Methodenartikel

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

DOI:

10.3791/57494

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7. Mai 2018

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1Department of Biological Sciences, College of Bioscience and Biotechnology, Chungnam National University, 2Department of Pharmacology, College of Medicine, Chungnam National University, 3Department of Nursing, Gwangju Women's University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Zusammenfassung

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Präzise Steuerung des Transgens Ausdruck ist in biologischen und klinischen Studien wünschenswert. Jedoch, da die binäre Funktion der derzeit eingesetzten Genschalter die Übertragung von zwei therapeutische Ausdruck Einheiten gleichzeitig in eine einzelne Zelle erforderlich ist, beschränkt sich die praktische Anwendung des Systems für die Gentherapie. Um die Transgen-Expressionssystem zu vereinfachen, haben wir einen Genschalter als pEUI(+) umfasst einen kompletten Satz von Transgen Ausdruck Module in einem einzigen Vektor generiert. Bestehend aus der GAL4 DNA-bindende Domäne und modifizierte EcR (GvEcR), eine minimale VP16 Aktivierungsdomäne verschmolzen mit einem GAL4 DNA-bindende Domäne sowie eine modifizierte Drosophila Ecdyson Rezeptor (EcR), ist die neu entwickelte einzigartige Genschalter hoch auf die Gabe von chemischen Induktor in einer Zeit-Dosis-abhängigen Weise reagieren. Der pEUI(+)-Vektor ist ein potenziell leistungsfähiges Werkzeug zur Verbesserung der Kontrolle des Transgens Ausdruck in der biologischen Forschung und prä-klinischen Studien. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Modulation eines transiente und stabile Transgen Ausdrucks mit pEUI(+) Vektor durch die Behandlung von Tebufenozide (Teb). Darüber hinaus geben wir wichtige Hinweise für die Verwendung von Teb als eine chemische Induktor.

Einleitung

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Mehrere verschiedene Genschalter wurden für ihre Fähigkeit, präzise regulieren Transgene Expression in Zellkulturen und Tiermodellen, mit unterschiedlichem Erfolg1,2,3untersucht. Potenzielle gen Schaltanlagen sollten mehrere strenge Kriterien, einschließlich treffen: präzise gerichtete Expression des Transgens, Dosierung und zeitabhängig Reaktionsvermögens zu induzieren, vernachlässigbar Undichtigkeit des Promoters, Reversibilität des Transgens Aktivierung durch Entfernung der Induktor und Induktor Toxizität erträglich zu Zell-Linien und Labor Tiere1,2,3. Mehrere kleine Molekül Induktoren wurden ausgebeutet, einschließlich Tetracyclin4,5, Rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, und Ecdyson11,12,13,14. In der Regel diese Systeme erfordern mindestens zwei Plasmide mit zwei oder drei diskrete Ausdruck Einheiten, ein oder zwei davon zu komponieren ein regulatorisches Element (Induktor Plasmid), das bindet eine kleines Molekül-Induktor transkriptionelle Aktivität zu gewinnen; und ein weiteres Plasmid (Effektor Plasmid), enthält das Transgen unter der Kontrolle einer regulatorischen DNA-Region, die den Zugang von der Induktor-gebundenen regulatorisches Element ermöglicht. Der größte Nachteil des binären Systems ist, dass es die gleichzeitige Einführung der beiden Vektoren (Induktor und Effektor) in die Zielzelle erfordert. In Transienten Transgene Ausdruck Experimente produziert die gleichzeitige Transfektion von zwei Plasmide unweigerlich eine Population von Zellen, die einzeln mit dem Induktor oder der Effektor transfiziert oder Co ungleich transfiziert. Darüber hinaus erfordert das binäre System mindestens zwei Runden von Antibiotika Auswahl, stabilen Zelllinien zu etablieren, das ist zeitaufwändig und mühsam. So verbindet alle Komponenten für die Expression des Transgens erforderlich und Verordnung in einem einzigen Vektor wäre ideal, um den gleichzeitigen Ausdruck alle erforderlichen Elemente in einer einzelnen Zelle zu gewährleisten und ermöglichen für die Regulierung der Expression des Transgens durch die Behandlung mit kleinen Moleküls induzieren.

