Summary
Her presenterer vi en protokoll for å beskrive ekstracellulære blemmer (EVs) isolasjon i vitro kulturperler medium fra voksen Schistosoma japonicum.
Abstract
Ekstracellulære blemmer (EVs) er membranous blemmer utgitt av en rekke celler i den ekstracellulære microenvironment. EVs representerer innbyggere heterogene blemmer, hvis størrelse varierer mellom 40 og 1000 nm. Akkumulerte bevis indikerte at EVs spille viktige forskrifter roller i patogen vert interaksjoner. En dyp forståelse av schistosome EVs skal gi innsikt i mekanismene bak schistosome vert interaksjoner, slik at utviklingen av romanen strategier mot schistosomiasis. Her, mål vårt er å ytterligere studere EVs funksjoner i schistosomes ved å presentere en protokoll for isolering og karakterisering av EVs fra voksen Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs ble isolert fra i vitro kultur medium med sentrifugering kombinert med en kommersiell exosome isolering kit. Den isolerte S. japonicum EVs (SjEVs) vanligvis har en diameter på 100-400 nm, og er preget av overføring elektronisk mikroskopi og vestlige blotting. Bruken av PKH67 dye-merket SjEVs har vist at SjEVs er internalisert mottaker cellene. Samlet gir våre protokollen en alternativ metode for å isolere EVs fra voksen schistosomes; den isolerte SjEVs kan være egnet for funksjonsanalyse.
Introduction
Ekstracellulære blemmer (EVs) er en befolkning på små membran-bundet blemmer innkapslet med ulike proteiner, lipider og atomer syren. Nyere studier har vist at EVs spille en avgjørende rolle i celle-celle kommunikasjon, og er involvert i regulering av mange fysiologiske prosesser, inkludert celle utvikling, immun regulering, angiogenese og celle migrasjon2, 3,4,5. Samler bevis indikerer at EVs, sirkulerer exosomes og frakten miRNA representerer potensielle biomarkers av visse sykdommer6.
Flere protozoer som Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziog Leishmania spp., har vist seg å bli kjøpedyktig skille ut EVs; helminths i tillegg er funnet å skille ut EVs til levende vert7. Parasittiske EVs har vist seg å være involvert i vedlikehold av infeksjon, virusets8og immun regulering9. Nyere studier i schistosomes begge Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 og S. japonicum12 har indikert at voksen schistosomes skiller exosome som blemmer som kan involvert i funksjonelle forskrift av bestemte biologiske prosesser.
Hittil har flere metoder brukt isolere ekstracellulære blemmer, som ultracentrifugation, ultrafiltrasjon13, bruk av polymer-baserte reagenser, størrelse-utestenging kromatografi og immunoaffinity isolasjon. Disse forskjellige metodene har sine egne fordeler og begrensninger14. Ultracentrifugation regnes vanligvis metoden gullstandarden for vesicle isolasjon. Men lider denne metoden av begrensning av potensielle EV aggregering14.
I schistosomes, et par metoder er rapportert for EV isolasjon: ultracentrifugation11,12,10 og bruk av kommersielle EV isolering kit16 for flere etapper (egg16, schistosomula11, voksen schistosomes10,12,17). Gitt at microvesicles er av en rekke størrelse fra flere hundre nanometer tusen nanometer, utviklet vi en alternativ metode som kombinerer med bruk av benken sentrifuge, ultrafiltrasjon og en kommersiell EV isolering kit å isolere EVs fra voksen Schistosoma japonicum. De isolerte EVs vanligvis hadde en diameter på 100-400 nm og var vellykket internalisert mottaker cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av den lokale etikk av Shanghai Veterinary Research Institute, kinesiske akademi for landbruksvitenskap (tillater tall: SHVRIAU-14-0101).
1. i Vitro kulturen i Schistosomes
Merk: Schistosomes representerer en biohazard. Arbeidere bør ha gummihansker på alle tider når håndtering av ormer, schistosomal suspensjon eller andre relaterte biologisk materiale. New Zealand kaniner var infisert med ~ 2000 cercariae via abdominal eksponering. Schistosomes på leveren scenen ble samlet fra kaniner infisert med S. japonicum cercariae på 28 dager etter smitte av perfusjon av leveren og hvem årer. Prosedyrene for ormen samling har blitt referert i tidligere publikasjoner rapportering studier i mus18.
