste Konzentration. Die Proteasom-Inhibitor Bortezomib dient als Positivkontrolle für eine komplette Zelle töten, um den dynamischen Bereich des Tests zu bestimmen.
2. Quick-Spin All assay und zusammengesetzte Platten 100 X g Kondenswasser sammeln. Entfernen Sie die selbstklebende Dichtung aus jeder Platte und legen Sie einen Teller auf ein akustisches Dispenser Setup Hinzufügen von insgesamt 8 nL von jeder Verbindung/Verdünnung repräsentieren eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO pro Bohrloch und eine Top Verbindung Dosis von 10 µM.
3. Nach der Zugabe der Verbindung abgeschlossen ist, Deckel nach Maß, Edelstahl-Zelle Kultur verhindert Verdunstung auf dem Teller und legen Sie die Platte in eine Spinnerei Inkubator bei 37 ° C für 5 d, mit 5 % CO₂ % bis 95 % Relative Luftfeuchtigkeit.

4. Erkennung Reagens Hinzufügung und der Erwerb von Raw-Daten

1. Wärmen Sie eine angemessene Lautstärke eine Zelle-Lyse-Reagenz mit Luciferin um Änderungen in Adenin Adenosintriphosphat (ATP) und damit auch Änderungen in der Zellproliferation bei Raumtemperatur oder in einem 37 ° C Wasserbad zu erkennen vor. Fügen Sie insgesamt 3 µL des Reagenz Erkennung in jede Vertiefung mittels einer peristaltischen Pumpe und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 15 min.
2. Erfassen Sie die Lumineszenz auf einer Platte Luminometer.

5. Datenverarbeitung

1. Die raw-Daten aus dem Gerät zu extrahieren und alle Felder mit Testverbindungen auf den Durchschnitt aller Brunnen mit DMSO als neutrale Kontrolle allein zu normalisieren. Berechnen Sie aus diesem Wert die prozentuale Wachstumshemmung von jeder Verbindung. Dies erfolgt über die Formel Funktion in Microsoft Excel wo f (X) = {(probieren Sie relative leichte Werteinheiten (RLUs) / (Mittelwert DMSO RLUs) * 100)}.
2. Generieren Sie die Dosis-Wirkungs-Kurven und hemmenden IC50s durch grafische Darstellung der Werte der normalisierten Daten aus Schritt 5.1 gegen die compoundkonzentration mit einem Grafik-Programm.
   Hinweis: Wir analysieren die Daten mithilfe von Helios, eine interne NIBR-Software-Werkzeug. Um diese Funktion zu vervollständigen, haben wir das Analysewerkzeug Nichtparametrische Kurve ausgewählt.

Ergebnisse

Eine Vielzahl von etablierten Krebszelle, die Linien bekannt, auch unter 2D Kulturbedingungen wachsen mit den beschriebenen Methoden hier getestet wurden. Repräsentative Bilder aus einer Vielzahl von MAPK mutierten Krebs Zell-Linien (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS und KNS-62:HRAS) sind in Abbildung 1zu sehen. Diese Bilder zeigen, dass zwar die Zelllinien verschiedenen Morphologien, jeweils 3D-Strukturen in den Assay 1536-Well-Platten gebildet.

Diskussion

Die hier vorgestellten Methoden zeigen ein detailliertes Protokoll wie Tumor Sphäroide in 1536-Well-Platten für groß angelegte Verbindung Vorführungen zu produzieren. Diese Methoden wurden zunächst von der Arbeit am National Cancer Institute wo Tumor Sphäroide in niedrigen Durchsatz Assays in 6-Well und 96-Well Platten Fragen zu genetischen Abhängigkeiten und zusammengesetzte Empfindlichkeit^13, angebaut wurden angepasst ^{14 , 15}....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagents
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Als fertige Lösung gekauft. Es wurde festgestellt, dass dieses Rezept im Vergleich zu anderen Anbietern bevorzugt wird.
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Als vorbereitete Lösung gekauft.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Gekauft als vorbereitete Lösung.
Fötales Kälberserum (FBS)	Seradigm	1500-500	Gekauft als fertige Lösung.
1x 0,25% Trypsin mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Als zubereitete Lösung gekauft.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Gekauft als Fertiglösung.
10 ng/ml humaner basischer Fibrobast-Wachstumsfaktor (bFGF)	Sigma	F0291	In sterilem Wasser resuspendieren.
20 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspendieren in sterilem Wasser.
0,4 % Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspendiert in sterilem PBS und Filter.
1x Insulintransferrin Selen (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Ersatz	Gibco	10828-028	vor Gebrauch frisch zugeben.
100% Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Gekauft als fertige Lösung.
Verbrauchsmaterialien
	BioTek	294085
sterile TC-Platten mit 1536 Well (weiß)	Corning	3727
sterile TC-Platten mit 1536 Well (schwarz)	Corning	3893
	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives Dichtungen	ThermoFisher	AB0718
Spinning-Inkubator	LiCONiC
Edelstahldeckel	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Akustischer Dispensator	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Schlauchpumpe - Multidrop Combi	ThermoFisher
- Multiflow FX	BioTek