Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

Summary

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

Abstract

Eine Reihe von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse und Lambda (λ) Select cII Mutation Detection System für Mutagenität Experimente von vielen Forschergruppen weltweit eingesetzt worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Lambda wählen Sie cII Mutation Assay, die kultivierten Zellen von transgenen Mäusen/Ratten angewendet werden können oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (1) Isolierung genomischer DNA aus den Zellen oder Organe/Gewebe von transgenen Tieren behandelt in Vitro oder in Vivo, jeweils mit einer Testverbindung; (2) Wiederherstellung des Lambda-Shuttle Vektors mit mutagenen Reportergen (d.h. cII Transgen) aus genomischer DNA; (3) Verpackung der geretteten Vektoren in infektiösen Bakteriophagen; (4) ein Host-Bakterium infizieren und Kultivierung unter selektiven Bedingungen zur Vermehrung der induzierten cII Mutationen erlauben; und (5) Bewertung der cII-Mutanten und DNA-Sequenz-Analyse zur Ermittlung der Mutantenhäufigkeit cII und Mutation Spektrum bzw..

Introduction

Eine Vielzahl von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse Big Blue (im folgenden als BB bezeichnet) und λ Select cII Mutation Detection System von dieser Gruppe und viele andere Forschung Gruppen weltweit^{1,2für Mutagenität Experimente eingesetzt worden, 3,4,5,6,7,8....}

Protocol

1. genomischer DNA-Isolierung aus embryonalen Fibroblasten der Maus

Hinweis: Primäre Maustaste embryonalen Fibroblasten sind nach den veröffentlichten Protokoll⁵³von Embryonen abgeleitet von BB transgenen Mäusen C57BL/6 genetischen hintergrund isoliert. Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll besteht aus 1 x 10⁶ bis 1 x 10⁷ embryonalen fibroblastenzellen mit einem Test zusammengesetzte versus Kontrolle behandelt. Die Ernte und die Zählung der diese Zellen unter Verwendung von standard-Methoden werden in Referenzen^10,54,

Results

Je nach Verteilung der Daten werden parametrische oder nicht-parametrische Tests verwendet, um die Bedeutung der Unterschied in der Mutantenhäufigkeit cII zwischen Behandlung und Kontrollgruppen (d. h.im Vergleich zu spontanen mutierten Frequenzen induziert) bestimmen . Vergleich der induzierten cII mutierten Frequenzen in ganz verschiedenen Behandlungsgruppen erfolgt durch verschiedene (paarweise) statistische Tests, soweit anwendbar. Hypergeometrische Test von.......

Discussion

Der λ-Select cII -Test dient zum Nachweis von Mutationen in der cII -Transgen erholt aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von BB Nagetiere³. Das Genom dieser transgenen Tiere enthält mehrere Tandem Kopien der chromosomal integrierte λLIZ Shuttle-Vektor, der die cII trägt (294 bp) und LacI (1.080 bp) transgene, als die Mutationszucht Reporter Gene^{1, 2 , 25}. λ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	MO Bio Laboratories, Inc.	12112-05	Bakteriologisches
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific	4337455	Keine
Casein Pepton	Alfa Aesar	H26557	Keine
Gelatine	J. T. Baker	2124-01	Pulver
Glycerin	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	Keine
LB Agar	Fisher Scientific	BP 9724-500	Keine
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	8104	50 PCR-Aufreinigungsreaktionen
Natriumacetat-Trihydrat	Fisher Scientific	M-15756	Keine
Taq5000 DNA-Polymerase	Qiagen	201207	None
Thiaminhydrochlorid	Macron Fine Chemicals	2722-57	None
Transpack Packaging Extract	Stratagene Corp., übernommen von BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 Verpackungsreaktionen
Tris Base	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	Keine
Trypton	Biosciences	RC-110	Keine