Um die Mängel der binären Genschalter zu überwinden, entwickelten wir vor kurzem eine singuläre Genschalter mit einem Drosophila Melanogaster EcR-basierte gen induzierbaren System15. Ecdyson vermittelt Genexpression, wenn es um die EcR/Ultraspiracle (USP)-Heterodimer, bindet die Bindung von der EKR auf DNA-regulatorischen Elementen3,11wiederum induziert. Der vertebrate Retinoid X-Rezeptor (RXR), ein Ortholog des Insekts USP, Rekruten EcR um eine aktive transcriptional Aktivator16bilden. So, für die gezielte Expression von Transgen in vertebrate Zellen oder Gewebe, die EcR und RXR Co ausgedrückt gleichzeitig muss vor stimuliert durch Ecdyson oder seine Agonisten. Da die endogene RXR Ebene, Padidam Et Aldie heterodimerisierenden Funktion des Schalters EcR-basierte gen beeinflusst werden kann. ersetzt die EcR DNA-Bindung und Aktivierung Domains mit heterologen GAL4 DNA-Bindung, Herpes-Simplex-Virus-Protein-vmw65 (VP16) Aktivierung Domänen miteinander verschmolzen, die EcR Liganden-bindende Domäne, die dann wurde reagiert nicht auf endogene RXR und bildeten ein Homodimer transkriptionelle Aktivität17zu gewinnen. Die EcR-basierte Genschalter wurde weiter verbessert, durch den Bau ein chimäres Protein bestehend aus minimal VP16 Aktivierungsdomäne, kombiniert mit GvEcR, die ein Homodimer gebildet und in der Zellflüssigkeit in Ermangelung Ecdyson Agonist, Teb16lokalisiert, 18. Durch die Bindung an Teb, verändert die GvEcR seiner subzelluläre Lokalisation aus dem Zytosol in den Zellkern zu erkennen, ein Hybrid-Promotor bestehend aus Zebrafisch E1b minimal Förderer mit einem zehn Tandem kombiniert wiederholt vorgelagerten Aktivierung Sequenzen (Drohnen) zu initiieren die Transkription der Ziel-gen16.

Zur Vereinfachung der bisher gemeldeten EcR-basierte Gens schaltet16,18, wir kombiniert die binäre Funktionen des Systems in einen einzigen Vektor, ausgestattet mit allen erforderlichen Elementen für anregende Transgene Ausdruck und dann bezeichnet die neu generierten Vektor, pEUI(+) (GenBank Zbl-Nummer: KP123436, Abbildung 1A)15. Der Effektor reagieren auf den GvEcR-Treiber (im folgenden Treiber) besteht aus zehn Tandem UAS neben einem E1b minimal Förderer, gefolgt von einer Site mit mehreren Klonen (MCS) wiederholt mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Erkennungssequenzen (Abbildung 1 b). Zusätzlich, um die Auswahl zu erleichtern transfizierten Zellen, einer SV40 Projektträger-gesteuerte Puromycin N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen wurde zwischen den Fahrer und Effektor Regionen weiterhin stabilen Zelllinien (Abbildung 1) gelegt.

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die transiente und stabile Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+). Darüber hinaus bieten wir detaillierte Anweisungen für den erfolgreichen Einsatz von Teb als Agonist Ecdyson.

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Protokoll

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1. Subcloning Transgen

  1. Wählen Sie eine entsprechende Restriktionsenzym Anerkennung Seite (oder Seiten) in der MCS pEUI(+) und subclone das Gen des Interesses in die gewünschte Richtung (Abbildung 1).
    Hinweis: Wiederholen Sie EGFP oder Flagge Epitop-Tags Ankyrin-Repeat-(AR)-Domäne 13A (ANKRD13A) Transgen EcoRI Standort des pEUI(+)-Vektors mit T4-DNA-Polymerase in einer Sequenz-Ligatur unabhängig und Klonen Methode19subcloned wurde.
  2. Linearisieren der pEUI(+) mit EcoRI für 1 h bei 37 ° C. Mix 50 ng/µL linearisiert pEUI(+) mit 40 ng/µL des PCR verstärkt EGFP oder ANKRD13A, und reagieren mit T4-DNA-Polymerase (1 HE) für 1 min bei Raumtemperatur (RT) vor der Inkubation auf Eis für 10 min. Fügen Sie 10 µL des Reaktionsgemisches direkt mit 100 µL DH10B kompetente Zellen für die folgende Transformation experimentieren.
    Hinweis: Obwohl die MCS pEUI(+) (Abbildung 1 b) mehrere Anerkennung Beschränkungsenzymsites hinzugefügt wurden, empfehlen wir das Zielgen in die EcoRI-Website subcloning Ligatur-unabhängige Klonen Technologie19,20.
  3. Überprüfen Sie die Einlage durch Sequenzierung und dann reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Reinigung-Kit zur Transfektion geeignet ist.

