Methodenartikel

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

DOI:

10.3791/57486

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16. März 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Lebenszyklus der Leishmaniose, die Erreger der Leishmaniose, wechselt zwischen Promastigote und Amastigote Phasen innerhalb der Insekten und Wirbeltiere Gastgeber, beziehungsweise. Während Pathogene Symptome der Leishmaniose stark und von gutartigen Hautveränderungen sehr tödliche Krankheit viszeralen Formen abhängig von der infektiösen Sorte variieren können befinden sich alle Leishmania -Arten im Host Makrophagen in der vertebrate Phase des Ihren gesamten Lebenszyklus hinweg. Leishmaniose Infektiosität bezieht sich daher direkt auf seine Fähigkeit, einzudringen, überleben und replizieren innerhalb Parasitophorous Vakuolen (PVs) in Makrophagen. Beurteilung der Parasit Fähigkeit, intrazellulär zu replizieren dient als zuverlässige Methode zur Bestimmung der Virulenz. Leishmaniose-Entwicklung mit Tiermodellen zu studieren ist zeitraubend, mühsam und oft schwierig, vor allem mit den pathogenetisch wichtigen viszeralen Formen. Wir beschreiben hier eine Methode um die intrazelluläre Entwicklung der Leishmaniose im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) folgen. Intrazellulären Parasiten Zahlen werden in 24 h-Intervallen für 72-96 h nach Infektion bestimmt. Diese Methode ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der Auswirkungen von verschiedenen genetischen Faktoren auf Leishmaniose Virulenz. Als Beispiel zeigen wir, wie eine einzelne Allel Löschung des Leishmaniose mitochondriale Eisen-Transporter-Gens (LMIT1) beeinträchtigt die Fähigkeit der Leishmaniose Amazonensis Mutante LMIT1/ΔLmit1 , innen BMMs wachsen, eine drastische Reduzierung der widerspiegelt Virulenz im Vergleich zu Wildtyp. Dieser Test ermöglicht auch präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen, die einzeln bearbeitet werden können, um den Einfluss verschiedener Faktoren (Nährstoffe, reaktive Sauerstoffspezies, etc.) auf die Wirt-Pathogen Interaktionen zu analysieren. Daher bieten die geeignete Ausführung und Quantifizierung der BMM Infektion Studien eine nicht-invasive, schnelle, wirtschaftliche, sichere und zuverlässige Alternative zu herkömmlichen Tiermodell Studien.

Einleitung

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Leishmaniose bezieht sich auf ein breites Spektrum von menschlichen Krankheiten, die durch einzelliger Parasit Arten der Gattung Leishmaniaverursacht. Etwa 12 Millionen Menschen sind derzeit mit Leishmanien weltweit infiziert, und mehr als 350 Millionen sind gefährdet. Die Pathologie der Krankheit hängt von Leishmania -Arten und Host Faktoren und Symptome variieren von harmlosen selbstheilende Hautläsionen zu tödlichen visceralizing Formen. Wenn unbehandelt, viszerale Leishmaniose tödlich ist, Ranking erst nach Malaria als die tödlichsten Krankheiten verursacht durch eine Infektion mit ein einzelliger Parasit-1. Trotz der vielfältigen Unterschiede in Krankheit Pathologie und Symptome haben alle Leishmania -Arten einen Digene Lebenszyklus Promastigote und Amastigote Phasen innen Insekten und Wirbeltiere Gastgeber jeweils abwechselnd. Innen Wirbeltiere, Leishmaniose Ziel Host Makrophagen für Invasion und induzieren die Bildung von Parasitophorous Vakuolen (PVs), saure Kompartimente mit Eigenschaften von Phagolysosomes wo die hoch virulenten Amastigote Formen replizieren. Amastigoten bestehen in Host Gewebe bei chronischen Infektionen und können weitergegeben werden vorwärts, nicht infizierten Sandmücken, Abschluss des Getriebe-Zyklus. Daher sind im Kontext der Entwicklung der menschlichen Krankheit, Amastigoten die wichtigsten Leishmaniose Lifecycle Form2. Untersuchen, wie die Amastigoten innen Makrophagen PVs repliziert ist von entscheidender Bedeutung für Verständnis Leishmaniose Virulenz3,4,5,6,7 und die Entwicklung neuartiger wirksame Therapien.

