Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate

Krebs wird durch zelluläre Mutationen verursacht und folglich biochemischen Signalwege gestört werden, unkontrollierte Zellteilung und Widerstand zum Zelltod auszulösen. Tumoren stören mit physiologischen Funktionen von Verdauungs, Nervensystem, Herz-Kreislauf-Systems und anschließend benachbarte Gewebe¹. Trotz umfangreicher Forschungsbemühungen bleibt Krebs die häufigste lebensbedrohliche Krankheit in der Welt². Präzisions-Medizin wurde als Grundlage für zukünftige Krebstherapie anerkannt. Neue Wirkstoffe werden routinemäßig getestet in Kombination mit vorhandenen Drogen, klinische Outcome zu verbessern.

Eine erhebliche Einschränkung verbunden mit der Entwicklung der neuen effiziente zielgerichtete Therapien ist jedoch das Scheitern von häufig verwendeten Assays, die genaue biologische Ergebnis der Droge Exposition³zu simulieren. Krebs Wirkstoffforschung stützt sich nach wie vor überwiegend auf testen die Wirksamkeit therapeutischer Wirkstoffe in Krebszelllinien kultiviert in 2D Monolayer-Kulturen, die schwer in klinischen Studien⁴zu validieren sind. Daher gibt es ein wachsendes Interesse, bessere Krebs Modelle zu entwickeln, die die systemeigene Funktionen von Tumoren in Vivo⁵besser zu imitieren. In den letzten Jahren führte ein zunehmendes Interesse an 3D Culture Modelle die Entwicklung von verbesserten Methoden, 3D Tumor Modelle⁵zu produzieren.

Hier stellen wir einen Ansatz mit drei verschiedenen 3D Zelle Kulturtechniken zur Verbesserung des Verständnisses der Potenz des Hydroxycoumarin OT48⁶ in Kombination mit BH3-Mimetika vor mehr in Tiefe in Vivo Tests. Unsere Methode besteht darin, Kolonie und SFAs mit einem in Vivo Tumor Bildung Test basiert auf einem Zebrafisch-Modell weiter bestätigen die Wirksamkeit der Kombination von OT48 und BH3-Mimetika in Lungenkrebszellen und überwachen Krebsentwicklung in einer lebendigen verbinden Organismus.

Kolonie-Bildung-Assays sind routinemäßig zur Wirksamkeit der Anti-Krebs-Agents für solide sowie hämatopoetischen Krebsarten zu beurteilen. Der Test bestimmt die Fähigkeit einer Zelle zu vermehren auf unbestimmte Zeit und bilden Kolonien⁷. Die Wirkung von Anti-Krebs-Agent auf die koloniebildenden Fähigkeit der Zellen wird durch Abnahme der Anzahl und/oder Größe der Kolonien bestimmt.

Sphäroide vertreten in Vitro Tumormodellen und dienen als eine kostengünstige Screening-Plattform für Anti-Krebs-Agenten. Sphäroide sind Aggregate von Zellen in Suspension wachsen oder in einer 3D Matrix eingebettet. Dieser Ansatz ist für Wirkstoff-Screening und Studien von Tumor Wachstum, Vermehrung und Immune Interaktion⁸verbreitet.

Um die Eigenschaften eines neuen Medikaments vollständig zu verstehen, gilt es in Vivo Experimente auf Nagetiere durchzuführen. Diese herkömmliche Methode ist jedoch teuer und zeitaufwendig. Zebrafisch (Danio Rerio) wurde in den letzten Jahren ein weit studierte Labor-Organismus, der ist billiger und schneller zu erhöhen. Tumoren entwickelt im Zebrafisch repräsentieren eine 3D Zelle Kultur Ansatz aber innerhalb der in Vivo -Einstellung eines Wirbeltier-⁹.

Insgesamt verwenden wir hier drei verschiedene 3D Culture Ansätze einschließlich aufgewendete, SFAs und Zebrafisch in Vivo Tumorbildung um die Anti-Krebs der Hydroxycoumarin OT48 in einem Lungenkrebs Krebs A549 Zellmodell in Kombination mit BH3-Mimetika unter Beweis zu stellen.