(2) Transiente Transfektion und Teb Behandlung

  1. Bereiten Sie vier Zelle Kultur Gerichte (60 mm Durchmesser) mit frisch passagiert HEK293 Zellen in 5 mL Medium Dulbeccos modifizierten Eagle (DMEM) ergänzt mit 5-10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika (100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin). Im folgenden stellt "Zellkulturmedium" oder einfach "Nährboden" der DMEM mit FBS und Antibiotika ergänzt. Pflegen Sie die HEK293 Zellen bei 37 ° C.
  2. Transfizieren Sie 1 µg der gereinigte DNA in HEK293 Zellen bei 50-60 % Dichte mit 3 µL Transfection Reagens. Die Transfektion Reagenz zu 200 µL des Verdünnungsmittels (DMEM ohne FBS und Antibiotika) hinzufügen, die die DNA enthält. Fügen Sie nach der Inkubation der Reaktionsmischung für 30 min bei RT die Mischung auf HEK-293-Zellen in der Kulturschale. Verwenden Sie zwei Gerichte zur Transfektion, und lassen Sie die anderen beiden unbehandelt als Steuerelemente.
  3. Fügen Sie nach 12-24 h Transfektion Teb (Endkonzentrationen, 0,2 - 10 µmol) zu einem der transfizierten Proben und eines der Steuerelemente nicht transfiziert. Lassen Sie die anderen beiden Proben als experimentelle Kontrolle unbehandelt.
    Hinweis: Der Teb-Stammlösung (50 mM in Dimethyl Sulfoxid aufgelöst) kann im Zellkulturmedium, DMEM oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine geeignete Konzentration vor der kultivierten Zellen abhängig von den experimentellen Parameter hinzufügen verdünnt werden. Vermeiden Sie jedoch durch die geringe Löslichkeit des Teb in wässriger Lösung, Vorbereitung einen master-Mix mit einer hohen Konzentration von Teb in Medium; Stattdessen ersetzen Sie die komplette Zellkulturmedium mit frischen Teb auf die gewünschte Konzentration-haltigem Medium.
  4. Pflegen der Teb-behandelten und unbehandelten Zellen für 12-48 h bei 37 ° C.
  5. Wenn mit EGFP einfügen, analysieren Sie EGFP Ausdruck unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ( Abbildung 2). Ansonsten Ernten der Zellen für eine Immunoblotting-Assay.
    1. Spülen Sie für die Immunoblotting-Assay die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS und dann kratzen sie heraus mit einem Schaber Zelle.
    2. Für die Zellen häufen, spin-down die Ernten in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C (RT).
    3. Nach der PBS komplett verwerfen, hinzufügen 0,5 mL eiskaltes Säugetier-Protein Extraktion Reagenz (M-pro), zusammen mit Protease-Inhibitor (5 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail), um das Diabolo, wenn die Zellen in einer 60 mm Petrischale kultiviert werden.
    4. Wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit mehreren Verhandlungsrunden pipettieren und inkubieren Sie die suspendierten Zellen für 15 min bei 18-25 ° C (RT).
    5. Drehen Sie die Zelle lysate 21.000 x g für 10 min bei 4 ° C.
    6. Übertragen Sie die wässrigen Überstands zu einem frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    7. Den Überstand durch Immunoblotting, folgende standard-Protokolle mit entsprechenden Antikörpern zu analysieren.

