Method Article

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

DOI:

10.3791/57497

⸱

April 27th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

In This Article

Summary

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Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Abstract

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Der Maiswurzelbohrer (WCR) ist ein wichtiger Schädling von Mais und ist bekannt für seine Fähigkeit, schnell zu Pest Managementstrategien anzupassen. RNA-Interferenz (RNAi) erwies sich ein leistungsfähiges Werkzeug für WCR Biologie zu studieren, hat aber seine Grenzen. Speziell, RNAi selbst vergänglich ist (d. h. nicht zu langfristigen Mendelian Erbschaft des zugehörigen Phänotyps), und es erfordert eine Kenntnis der DNA-Sequenz des Zielgens. Letzteres kann die Begrenzung wenn der Phänotyp des Interesses von schlecht erhaltenen oder auch neuartigen Genen gesteuert wird weil er einfach nur nützliche Ziele schwierig sein würde, wenn nicht gar unmöglich. Daher sollte die Anzahl der Werkzeuge in WCRs genomische Toolbox durch die Entwicklung von Methoden, die verwendet werden könnte, um stabile mutierte Stämme erstellen und aktivieren Sequenz-unabhängige Umfragen des Genoms WCR erweitert werden. Hier zeigen wir die Methoden zum Erfassen und microinject precellular WCR Embryonen mit Nukleinsäuren verwendet. Während die hier beschriebenen Protokolle auf die Schaffung von transgenen WCR ausgerichtet sind, könnte CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung auch mit durchgeführt werden die gleichen Protokolle mit dem einzigen Unterschied, die Zusammensetzung der Lösung in die Embryonen injiziert.

Introduction

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Maiswurzelbohrer (WCR), Diabrotica Virgifera Virgifera, ist ein wichtiger Schädling von Mais1. Interessanterweise scheint WCR Überwindung Kontrolle Maßnahmen schneller als die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge, da sie nicht nur physiologisch sondern auch verhaltensorientierte2,3,4,5, anpassen 6. im letzten Jahrzehnt RNA-Interferenz (RNAi), ein leistungsfähiges funktionelle Genomik Werkzeug, wurde als eine mögliche Steuerungsmethode für WCR7....

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Protocol

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(1) Kolonie-Ebene Aufzucht von WCR Erwachsene

  1. Erhalten Sie eine ausreichende Menge an WCR Erwachsene (500-1.000) von einem zuverlässigen Unternehmen oder Forschung Labor (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) und legen Sie in einem 30 cm3 -Käfig.
    Hinweis: Eine nicht ruhenden Belastung wird sehr empfohlen.
  2. WCR künstliche Ernährung nach Protokoll des Herstellers vorbereiten und Gießen Sie eine 1 cm dicken Schicht in eine 38 Unzen-Container (siehe Tabelle der Materialien). Nach dem Mischen speichern Sie ungenutzte Diät bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
  3. Setzen Sie eine Petrischale (100 x ....

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Results

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Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung dieses Protokolls war die Phase der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Mikroinjektion. Insbesondere erfordert Keimbahn Transformation Mikroinjektion von DNA vor der embryonalen Cellularization. Und zwar deshalb, weil DNAs Zellmembranen leicht überschreiten können. Versuche, die Phasen des WCR Embryonalentwicklung mit einem nuklearen Fleck visualisieren blieben erfolglos, weil Dechorionation WCR Embryonen im Wesentlichen alle verantwortlich für .......