(1) Kolonie Bildung Assays

1. Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm² in 15 mL RPMI1640 Zelle Kulturmedium ergänzt mit 10 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Antibiotika in einem 75 cm² Kolben in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.
2. Am Tag des Experiments bestimmen Sie die Zellkonzentration mithilfe eines Hemocytometer. Sammeln Sie 50.000 Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g für 7 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auszusetzen Sie Zellen in 100 µL 1 X sterile PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) in 1,5 mL Röhrchen wieder.
3. 1,1 mL halbfeste Methylcellulose-basierte Medium (MCBM) in 15 mL Tuben mit einer Multipipette zu verzichten. Bereiten Sie eine Röhre für jede Bedingung.
4. 1,1 mL MCBM mit einer Mikropipette P200 fügen Sie 110 µL FBS hinzu.
5. Samen Zellen bei 1.000 Zellen/mL. 2.4 µL Zellsuspension aus der Stammlösung (50.000 Zellen in 100 µL 1 X PBS) sammeln mit Hilfe einer Mikropipette P2 und hinzufügen auf 1,1 mL MCBM ergänzt mit 10 % FBS.
6. Nach dem Hinzufügen der Zellen Wirbel die Röhren für 1 min, hielt sie vertikal mit der höchsten Geschwindigkeit MCBM und Zellen gut mischen.
7. Fügen Sie Testverbindungen (OT48 allein oder in Kombination mit A1210477). Bereiten Sie einen separaten Schlauch als Steuerelement für das Lösungsmittel verwendet (hier Dimethyl Sulfoxid (DMSO)). Abhängig von der Konzentration der Verbindungen und die Lautstärke für jede Bedingung hinzugefügt beinhaltet das Lösungsmittel-Steuerelement die höchste Konzentration an Lösungsmittel verwendet für die Verdünnungen der Testverbindung für Beeinträchtigungen durch das Lösungsmittel zu bewerten.
8. Vortex-Rohre für 1 Minute.
9. Fügen Sie für jede Probe 1 mL der Mischung mit einer Mikropipette P1000 auch ein 12-Well Zellplatte Kultur Zentrum hinzu.
10. Füllen Sie leere Brunnen mit 1 mL sterilem Wasser oder 1 X PBS, Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.
11. 10 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO₂inkubieren Sie Kultur Platten.
12. Fügen Sie nach 10 Tagen Inkubation 200 µL der Stammlösung ein MTT-(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid) (5 mg/mL) in jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen.
13. Inkubieren Sie 10 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂. Tragfähige Kolonien schaltet sich violett.
14. Erfassen Sie das Abbild mit einer Digitalkamera mit der weiße Hintergrundplatte (LAS weißen Dia Tray). Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Methode, zu digitalisieren; Exposition Art, Präzision; Belichtungszeit, Handbuch, 1 Sekunde; Empfindlichkeit/Auflösung, hohe Auflösung. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format.
15. Quantifizieren Sie tragfähige Kolonien mit ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Bild | Typ | 8-Bit". Menü "Auswahl" "Adjust | Threshold". Festlegen Sie Schwellenwert, zu kontrollieren und halten Sie für alle Bedingungen konstant zu; Menü "Auswahl" "Analyze | Analysieren Sie Partikel". Daten speichern und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.

(2) Sphäroid Bildung Assay

1. Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm² in 75 cm² Fläschchen mit 15 mL RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika ergänzt.
2. Am Tag des Experiments, bereiten eine 96 gut U-Bodenplatte.
3. Platte 10.000 Zellen in einen Brunnen, der bereits die Verbindung von Interesse (hier 50 µM der OT48) bzw. 20 µM A1210477 enthält. Die letzte Lautstärke zu 100 µL Zellkulturmedium. Die Anzahl der Zellen, die einheitliche Sphäroide mit eine intakte äußere Begrenzung gilt als ausreichend, um Form Sphäroide.
4. 3 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO₂inkubieren.
5. Nach 3 Tagen Inkubation die Aufnahmen von der Sphäroide mit einem Lichtmikroskop mit 4 X Vergrößerung.