Wir beschreiben hier eine Methode, die regelmäßig von unserem Labor verwendet, um studieren Leishmaniose Infektion und Replikation im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs), die quantitative Bewertung der Anzahl der intrazellulären Leishmaniose im Laufe der Zeit beinhaltet. Der Prozess umfasst das Ernten von Monozyten aus Maus Knochenmark und Differenzierung zu Makrophagen in der Kultur, in-vitro- Infektion mit infektiösen Formen (metacyclic Promastigotes oder Amastigoten) von Leishmaniose und Quantifizierung der Anzahl der intrazellulären Parasiten an alle 24 h-Intervall für einen Zeitraum von 72-96 h nach Infektion. Dieser Test wurde in unserem Labor verwendet, um ermitteln die Auswirkungen von mehreren Umweltfaktoren und Parasiten Gene, einschließlich Ermittlung der kritischen Rolle des Eisens bei der Förderung von L. Amazonensis Virulenz, die weiter von Straßenräuber validiert wurde Läsion Entwicklungsstudien in Mäusen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle Pathogene Leishmania -Arten ihre replikativen Nische innen Makrophagen Host herstellen, kann dieser Assay universell für Virulenz Bestimmungen in allen Leishmania -Arten verwendet werden.

Durchführung von BMM Infektionen ermöglicht Analyse der Wirt-Parasit-Interaktionen auf der Ebene der einzelnen Zelle und damit eine umfassendere Verständnis der Interaktion von Leishmania -Parasiten und ihre bevorzugten Host Mikroumgebung, PVs von Makrophagen. Makrophagen-Infektion-Assays sind durch mehrere Gruppen16,17,18,19,20,21,22 erfolgreich benutzt worden, um zu erkunden Funktionen der Host Makrophagen und Leishmaniose spezifischer Gene, und ihre mögliche Einbindung in das komplexe Zusammenspiel, das intrazelluläre Infektion charakterisiert. BMM Infektionen erlauben Quantifizierung der Parasit Wachstum als eine Auslesung der Auswirkungen der Host Faktoren, die intrazelluläre überleben, wie mikrobizider Stickoxid-Produktion, Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und andere nachteiligen Bedingungen beeinflussen im Inneren der Lysosomen-wie PVs23begegnet. Makrophagen Infektion Assays wurden auch genutzt, um Anti-Leishmanial Droge Interessenten für therapeutische Entwicklung13,24zu identifizieren.

Die in-vitro- Natur BMM Infektionen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Leishmaniose Virulenz zu beurteilen. Jedoch mehrere frühere Studien, die Mechanismen der intrazellulären Parasiten überleben im Laufe der Zeit nicht quantifizieren Infektion als ein Satz20,21,24. Darüber hinaus Tat viele Studien konzentriert sich auf folgende in-Vivo -Infektionen im Laufe der Zeit dies durch die Messung der Größe der kutanen Läsion und andere physiologische Symptome, die nur indirekt auf Parasiten Replikation25,26 , 27. in-Vivo -Infektion ist einen stringenten Ansatz Parasit Virulenz zu beurteilen, aber Läsion Größenmessungen Straßenräuber Schwellung allein anhand sind oft unzureichend, da sie die Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe widerspiegeln und nicht die absolute Anzahl der Parasiten. Aus diesem Grund Straßenräuber Läsion Entwicklung haben Assays mit anschließendem Quantifizierung der Parasit Last im infizierten Gewebe Proben eine Prozedur, die langwierige begrenzende Verdünnung erfordert28. Darüber hinaus werden in Vivo Studien häufig mehrere Tiere an verschiedenen Punkten in der Zeit von Interesse6,8,9,10, Gewebe zu extrahieren zu Opfern 11 , 13. dagegen zahlreicher BMMs kann nur ein Tier entnommen werden, und diese Zellen können unter Bedingungen, die an verschiedenen Punkten in der Zeit der Infektion bewerten überzogen werden. Darüber hinaus erlaubt im Vergleich zu in-Vivo -Studien, in-vitro- BMM Infektionen mehr Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Quantifizierung der Makrophagen, zusammen mit dem Parasiten selbst angesteckt zu werden, ermöglicht präzise Kontrolle über die Multiplizität der Infektion (MOI) und der Kulturbedingungen. Genaue Kontrolle über diese Faktoren kann Schlüssel Merkmale der diskreten zelluläre Signalwege zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf den Verlauf der Infektion zu verstehen sein.