- Samle parasitter i en 500-mL kanne. Vask dem grundig og forsiktig 3 x med 200 mL forvarmet (37 ° C) PBS (pH 7.4).
- Skille ~ 200 ormen par for hver 90 mm Petriskål. Deretter vaske parasitter grundig og forsiktig 2 x med 50 mL forvarmet (37 ° C) RPMI-1640 kultur medium som inneholder 100 U av penicillin og 100 mg/mL streptomycin.
- Opprettholde parasitter i 40 mL forvarmet RPMI-1640 kultur medium uten antibiotika på 37 ° C under 5% CO2 på en tetthet av ~ 5 ormen par /mL for 2 h i 90 mm Petri rett.
Notater: RPMI 1640 medium bør ikke inneholde serum, ellers eksogene ekstracellulære vesicle vil bli introdusert.
2. pre-behandlet tilstand Media
- Samle kultur medium og deretter virvel middels på 4 ° C 2000 × g i 30 minutter til fjerne egg og ormen tegmental rusk.
- Overføre nedbryting slik frisk og filtrere løsningen bruker filtere 0.22 µm sprøyten.
- Samle filtrerte løsningen i en dialyzed bag (molekylvekt cut-off: 3.5kD) og deretter dialyze løsningen med 8% PEG8000 løsning på 4 ° C over natten.
Notater: Dette trinnet er viktig å berike SjEVs for å øke avkastningen av SjEVs isolasjon.
3. isolering av SjEVs
- Overføre dialyzed løsningen til et nytt rør og deretter legge 0,5 mengder totalt exosome isolasjon reagensen.
- Bland løsningen godt av vortexing eller pipettering opp og ned for å sikre homogenitet av løsningen.
- Inkuber blandingen på 2 ° C 8 ° c over natten.
- Sentrifuge blandingen på 15.000 × g 1t 2 ° c til 8 ° C.
- Sug opp og kast nedbryting.
Notater: EVs finnes i pellet nederst på røret (ikke synlig i de fleste tilfeller). - Resuspend EVs pellet i 2 mL PBS og deretter lagre EVs løsningen ved-80 ° C til videre analyse.
4. karakterisering av EVs av vestlige Blotting
- Bestemme protein konsentrasjonen av SjEVs prøven, f.eks av BCA analysen.
- Forberede 10-20 µg på Evens 22,5 µL RIPA buffer. Deretter Legg 7,5 µL av 4 x lasting buffer og varme i 5 min på 95 ° C.
- Skille SjEVs proteiner ved 12% SDS side gel.
- Overføre proteiner til PVDF membran og deretter sonde med anti-CD63 antistoffer (1:1, 000 fortynning), etterfulgt av undersøkelser med anti-kanin IgG-HRP (1:5, 000 fortynning).
- Benytte ECL oppdagelsen reagens til membran utviklingen og oppdage signaler ved en chemiluminescence tenkelig system.
5. karakterisering av EVs ved overføring elektronmikroskop
- Legg 2 µL av isolerte SjEVs til 200 mesh formvar-belagt rutenett og deretter la dem tørke i romtemperatur.
- Flekker med 2% Phosphotungstic syre for 1 min, og deretter la dem tørke i romtemperatur.
- Last rutenettene bort på sample innehaver av elektronmikroskop overføring og utsatt for 80 kV elektronstråler for bildebehandling.
6. SjEVs etiketten med PKH67 og celle opptaksanalyse
Notater: Alle etterfølgende trinnene ble utført ved romtemperatur (20-25 ° C), med mindre annet er angitt.
- Overføre 5 µg SjEVs løsning til en konisk bunnen polypropylen rør og juster volumet til 12 mL ved å legge RPMI 1640 medium.
- Sentrifuge SjEVs 110.000 × g for 90 minutter til 4 ° C for å pellets SjEVs.
- Etter sentrifugering, nøye Sug opp nedbryting.