3. Generation von stabilen HEK293 Zelllinien mit genomischen Integration der pEUI(+) Gene Switch

  1. Transfizieren Sie 5-10 µg des gereinigten pEUI(+) mit das Transgen in HEK293 Zellen, die 50-60 % Zusammenfluss in der Kulturschale 90 mm Durchmesser Zelle mit 15-30 µL des Transfection Reagens. Die Transfektion Reagenz zu 500 µL des Verdünnungsmittels (DMEM ohne FBS und Antibiotika) hinzufügen, die die DNA enthält. Fügen Sie nach der Inkubation der Reaktionsmischung für 30 min bei RT die Mischung auf HEK-293-Zellen in der Kulturschale.
  2. Ermöglichen Sie nach der Transfektion die Transfectants wachsen und express Puromycin-Widerstand Genprodukte unter nicht-selektiven Kulturmedium (ohne Puromycin) für 24-48 h bei 37 ° C.
  3. Die Zellen von den Kultur-Speisen durch Trypsinization zu distanzieren. Spülen Sie nach verwerfen das Kulturmedium die Transfectants mit vorgewärmten PBS (37 ° C), fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 1 min bei 37 ° c inkubieren Nach dem abschrecken Trypsin/EDTA durch Zugabe von vorgewärmten Kulturmedium (10 mL, 37 ° C), Ernten Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, gefolgt durch Zentrifugieren in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C.
  4. Wieder aussetzen der Transfectants in 50 mL vorgewärmten Kulturmedium (37 ° C) und Transfer 10 mL der Zellen in 90 mm Frischzellen-Kultur Gerichte. Kulturzellen bei 37 ° C bis 50-60 % Konfluenz vor der Puromycin-Behandlung (in der Regel dauert dies etwa 24-48 h).
  5. Pflegen Sie die Transfectants bei 37 ° C im Zellkulturmedium für 3-4 Wochen mit 3 µg/mL Puromycin ergänzt. Während der Auswahl ändern Sie das Zellkulturmedium mit Puromycin (3 µg/mL) alle 2-3 Tage um Selektionsdruck zu erhalten. Wenn die Zellen voll konfluierende werden, teilen Sie sie nach den Verfahren in Schritten 3.3 3.4, mit Puromycin-haltigen Kulturmedium. Die restlichen Zellen in das Kulturmedium zu verwerfen, wenn nicht benötigt.
    Hinweis: Puromycin Selektionsbedingungen müssen experimentell für bestimmte Zelltypen hergestellt werden. Wir haben 3 µg/mL von Puromycin in Zellkulturmedium verwendet; Dies war genug, um Zelltod in nicht-transfizierten HEK293 induzieren.
  6. Ernte der Zellen aus einzelnen Kolonien, mit einem Klon Zylinder, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    1. Entsorgen Sie das Zellkulturmedium. Spülen Sie die Platte zweimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS, schwimmende Zellen zu entfernen.
    2. Mit sterilen Pinzette set Klonen Zylinder über den einzelnen Kolonien.
    3. Jeder Zylinder 0,2 mL 0,35 % Trypsin/EDTA hinzufügen.
    4. Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C für 1 min, bis die Zellen freistehende sind, und fügen Sie ein paar Tropfen Kulturmedium vorgewärmt (37 ° C) zu den Zylindern.
    5. Übertragen Sie die Zellen von jeder Zylinder auf individuelle Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 2 mL Kulturmedium und 1 µg/mL Puromycin in jede Vertiefung.
      Hinweis: Wenn die Zellen konfluierende werden, Skalieren Sie die Kultur. Clone(s) kann jetzt festgelegt werden.
  7. Erhalten Sie individuelle Klone im Zellkulturmedium mit 1 µg/mL Puromycin ergänzt.
  8. Einzelne Kolonien durch die Prüfung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Teb Behandlung (Endkonzentration, 10 µM) für 24 h Test der Reaktionsfähigkeit der Klone, die Teb analysiert die Expression des Transgens mit Immunoblotting überprüft. Wählen Sie einen gewünschten Klon (oder Klonen). Pflegen Sie eine Teb behandelt und eine unbehandelte Probe in Kulturmedium für 12-48 h bei 37 ° C vor der Analyse der Induktion-Ebene des Transgens. Die Expression des Transgens kann durch Immunoblotting, nach den Verfahren in Schritten 2.5.1 - 2.5.7 gemessen werden.