Angesichts dieser Vorteile, ist es wenig verwunderlich, dass sehr wenige Gruppen studieren Leishmaniose Virulenz bisher voll quantitative Bewertung der intrazelluläre Replikation in Makrophagen ausgenutzt haben. In diesem Artikel besprechen wir häufige Probleme, die möglicherweise behindern die weitergehende Nutzung des Assays, und bieten eine schrittweise Protokoll um seine korrekte Umsetzung zu erleichtern. In Anbetracht seiner Präzision und Vielseitigkeit kann der BMM-Infektion-Assay, die, den wir hier beschreiben, nicht nur genutzt werden, Wirt-Pathogen Interaktionen beeinflussen Leishmaniose Virulenz zu erkunden, sondern auch andere Mikroorganismen zu studieren, die im Inneren zu replizieren Makrophagen29. Wichtig ist, kann dieser Test auch als eine schnelle und kostengünstige prä-klinischen Screening-Methode für die Medikamentenentwicklung Anti-Leishmanial entwickelt werden.

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Protokoll

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Alle experimentelle Verfahren wurden von den National Institutes of Health im Einklang mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der University of Maryland IACUC angenommen wurden. Alle Schritte in den Abschnitten 1 bis 4 beschriebenen werden aseptisch in biologischen Laminar-Flow Schränken durchgeführt. Persönliche Schutzausrüstung sollte verwendet werden, und Vorsicht bei der Handhabung der live Leishmania -Parasiten in allen Phasen des Experimentierens.