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Discussion

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Obwohl Mikroinjektion des WCR mit DsRNAs zum Zwecke der RNAi gemeldeten9wurde, dies ist das erste Protokoll, best Practices für microinjecting precellular WCR Embryonen, ein kritischer Prozess für die Durchführung von Keimbahn Transformation zu etablieren und/oder CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung in dieser Art. Erfolgreiche Mikroinjektion WCR Embryonen ist abhängig von vielen Faktoren ab, wie transformationseffizienz. Nachfolgend sind einige der wichtigsten Fragen das Ergebnis unter Verwendung dieses.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Forschungsprogramm von Monsanto Mais Maiswurzelbohrer wissen, MDL aus NCSU Nummer AG/1005 (, MDL und YC) und Startkapital gewähren. Gewähren Sie FC wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Monsantos Mais Maiswurzelbohrer wissen Research Program (AG/1005) und der National Science Foundation, Nummer MCB-1244772 (MDL). Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. FC und MDL konzipiert und gestaltet die Experimente; FC, PW und SP durchgeführt die Experimente; FC und MDL analysiert die Ergebnisse; und FC, NG und MDL schrieb das Manuskript. Teresa O'Leary, William Klobasa und Stephanie Gorski danken wir für ihre ko....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Qualitatives Filterpapier (Schwarz)Ahlstrom8613-0900Für Ei Mikroinjektion
1 oz Behälter Anny's Plastic TablewareASET101Egg Container
Drosophila Agar Typ IIApex66-103Substrat für WCR Eiablageschale
Federleichte PinzetteBioquip4748Umgang mit Larven und Puppen 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Mais und Geschirr waschen
Trucker's Favorite YellowCoor Farm Supply502Mais zum Füttern WCR
Microinjection System (hausgemacht)NATeile & Anweisungen auf Anfrage erhältlichSteuert den Injektionsdruck (0-20 psi)
Elmer's ungiftiger KleberElmer's Products, Inc.E304Eier auf Filterpapier kleben
epTIPS Microloader-SpitzenEppendorfC2554691Verfüllnadeln Ladespitzen
Falcon GewebekulturschalenFalcon25383-103Keimen von Mais /150 x 25 mm
Fisherbrand  Filterpapier in quantitativer Qualität KreiseFisher ScientificS47576CHerstellung einer Agarschale für die Eiablage/9 cm
Sparkleen FisherScientific04-320-4Waschgeschirr
Einfache ObjektträgerFisher Scientific12-549-3Halten von Filterpapier und Eiern für die Mikroinjektion
Westlicher Maiswurzelbohrer ohne PollenersatzFrontier Agricultural Sciences F9766BWCR Künstliche Ernährung für Erwachsene
Wattebäusche, großGenesee Scientific51-101Schließen Sie den Kolben
Globe Scientific 3,0 mL Kleine KugeltransferpipettenGlobe Scientific137035Sammeln und übertragen Sie Eier
Leica M165 FC Fluoreszenz-Stereomikroskop LeicaM165 FC WCR-Screening
DsRed Filterset für Fluoreszenz-StereomikroskopLeicaDSRAnregungsfilter: 510-560 nm, Emissionsfilter: 590-650 nm
EGFP FilterLeicaGFP2Anregungsfilter: 440– 520 nm, Emissionsfilter: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PKäfig für adulte Kolonie
Miniatur-PinselMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Joystick MikromanipulatorNarishigeMN-151Mikromanipulator und Nadelhalter
Mikroskop XY TischOlympus265515Mikroskoptisch (angepasst für die Verwendung mit Stereoskop)
Grade 90 CheeseclothOnline Fabric StoreCHEE90Für Eiablage
Kunststoff Paraffinfolie Pechiney Plastic PackagingPM-996Siegel Agarschale nach Mikroinjektion / Rollengröße 4 Zoll x 125 ft
Percival InkubatorPercival I41VLH3C8WCR-Anzuchtkammer (Inkubator für die Insektenaufzucht)
Erlenmeyerkolben mit engem MalsVWR4980-300-PKWasserbehälter für adulte Völker 
Griffin Low Form BecherVWR1000-600-PKFür die Eierwäsche
Geflochtene WatterollenRichmond Dental Cotton Co.605-3599Verwendung in der Wasserversorgung für adulte Völker 
Petrischalen (35x10mm)SIGMACLS430588-500EAFür Diätplatten
PhenolrotSigma143-78-8Mikroinjektionspuffer
Laserbasierter MikropipiettenabzieherSutter InstrumentP-2000/GNadelabzieher/Hitze = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Premium MutterbodenThe Scotts Company71130758Erde für den Cron-Anbau
Reloc Zippit 2 Mil Zipper BagsUnited States Plastic Corporation48342Tasche Agarschale nach Mikroinjektion / 5x7
Petrischalen (100x15m)VWR89038-968Herstellung von Agarschale für die Eiablage / 100 x 15 mm
6 oz BehälterWebstaurantstore128E506WCR Einzelpaar Paar-Paarungskammer 
38 oz BehälterWebstaurantstore128NC888Larvenaufzuchtbox/38
oz ChoiceHD 16 oz. Mikrowellentauglicher durchscheinender Kunststoff Deli ContainerWebstaurantstore128HRD16Larvenaufzuchtbox/16 oz
Mikroinjektion Zielfernrohr Wild HeerbruggWILD-M8Mikroinjektions-Zielfernrohr mit einem XY-Tisch
Standard-GlaskapillarenWorld Precision Instruments1B100F-4Mikroinjektionsnadeln
Westlicher MaiswurzelbohrerCenteral Aqricultural research laboratoryNicht-Diapase-StammAnfrage von Dr. Bryan Wade Französisches Labor
Plasmid DNA Midi KitQiagen12143Aufreinigung von injektionsfertigen Plasmid-DNAs
Erwachsene North

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.

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Western Corn RootwormEmbryo MicroinjectionGermline TransformationCRISPR Cas9 Genome EditingPlasmid InjectionBorosilicate NeedlesMicromanipulator TechniqueEgg Collection ProtocolEmbryo PreparationLarval Rearing

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