4. Abbau der Teb

  1. Die Teb Reize indem Teb enthaltenden Zellkulturmedium mit Teb-freies Medium zu stillen.
    Hinweis: Es wird empfohlen, die Wachstumsmedien zu ersetzen, ohne ersten Seeding der Zellen auf eine neue Kulturschale. Verbleibende Teb scheint an der Plastikschale festhalten und eine starken Hintergrund-Expression des Transgens zu entlocken. Vor dem Seeding der Zellen auf eine neue Kultur-Platte, spülen Sie die geernteten Zellen mehrmals mit Kulturmedium oder PBS.
    1. Die Zellen von den Kultur-Speisen durch Trypsinization zu distanzieren. Spülen Sie nach verwerfen die Teb mit Nährmedium die Teb-stimulierten Zellen zweimal mit vorgewärmten PBS (37 ° C), fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/EDTA und 1 min bei 37 ° c inkubieren Nach dem abschrecken Trypsin/EDTA durch Zugabe von vorgewärmten Teb-freien Kulturmedium (10 mL, 37 ° C), Ernten Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, gefolgt durch Zentrifugieren in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C.
    2. Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 50 mL vorgewärmten Teb-freien Kulturmedium (37 ° C) und Transfer 5 mL der Zellen in drei 60 mm Frischzellen-Kultur Gerichte. Die Zellen bei 37 ° C für 24, 48 und 72 h bzw. Kultur.
    3. Ernte der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten und die Expression des Transgens mithilfe Immunoblotting zu messen.
      Hinweis: Unter diesen Versuchsbedingungen wurde die Expression des Transgens nicht nachweisbar etwa 3 Tage Post-Kultur der Zellen in der Teb-freies kulturelles Medium (Abbildung 3). Die Expression des Transgens kann durch Immunoblotting, gemäß Schritte 2.5.1 - 2.5.7 gemessen werden.

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Ergebnisse

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Die GvEcR-basierte singuläre Genschalter ist in Figur 1Adargestellt. Der pEUI(+) Vektor wurde durch die Behandlung mit Teb für regulierte Transgene Ausdruck optimiert. Die Effektor-Region des pEUI(+) umfasst eine 10xUAS und ein E1b minimal Projektträger eine MCS mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Anerkennung Beschränkungsenzymsites folgen. Ein SV40 poly(A) Signal wurde hinter der MCS (Abbildung 1 b) hinzugefügt. Ein P...

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Diskussion

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Der größte Nachteil der Verwendung eines binären Genschalter Ausdruck ist die Notwendigkeit, zwei separate Plasmide (Fahrer und Effektor) gleichzeitig in die Zielzelle zu liefern. Dies führt zu einer ungleichen Verteilung von Plasmiden und Ergebnis in einer inkonsistenten Antwort des Schalters auf der Induktoren1,2,3. Ein weiterer Nachteil der zwei-Vektor-System ist, dass ein Minimum von zwei Runden von Antibiotika Auswahl erfor...

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Offenlegungen

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Wir haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Danksagungen

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Die Autoren danken für wertvolle Kommentare und gründlichen Lektüre unserer Handschrift S-Y Choi (Chonnam National University). Diese Arbeit wurde durch einen Forschungsfonds der Chungnam National University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pEUI(+)TransLabDie Patentlizenz wurde an TransLab Inc. übertragen 
Gen-Fect Transfection ReagenzTransLab TLC-001
HEK293ATCCCRL-1573
TebufenozidFluka31652
KlonierungszylinderSigmaCLS31668
PuromycinCorning58-58-2
AntibiotikaGibco15240-062
Trypsin-EDTAWelgeneLS015-01
DMEMWelgeneLM001-05
Fötales RinderserumWelgeneS001-01
ZellkulturschaleSPL life science11090
Maus FLAG M2SigmaF3165
Anti-Alpha-Tubulin-AntikörperCalbiochemCP06
KlonierungszylinderSigmaCLS31668
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410.1
M-PER Säugetierprotein
Extraktionsreagenz		Thermo Fisher78505
100X Proteaseinhibitor Cock. IIIT& IBPI-9200

Referenzen

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Schlagwörter

Transgene ExpressionTebufenozid InduktorHEK 293 ZellenFluoreszenzmikroskopieImmunoblotting Analysereversibles ExpressionssystemBehandlung mit chemischem Induktortransiente stabile Transfektion

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