1. Isolierung und Differenzierung von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs)8,30,31

  1. Tag 0: 4 - 6 Wochen alten weiblichen C57BL/6 oder BALB/c Maus in einer CO-2 -Kammer zu Opfern und Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen. Sterilisation von Scheren und Pinzetten zu gewährleisten, indem man sie in 70 % igem Ethanol getränkt. Sprühen Sie Handschuhe mit 70 % Ethanol um sterile Handhabung während des Knochenmark Zelle isoliert Prozesses zu ermöglichen.
  2. Geopferten Maus Dissektion Board durch seine Vorderbeine festhalten zu sichern und durch Sprühen reichlich mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.
  3. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit einer Schere in der Nähe des Hüftgelenks. Legen Sie die Schere unter der Haut an die darunter liegenden Muskeln zu trennen und schneiden Sie die Haut rund um das Hüftgelenk.
    Hinweis: Die Dissektion Board kann gedreht werden, um besseren Zugang zum Hüftgelenk zu ermöglichen.
  4. Sorgfältig deglove Haut vom Bein durch ziehen in Richtung Knöchel und entfernen. Am Knöchel, sehr vorsichtig zu schneiden bei oder unterhalb des Knöchels gemeinsame Tibia völlig intakt verlassen geschnitten Sie den Fuß ab.
    Hinweis: Die Fibula in diesem Stadium ist locker befestigt und mit der Zange leicht getrennt werden kann.
  5. Suchen Sie manuell das Hüftgelenk durch die Manipulation der Oberschenkelknochen um den Punkt der Rotation zu identifizieren. Vorsichtig mit einer Schere durchtrennen das Bein oberhalb des Hüftgelenks, die proximalen Kopf des Oberschenkelknochens intakt verlassen.
  6. Entfernen Sie so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich aus dem Bein mit einer Schere. Entfernen Sie jede verbliebene Haut aus den Knöchel und jede überschüssige Knochenmaterial oberhalb des Hüftgelenks.
  7. Legen Sie die gereinigten Beinknochen in sterilen RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) in einer Petrischale auf Eis.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6, Tibia und Femur aus dem anderen Hinterbein zu isolieren.
  9. Entfernen Sie alle verbleibenden Muskel und Bindegewebe aus den Knochen einweichen in RPMI sterilisierte Pinzette mit sterilen #10 Klinge.
  10. Stellen Sie Knochen auf der Petrischale Deckel. Schneiden Sie die Tibia vorsichtig mit der Klinge unmittelbar oberhalb des Sprunggelenks auf das Knochenmark. Entfernen Sie die Tibia vom Rest des Beines durch Schneiden direkt unterhalb des Kniegelenks.
  11. Ziehen Sie 10 mL sterile RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) in einen 10-mL-Spritze und befestigen Sie eine 25G Nadel.
  12. Festhalten der Tibia mit Zangen, vertikal über eine 50 mL konische Röhrchen auf dem Eis. Verwenden Sie die Spritze ca. 5 mL RPMI sanft in das Ende des Knochens, das Knochenmark aus dem anderen Ende in das konische Rohr zu spülen zu injizieren. Spülen Sie das Knochenmark mit insgesamt 10 mL RPMI, bis die Knochen weiß wird.
    Hinweis: Nach dem gründlichen spülen, sollte der Knochen weißen schalten. Wenn dies nicht der Fall ist, weiter spülen um Knochenmark zu entfernen. Das distale Ende des Schienbeins müssen wieder mit der Klinge gekürzt werden, wenn es zu eng, um die Nadel eingesetzt wird.
  13. Schneiden Sie das Femur sofort über das Kniegelenk und sofort unter das Hüftgelenk, beide Enden des Knochens auf das Knochenmark verfügbar zu machen. Spülen Sie Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen mit insgesamt 10 mL RPMI in der gleichen Weise wie der Tibia.
  14. Wiederholen Sie die Reinigung und Spülung Schritte 1.6 durch 1.13 mit den verbleibenden Knochen und sammeln Knochenmark gespült Zellen in einem einzigen 50 mL konische Röhrchen
    Hinweis: Bricht ein Knochen zu jedem Zeitpunkt während der Präparation vor Knochen Spülung, verwenden Sie nicht das Knochenmark aus dieser Knochen.
  15. Zentrifugieren Sie das konische Rohr zur Erhebung des Knochenmarks gespült aus allen vier Knochen für 10 min bei 4 ° C bei 300 X g.
  16. 60 mL steriles BMM Medium zu platzieren (RPMI mit einer Endkonzentration von 20 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1,2 mM Na-Pyruvat, 25 µg/mL menschlichen M-CSF) in eine 175 cm2 Zelle Kultur Flasche mit Filterkappe.
  17. Verwerfen Sie der Überstand folgende Zentrifugation und aufzuwirbeln Sie Zelle Pellet durch sanfte auf und ab pipettieren mit 5 mL Medium BMM aus der Flasche.
  18. Übertragen Sie Zellsuspension auf den Kultur-Kolben und spülen Sie das konische Rohr zweimal mit BMM Medium aus der Kultur-Flasche um maximale Zelle Erholung zu gewährleisten. Sicherzustellen Sie, dass die Zellsuspension in Medium gut durchmischt ist und verteilen Sie 30 mL aus der ersten 175 cm2 Zelle Kultur Flasche auf eine zweite 175 cm2 Zelle Kultur Flasche mit Filterkappe zu.
  19. Inkubieren Sie beide Fläschchen mit 30 mL Zellsuspension jede Übernachtung bei 37 ° C, 5 % CO2 Trennung von jedem kontaminierenden Fibroblasten, resident Makrophagen und andere adhärenten Zellen ermöglichen.
  20. Tag 1: Übertragen des Überstands mit undifferenzierten Knochenmarkzellen von Flaschen zu 100 x 15 mm TC-unbehandelte Polystyrol Petrischalen bei ca. 10 mL/Teller und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2. Entsorgen Sie die Fläschchen.
  21. Tag 3 oder 4: Jede Petrischale eine zusätzliche 5 mL BMM Medium (37 ° c vorgewärmt) hinzufügen und weiter Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2.

