Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Summary

Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.

Abstract

Krebszellen haben routinemäßig zweidimensional (2D) auf einer Kunststoffoberfläche kultiviert worden. Diese Technik, allerdings fehlt die echte Umgebung eines Tumors Masse in Vivoausgesetzt ist. Solide Tumoren wachsen nicht wie ein Blatt aus Kunststoff befestigt, sondern vielmehr als eine Sammlung von klonalen Zellen in eine dreidimensionale (3D) Platz Interaktion mit ihren Nachbarn und mit verschiedenen räumlichen Eigenschaften, wie z. B. die Unterbrechung des normalen zellulären Polarität. Diese Wechselwirkungen verursachen 3D-kultivierte Zellen, morphologische und zelluläre Eigenschaften zu erwerben, die für in Vivo Tumoren relevant ist. Darüber hinaus ein Tumor Masse steht in direktem Kontakt mit anderen Zelltypen wie Stromazellen und immun-Zellen sowie die extrazelluläre Matrix aus anderen Zelltypen. Die Matrix hinterlegt besteht aus Makromolekülen wie Kollagen und Fibronektin.

In einem Versuch, die Übersetzung von Forschungsergebnissen in der Onkologie von Bank zu Bett zu erhöhen haben viele Gruppen begonnen, die Verwendung von 3D Modellsysteme in ihre Droge Entwicklungsstrategien zu untersuchen. Diese Systeme werden gedacht, um mehr physiologisch relevant sein, weil sie versuchen, die komplexe und heterogene Umgebung eines Tumors zu rekapitulieren. Diese Systeme können jedoch sehr komplex sein, und zwar offen für Wachstum in 96-Well-Formate, und einige jetzt auch in 384, sie bieten nur wenige Möglichkeiten für groß angelegte Wachstum und Screening. Dies beobachtete Lücke führte zu die Entwicklung von Methoden, die hier im Detail zu Kultur Tumor Sphäroide in einer Hochdurchsatz-Kapazität im Jahre 1536-Well Platten beschrieben. Diese Methoden stellen einen Kompromiss um die hochkomplexen Matrix-basierte Systeme, die schwer zu Bildschirm und herkömmlichen 2D Assays sind. Eine Vielzahl von Krebszelllinien beherbergen verschiedene genetische Mutationen werden erfolgreich gezeigt, zusammengesetzte Wirksamkeit von kuratierten Bibliotheksbenützung Verbindungen gezielt die Mitogen-Activated Protein Kinase oder MAPK Weg zu untersuchen. Sphäroid Kultur Antworten sind dann im Vergleich zu der Reaktion der Zellen gezüchtet in 2D, und unterschiedliche Aktivitäten berichtet. Diese Methoden bieten ein einzigartiges Protokoll für zusammengesetzte Aktivität in einer Hochdurchsatz-3D-Umgebung testen.

Introduction

In den letzten zehn Jahren haben immer mehr Studien die Verwendung von 3D zellmodelle Kultur, Konzepte zu verstehen, die nicht vollständig zusammengefaßt sind, durch den Anbau von Zellen in 2D auf Kunststoff umgesetzt. Beispiele für diese Konzepte sind der Wechsel in normalen Epithelzelle Polarität¹ wo die räumliche Orientierung der apikale und basale Schichten von Zellen sind verloren, als auch die Rolle der extrazellulären Matrix bei der Regulierung der Überlebens- und Zelle Schicksal. Onkologie-Forschung hat insbesondere 3D-Modelle verwendet, um die grundlegende Biologie von Krebszellen und die Unterschiede zwischen 2D und 3D Zelle Kultur Sy....

Protocol

(1) Kultivierung von 1536-Well 3D Tumor Sphäroide

1. Bereiten Sie einen frischen 3D Tumor Sphäroid mittlerer Stiel (Zelle Medium + ko-Serum Ersatz + Insulin-Transferrin-Selen) indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM/F12): 1 X Penicillin/Streptomycin, 10 ng/mL des menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 20 ng/mL des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 0,4 % Rinderserumalbumin (BSA) (Teil V), 1 x Insulin-Transferrin-Selen und 1 % Knockout (KO) Serum Ersatz (nicht Frost-Tau-wechseln).
2. Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenvers....

Results

Eine Vielzahl von etablierten Krebszelle, die Linien bekannt, auch unter 2D Kulturbedingungen wachsen mit den beschriebenen Methoden hier getestet wurden. Repräsentative Bilder aus einer Vielzahl von MAPK mutierten Krebs Zell-Linien (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS und KNS-62:HRAS) sind in Abbildung 1zu sehen. Diese Bilder zeigen, dass zwar die Zelllinien verschiedenen Morphologien, jeweils 3D-Strukturen in den Assay 1536-Well-Platten gebildet.

Discussion

Die hier vorgestellten Methoden zeigen ein detailliertes Protokoll wie Tumor Sphäroide in 1536-Well-Platten für groß angelegte Verbindung Vorführungen zu produzieren. Diese Methoden wurden zunächst von der Arbeit am National Cancer Institute wo Tumor Sphäroide in niedrigen Durchsatz Assays in 6-Well und 96-Well Platten Fragen zu genetischen Abhängigkeiten und zusammengesetzte Empfindlichkeit^13, angebaut wurden angepasst ^{14 , 15}........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Als fertige Lösung gekauft. Es wurde festgestellt, dass dieses Rezept im Vergleich zu anderen Anbietern bevorzugt wird.
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Als vorbereitete Lösung gekauft.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Gekauft als vorbereitete Lösung.
Fötales Kälberserum (FBS)	Seradigm	1500-500	Gekauft als fertige Lösung.
1x 0,25% Trypsin mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Als zubereitete Lösung gekauft.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Gekauft als Fertiglösung.
10 ng/ml humaner basischer Fibrobast-Wachstumsfaktor (bFGF)	Sigma	F0291	In sterilem Wasser resuspendieren.
20 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspendieren in sterilem Wasser.
0,4 % Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspendiert in sterilem PBS und Filter.
1x Insulintransferrin Selen (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Ersatz	Gibco	10828-028	vor Gebrauch frisch zugeben.
100% Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Gekauft als fertige Lösung.
Verbrauchsmaterialien
	BioTek	294085
sterile TC-Platten mit 1536 Well (weiß)	Corning	3727
sterile TC-Platten mit 1536 Well (schwarz)	Corning	3893
	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives Dichtungen	ThermoFisher	AB0718
Spinning-Inkubator	LiCONiC
Edelstahldeckel	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Akustischer Dispensator	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Schlauchpumpe - Multidrop Combi	ThermoFisher
- Multiflow FX	BioTek