(3) Zebrafisch Xenograft-Assay

Hinweis: Dieser technische Ansatz ist als ein Schaltplan (Abbildung 1) visualisiert.

1. Vorbereitung der Lager Reagenzien
   1. Bereiten Sie 1 L 30 x Danieaus Lösung: 1740 mM NaCl, KCl 21 mM, 12 mM MgSO₄∙7H₂O, 18 mM Ca (NO₃)₂und 150 mM HEPES. Der pH-Wert des Puffers bis 7.6 mit dem pH-Meter passen.
   2. Bereiten Sie 1 % (50 X) Tricaine Lösung: 20 mg Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate (Tricaine) in 2 mL destilliertem Wasser auflösen.
   3. Bereiten Sie 1 % Phenol Red-PBS-Lösung: Add 2 µL Phenol rot Natrium-Salz-Lösung zu 198 µL sterilisierte PBS-Lösung in einem 1,5 µL Rohr.
   4. 3 % Methylcellulose vorbereiten: 100 mL 1 x Danieaus Lösung 3 g von Methylcellulose hinzufügen.
2. Zebrafisch-Ei-Produktion und Inkubation
   1. Trennen eines weiblichen und eines männlichen Zebrafisch in eine Partition Tank gefüllt mit UV-sterilisiert und gefiltertes Leitungswasser bei 28,5 ° C im Dunkeln. Nach 24 Stunden der Trennung mix Fisch beider Geschlechter, Paarung zu initiieren. Übertragen Sie befruchtete Eier aus der Paarung Tank auf einer Petrischale mit 5 mL frischem Danieau Lösung.
   2. Waschen Sie Eier dreimal mit 5 mL Danieau Lösung. Aspirieren Sie für das Waschen sorgfältig die Eier mit einer Pipette und Transfer zum 5 mL frische Lösung. 8 h bei 28,5 ° c inkubieren
      1. Ändern Sie nach 8 h Inkubation in Danieau Lösung in Danieau Lösung mit 0,03 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigmentierung zu hemmen. Aussortieren von undurchsichtigen Eier (unbefruchtete oder mit unbebauten Embryonen) um Verunreinigungen zu verhindern.
3. Embryo-dechorionation
   1. 24 h post Düngung (hpf), Dechorionate Zebrafisch-Embryonen mit scharfen Pinzette. Schraffur Embryonen in Danieau Lösung mit 0,03 % inkubieren PTU bei 28,5 ° C bis 48 hpf.
4. Verbindung-behandelten Zellen Vorbereitung
   1. Samen A549 Zellen bei 20.000 Zellen/cm² in 25 cm² Kulturflaschen. Nach 24 Stunden der Aussaat Verbindungen hinzufügen (hier OT48 bei 50 µM und/oder A1210477 bei 20 µM) für 24 Std. im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO₂. Richten Sie die Behandlungszeit für jede Verbindung die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sondern in Richtung Zelltod zu begehen. Dieser Zeitpunkt muss individuell anhand der Zellviabilität, Morphologie und molekulare Marker eingerichtet werden.
   2. 2 h vor dem Ende der Behandlung, Farbstoff Fleck Zellen mit 4 µM fluoreszierende Zelle Tracker CM-Dil bei 37 ° C und 5 % CO₂. Nach 2 h Inkubation trypsinize Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA und 10⁶ Zellen in 50 µL Phenol Red-PBS-Lösung vor der Injektion zu verdünnen.
5. Mikro-Injektion von Krebszellen für Xenograft-Bildung
   1. Zebrafisch eine 0,02 % Tricaine Lösung für 5 min zu betäuben, bis sie auf einer nährbodenplatte niederzulassen.
   2. Ziehen Sie eine 1,0 mm (außen Durchmesser (OD) Glas Kapillare) von einer Mikropipette Abzieher (Programm-Einstellungen: P: 300, Hitze: 260, ziehen: 60, VEL: 50 und Zeit: 200). Schneiden Sie die Microcapillary mit einer Spritze, eine scharfe Kante zu produzieren. Laden mikrokapillaren mit 20 µL der Zelle/Phenol Red-PBS-Lösung. Einspritzdruck und Uhrzeit einstellen, um zu verzichten, 2 nL pro Injektion.
   3. Injizieren von 100 – 200 Zellen in dem Dottersack durch Injektion 6 bis 10 nL über 3 bis 5 Injektionen. Können Sie nach der Injektion Fisch für 10 bis 30 min in 5 mL frisches Danieau Lösung mit PTU Lösung wiederherstellen. Versand Fische in 24-Well-Platten mit 1 mL Danieau Lösung mit PTU Lösung und 72 h bei 28,5 ° c inkubieren
   4. Nach 72 h Inkubationszeit Fisch in einer 0,02 % Tricaine Lösung zu betäuben und auf einem Objektträger mit einem Rückgang von 3 % Methylcellulose zu immobilisieren. 5 X fotografieren durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Wellenlänge von 620 bis 750 nm.
   5. Quantifizieren Sie die Größe des fluoreszierenden Tumoren von ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Analyze | Maßnahme". Speichern von Werten entspricht das Fluoreszenzsignal und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.