(2) Beschichtung BMMs auf Deckgläsern für Infektion (Tag 7 oder 8)

  1. Bereiten Sie 6-Well-Zellkultur-Platten durch Platzieren von vier 4 steril 12 mm Glasdeckgläser (autoklaviert und gespeichert in einem geschlossenen Glasbehälter) im unteren Teil jeder leer gut vor.
    Hinweis: Holen Sie jede sterile 12 mm Deckglas mit Absaugnadeln Spitze ausgestattet, um eine Vakuumleitung ab. Platzieren Sie Deckgläsern in die Vertiefungen ohne Überlappung, Freigabe an der gewünschten Position durch Kneifen das Rohr um Vakuum zu unterbrechen.
  2. Aspirat Medien (und nicht-anhaftende Zellen) von Petrischalen beschichtet mit anhaftenden Knochenmark abgeleitet Makrophagen und sanft spülen adhärenten Zellen 2 X mit sterilen Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium Chlorid (PBS- / -) vorgewärmt auf 37 ° C.
  3. Fügen Sie tropfenweise, 5 mL sterilen 1 x PBS- / - mit einer Endkonzentration von 1 mM EDTA zu jeder Petrischale und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C, anhaftende BMMs. überprüfen zu lösen, dass die Zellen unter dem Mikroskop getrennt sind.
  4. Sammeln Sie alle freistehende Zellen in 1 X PBS- / - ergänzt mit 1 mM EDTA in einem 50 mL konische Rohr aufgehängt. Spülen Sie jedes Gericht 2 X mit 5 mL PBS- / - und Zelle Aussetzung Pool hinzufügen.
    Hinweis: Zellsuspension kann verdünnt werden, mit zusätzlichen PBS- / -, Makrophagen aus EDTA Toxizität während die Einziehung von Forderungen zu schützen.
  5. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Makrophagen in 5-10 mL BMM Medium durch pipettieren. Ort Nukleinsäuretablette Zellen auf Eis, Befestigung an Rohren und verklumpen zu verhindern.
  6. Anzahl der lebensfähige Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung in der Hemocytometer.
    Hinweis: Um BMM Zellen in 5 mL Medium Nukleinsäuretablette zählen, kann eine Verdünnung-Mischung aus 25 µL Zellsuspension in 445 µL PBS- /- und 30 µL 0,4 % Trypan blau Lösung in der Regel leicht Quantifizierung in eine Hemocytometer (unter Berücksichtigung einer 20 X Verdünnungsfaktor für die endgültige Berechnung ). Zählen Sie nur Zellen, die nicht mit Trypan blau (lebensfähige Zellen) gefärbt bekommen. Das Volumen der Zellsuspension kann geändert werden, wenn diese Mischung zu konzentriert oder verdünnt ist. Der Ertrag der BMM pro Vorbereitung unterschiedlich in der Regel 2 x 107 und 5 x 107 Zellen aus einem einzigen Mausklick.
  7. Bereiten Sie die Zellsuspension in BMM Medium in gewünschte Beschichtung Konzentration (5 x 105/mL) und zerstreuen Sie Aussetzung zu 6-well-Platten in 2 mL Medium pro Bohrloch zu, so dass jeder gut 1 x 106 Makrophagen erhält.
    Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, die jeden gut bekommt sorgt für die ausreichende Anzahl von Makrophagen zu die Deckgläsern gleichmäßig bedecken. Überprüfen Sie, dass Deckgläsern in Brunnen sind nicht überlappende oder schwimmend in das Medium. Wenn ja, einstellen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze.
  8. Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.

3. Reinigung von infektiösen Formen von L. amazonensis

Hinweis: Bereiten Sie Leishmaniose für Infektionen - von stationären Promastigote Kulturen8,13metacyclic Promastigotes reinigen, oder Promastigotes in der Kultur in Amastigote Form mit standard L. Amazonensis zu unterscheiden axenic Differenzierung Protokoll6,8.

  1. Reinigung von Leishmania metacyclic Promastigotes mittels Dichte gradient media(Materials) 33
    1. Bereiten Sie 40 % Stammlösung Dichte Gradienten Medien in sterilen, Endotoxin-freies Wasser.
    2. Verdünnen Sie Dichte Gradienten Lösung in 10 x M199 Medium (ohne Serum) um 10 % Konzentration im Medium M199 vorzubereiten.
    3. Filtern Sie alle Lösungen durch 0,22 µm-Filter.
      Hinweis: Lager-Lösungen können bei 4 oC in der Dunkelheit nicht länger als 1 Monat aufbewahrt werden.
    4. Im unteren Teil eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen 2 mL 40 % Dichte-Gradienten Media-Lösung zugeben.
    5. Schicht 2 mL 10 % ige Dichte Gradienten Medienlösung in M199 auf die 40 % ige Dichte Gradienten Medienschicht vorsichtig mit einer Pasteurpipette um zu vermeiden, eine Vermischung zwischen den beiden Schichten.
    6. Sammeln Sie 1 x 109 Parasiten aus der stationären Phase Kultur durch Zentrifugation bei 1.900 x g für 10 min.
    7. Aufschwemmen Sie Zellen in 6 mL Dulbecco geändert wesentliches Medium (DMEM).
    8. Schicht 2 mL Zellsuspension direkt auf die 10 %-Dichte, die Gradienten Medien mit einer Pasteurpipette um zu vermeiden, mischen zwischen Schichten überlagern, sanft.
    9. Zentrifugieren des Farbverlaufs für 10 min bei 1.300 x g bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Aufgrund der Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften zwischen Leishmania -Arten, Zentrifugation Bedingungen für jede möglicherweise leicht angepasst werden, um maximalen Ertrag zu gewährleisten.
    10. Parasiten (angereichert in metacyclic Promastigote Form) aus der Band, die an der oberen 10 % Dichte Gradienten Medien Grenze (Schnittstelle zwischen 0 % und 10 % Dichte Gradienten Medien Schichten) zu sammeln.
    11. Verdünnen Sie Parasiten mit einem Volumen von DMEM und sammeln durch Zentrifugieren (1.900 x g für 10 min bei Raumtemperatur).
    12. In 500 µL DMEM Medium Aufschwemmen und zählen in einer Hemocytometer, Ertrag zu quantifizieren.
  2. Generation von L. Amazonensis Amastigoten unter axenic Kulturbedingungen (niedriger pH-Wert / Temperatur erhöht)6,8,13
    1. Mix 5 mL der Log-Phase Promastigote Kultur (pH 7.4 bei 26 oC) mit einem gleichen Volumen Amastigote Medium (pH 4,5), mit 25 cm2 Fläschchen (insgesamt 10 mL Medium) und über Nacht bei 26 ° C inkubieren.
    2. Verlagerung des Kolbens von 26 ° C bis 32 ° C.
    3. Nach 3 oder 4 Tage geteilt Kultur 1:5 in Amastigote Medien bei 32 ° C.
    4. Überprüfen Sie die Parasiten in den nächsten 3-4 Tagen (max. 7 Tage) zu sehen, ob sie bereit für den Einsatz bei Infektionen sind.
      Hinweis: Gesunde axenic Amastigoten haben eine ovale Form, ohne sichtbare Flagellen. Teilweise differenzierte Amastigoten haben eine große ovale Form mit kurzen Flagellen. Die Kultur sollte nicht viel Klumpen - viele Klumpen sind ein Hinweis auf nicht-wachsen, sterben Parasiten. Die Amastigote Kultur kann split 1:5 und für maximal 3 Wochen gewartet werden.

(4) Infektion mit L. amazonensis

  1. Verdünnen Sie Parasiten Suspensionen nach gewünschten MOI (in der Regel 3-5 metacyclic Promastigotes pro Makrophagen [MOI von 1:3 oder 1:5]) und 1 Amastigote pro Makrophagen [MOI 1:1]. Fügen Sie Leishmaniose in PBS- / - in einem Volumen von 50-100 µL in jede Vertiefung bereits mit 2 mL Medium.
  2. 1 h mit Amastigoten und 3 h mit metacyclic Promastigotes bei 34 oC für Infektion BMMs inkubieren.
    Hinweis: Optimale Infektion Temperatur variiert je nach Spezies.
  3. Nach Inkubation, gründlich abwaschen kostenlose Parasiten in jedem gut 3 X mit 2 mL PBS- / - auf 37 ° c vorgewärmt
    Hinweis: Zerstreuen Sie PBS vorsichtig, um sicherzustellen, dass Deckgläsern nicht über einander zu schweben. Die Platte vorsichtig schwenken und dann die Flüssigkeit abzusaugen. Verwenden Sie separate Absaugnadeln Tipp, wenn mehrere Stämme von Parasiten zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  4. Fix 1 h oder 3 h Zeit-Punkt Proben durch Inkubation jeweils gut mit 1,5-2 mL 2 % PFA in PBS- / - für 10 min. 3 X mit PBS- / - waschen. Nicht aspirieren Sie letzten Waschen und kühlen Sie Platten mit Deckgläsern mit PBS-Puffer bis zu beflecken.
  5. Fügen Sie 2 mL frisches BMM Medium in jede Vertiefung auf Tellern für weitere Zeitpunkte und inkubieren Sie bei 34 ° C.
  6. Verbleibenden Zeit-Punkte wie gewünscht wie unter Punkt 4.3 beschrieben, und kühlen Platten bis Färbung zu beheben.