In Abbildung 2Lungenkrebs Zelllinie, die A549 in MCBM Form Kolonien nach der Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 in den angegebenen Konzentrationen ausgesät wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination Anzahl, Größe und Fläche der Kolonien nach 10 Tagen Inkubation deutlich reduziert.

In Abbildung 3A549 Zellen wurden mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 behandelt und durften Form Sphäroide durch die U-Boden-Platte-Technik. Nach 3 Tagen Inkubation wurden Bilder von Sphäroide genommen. Quantifizierung der Sphäroide erfolgte mit Bild J und 3D Bilder erzeugt wurden.

In Abbildung 4waren A459 Zellen mit OT48 behandelt, allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 für 24 h und in der Zebrafisch Dottersack injiziert. Nach 72 h Quantifizierung von fluoreszierenden Tumoren korreliert mit der hemmenden Potenzial der Verbindung.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des gesamten Prozesses der Zebrafisch-Xenograft-Assays. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: synergistische Hemmung A549 Kolonie Bildung von Hydroxycoumarin OT48 und BH-3 mimetischen A1210477. (A) Bilder von einem A549 Kolonie Bildung Assay mit 50 µM OT48 und/oder 20 µM A1210477 behandelt. (B-D) Quantifizierung der Gesamtfläche von Kolonien, Anzahl und durchschnittliche Größe. Experimente wurden in dreifacher Ausführung realisiert. Post-hoc- Analysen wurden durchgeführt. Statistischen Bedeutungen wurden auf p-Werte unter 0,05 ausgewertet und dargestellt durch die folgende Legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01 *** p ≤0.001 *** p ≤0.0001; Post-Hoc Analysen Dunnett; Sidak). Alle Histogramme repräsentieren den Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Wirkung von OT48 und/oder A1210477 auf die Kapazität der A549 Zellen zu Form Sphäroide. Bilder von A549 Tumor Sphäroide nach 3 Tagen.

Abbildung 4: Hemmung der A549 Masse Tumorbildung durch eine Verbindung. (A) Bilder zeigen die hemmende Wirkung des OT48 bzw. A1210477 auf den Tumor Kapazität von CM-Dil-gefärbten A549 Zellen bilden. (B) Quantifizierung der Tumorbildung. Post-hoc- Analysen wurden durchgeführt. Statistischen Bedeutungen wurden auf p-Werte unter 0,05 ausgewertet und dargestellt durch die folgende Legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01 *** p ≤0.001 *** p ≤0.0001; Post-Hoc Analysen Dunnett; Sidak). Alle Histogramme repräsentieren den Mittelwert ± SD von mindestens zehn unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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