5. DAPI-Färbung und Deckglas Montage

  1. Aspirieren Sie PBS aus Brunnen mit Deckgläsern und 1,5 mL PBS- / - mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel. 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 X waschen mit 2 mL PBS- / - inkubieren.
  2. Fügen Sie 1 mL PBS- / - mit 2 µg/mL DAPI (von 5 mg/mL Stammlösung in Wasser verdünnt) in Brunnen mit Deckgläsern und ein weiteres 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Die Inkubationszeit mit DAPI ist wichtig für die Visualisierung von intrazellulären Leishmania -Parasiten. Makrophagen Kerne Flecken schnell, aufgrund ihrer größeren Größe und DNA-Inhalt aber Färbung der Kerne der intrazellulären Parasiten ist langsamer. So ist es notwendig, DAPI, durch zu durchdringen und der Parasit Plasmamembran und die Kernmembran Parasit ermöglichen, Verlängerung Inkubationszeit über was erforderlich ist, um die BMM-Kerne zu visualisieren. Mit richtigen DAPI-Färbung kann auch die mitochondriale Kinetoplast DNA in der Nähe der flagellar Tasche des Parasiten visualisiert werden, zusätzlich zu den Kern-DNA.
  3. Waschen mit jeweils gut Deckgläsern 3 X mit 2 mL PBS- / - und dann Aufzug und Flip Deckgläsern mit Pinzette die Zelle Seite nach unten aufgelegt und auf Glas Mikroskop gleitet mit einem handelsüblichen antifade Montage-Reagenz.
    Hinweis: Deckgläsern äußerst fragil und vorsichtige Handhabung benötigen. Vermeiden Sie Druck auf sie, vor allem gegen die Seitenwand der Brunnen beim Anheben. Ein paar Tropfen PBS- / - reduziert die Oberflächenspannung zwischen Deckglas und gut und erleichtert das anheben. Eine feine Nadel kann verwendet werden, um bei der neugierigen Deckgläsern von der Unterseite des Brunnens. Drücken Sie nach einem Deckgläschen Auflegen der Folie sanft mit der Pinzette um eventuelle Luftblasen in den Montage-Medien verdrängen. Wenn ein Deckglas defekt ist oder hat möglicherweise während des Hebevorgangs umgedreht, montieren Sie nicht; Nutzen Sie einfach die freie vierte Deckglas.
  4. Kühlen Sie Folien bis Quantifizierung.

(6) Infektion Quantifizierung

  1. Durch die Fokussierung auf Makrophagen mit 100 X Objektiv mit Immersionsöl DAPI-gefärbten Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen (Erregung bei 358 nm; optimale Emission bei 461 nm).
    Sicherstellen Sie, dass auf der Ebene von Makrophagen zwischen Objektträger und Deckglas konzentriert.
  2. Quantifizieren der Anzahl von Makrophagen (große Kerne mit DAPI gefärbt) und die Anzahl der kleineren Amastigote Kerne rund um jedes Makrophagen Kern (siehe Abb. 2ADAPI) für jedes Sichtfeld mittels manuellen Zähler.
    Hinweis: Amastigote Kerne können nicht alle in einer Ebene der Fokus aufgrund ihrer geringen Größe sichtbar. Zählen Sie jene, die sichtbar, wenn auf Makrophagen Zellkerne gerichtet sind, und verwenden Sie dann Feinfokus für Parasiten Kerne in Ebenen oberhalb und unterhalb der Makrophagen Kerne zu überprüfen.
  3. Umzug nach ein anderes Sichtfeld zu Quantifizierung zu wiederholen. Verwenden Sie einen separaten Schalter Schlüssel, um die Anzahl der Felder gezählt zu verfolgen. Bewegen sich durch visuelle Felder in parallelen Reihen über jedes Deckglas zu verhindern, dass Überschneidungen zu zählen.
  4. Ein Minimum von 200 Makrophagen pro Deckglas zu quantifizieren. Jedem Zeitpunkt der Infektion in dreifacher Ausfertigung (3 Deckgläsern) zu quantifizieren. Die vierte Deckglas zu zählen, wenn die vorherige nicht geeignet für die Zählung durch Deckglas Überlappung, schlechte Montage, Glasbruch, etc. gehört
    Hinweis: Wenn 200 Makrophagen können nicht auf jeden ein Deckglas gezählt werden, zählen Sie das Reserverad Vierter.
  5. Infektionsraten als Amastigoten/Makrophagen oder Amastigoten/100 Makrophagen zu berechnen und Prozent infizierten Makrophagen aus den rohen Quantifizierung Daten zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Leishmaniose hat zwei infektiöse Formen - metacyclic Promastigotes, die an die stationäre Phase der Kultur von prozyklischen Promastigotes unterscheiden und Amastigoten, die den intrazellulären Stadien (Abbildung 1) sind. Bei einigen Leishmania -Arten wie L. Amazonensiskönnen Amastigoten auch in der axenic Kultur unterschieden werden durch die Verlagerung der Promastigote Zellen, um die niedrigeren pH-Wert (4.5) und erhöhter Tempera...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die quantitative Daten von der BMM Infektion Test oben beschrieben, ermöglicht Ermittler Infektionsraten und eine zuverlässige Bestimmung der Veränderungen der Virulenzeigenschaften in einem relativ kürzeren Zeitraum (maximal 2 Wochen, im Vergleich zu den 2 zu erhalten Monate für in Vivo Experimente erforderlich). Diese Methode beruht auf der DNA-spezifischen Farbstoff DAPI, speziell Flecken Makrophagen und Parasiten Kernen und ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung der infizierten Zellen. Im Ve...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben,

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant RO1 AI067979 NWA unterstützt.
YK ist Bachelor Fellow der Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland, College Park.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-ZellkulturplatteCellstar657160
AdeninAcros OrganicsAC147440250
Aerosol-Barriere-Pipettenspitzen (100-1000 μ L)Fisherbrand02-707-404
Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere (20-200 μ L)Fisherbrand02-707-430
Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere (2-20 μ L)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Rippenrücken-Chirurgenklinge aus Kohlenstoffstahl #10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Spitze 10 mL SpritzeBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide Nadel, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Zellkulturschale 35 mm x 10 mmCellstar627 160
ZellkulturflascheCellstar660175
Deckgläser: 12 mmKreise Fisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)InvitrogenD1306
D-BiotinJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Ethylalkohol 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm nicht TC-behandeltes Polystyrol PetrischaleCorning351029
Fötales RinderserumSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
FluoreszenzmikroskopNikonE200
Ziege Anti-Maus IgG Texas rotInvitrogenT-862
Ziege Anti-Kaninchen IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LtdH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II VerdünnungsmittelBeckman Schar
L-GlutaminGemini400-106
Medium 199 (10X)Gibco11825-015
Na Pyruvat (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldehydAlfa Aesar43368
Penicillin/StreptomycinGemini400-109
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (-/-)ThermoFisher14200166
konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylin 15 mLCellstar188 271
konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylin 50 mLCellstar227 261
ProLong Gold Antifading-ReagenzThermoFisherP36930
Ratte Anti-Maus Lamp-1 AntikörperEntwicklungsstudien Hybridoma Bank1D4B
Rekombinante humane M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line  Hämozytometer Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 TensidMillipore SigmaTX1568-1
Trypan BlueSigma AldrichT8154
Feine Schere, 4 1/2"VWR82027-582
Präparierzange, feine SpitzeVWR82027-386
ObjektträgerVWR16004-368
Z1 Schar-Partikelzähler,Beckman-Scharmit
8546719 doppelter Schwelle 6605699

Referenzen

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