Merk: PKH67 ethanolic fargestoff bør ikke legges direkte til SjEV pellets, som dette vil resultere i heterogene flekker og redusert celle levedyktighet. - Forberede en 2 x EV suspensjonen løsning ved å legge til 1 mL av fortynningsmiddel C SjEV pellets; for å sikre fullstendig spredning, resuspend med mild pipettering.
- Like før flekker i fortynningsmiddel C, forberede en fersk 2 x fargestoff løsning ved å legge 2 µL av PKH67 ethanolic fargestoff løsningen til 1 mL av fortynningsmiddel C i et polypropylen sentrifuge rør og blander godt for å spre.
- Raskt legge til 1 mL av 2 x EV suspensjon (trinn 6.4) til 1 mL av 2 x fargestoff løsning (trinn 6.5) og umiddelbart blande utvalget av pipettering.
- Inkuber blandingen ved romtemperatur for 4 min.
- Stopp den flekker ved å legge 4 mL FBS og deretter ruge for 1 min.
- Legg RPMI1640 medium for å justere volumet til 12 mL og deretter virvel 110.000 × g på 4 ° C i 90 min.
- Fjern nedbryting og legge RPMI1640 medium resuspend PKH67 merket SjEV pellets.
- Sentrifuge 110.000 × g på 4 ° C i 90 min vask en gang og deretter legge til PBS å resuspend SjEVs pellets.
7. SjEVs celle opptaksanalyse
- Frø pattedyrceller som NCTC klone 1469 celler eller HEK293T celler i 6-vel plater (2 × 105 celler per brønn) og kultur cellene over natten.
- Legg til 5 µg PKH67-merket SjEVs og deretter kultur cellene på 37 ° C 2-4 h.
- Etter inkubasjon fjerne mediet og vask cellene med PBS to ganger.
- Fastsette cellene med 4% formaldehyd løsningen i 15 min og vasket to ganger mer med PBS.
- Stain celle kjerner med 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Merke celler med fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å kvantifisere avkastningen av isolerte SjEVs bruker beskrevet protokollen, brukte vi BCA protein analysen til protein konsentrasjonen av den isolerte SjEVs fra 28-dagers voksen schistosomes. Som vist i tabell 1, varierte SjEV protein konsentrasjonen 208 µg til 250 µg per 100 mL medium (tabell 1). Partikkelstørrelse, som Malvern hydrogenion analyse, indikerte at den isolerte SjEVs varierte fra 100 nm til 400 nm, med høyest befolkning rundt 220 nm i størrelse (figur 1). Ytterligere karakterisering av SjEVs ved overføring elektronmikroskop avslørte EVs skal runde blemmer av ca 100-200 nm i diameter (figur 2). Western blotting analyser indikerte at de isolerte SjEVs ble anerkjent med CD63 antistoffer, som er en typisk EV (Figur 3). Fluorescens mikroskopi observasjon indikerte at de PKH67-merket SjEVs var internalisert NCTC klone 1,469 cellene og at SjEVs hovedsakelig ble distribuert i cytoplasma i mottakerens celler (Figur 4).
| Prøver | EVs / 100ml kultur medium |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tabell 1: SjEVs protein innhentet fra kultur medium, hvor av SjEVs tilgang til BCA analysen per 100 mL kultur medium, som inneholder ~ 500 ormen par,.
Figur 1 : Størrelse distribusjon av SjEVs isolert fra kulturperler medium. 20 µL SjEVs løsning var fortynnet med 1000 µL PBS; blandingen ble deretter analysert ved hjelp av en høy ytelse to vinkel partikkel og molekylær størrelse analyzer. Resultatet vises er representant for data fra tre uavhengige isolasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Karakterisering av SjEVs ved overføring elektronmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Vestlige blotting analyse av de isolerte SjEVs mot CD63 antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Opptak av SjEVs av pattedyrceller. PKH merket SjEVs vises i grønt, mens celle kjerner vises i blått. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyere studier på EVs har vist at schistosome EVs spiller en viktig rolle i vert-patogen interaksjoner3,9,12,16. Til ytterligere adressen deres juridiske funksjoner, er det viktig å isolere EVs fra schistosomes. Her beskriver vi en alternativ metode for SjEV isolasjon. Denne metoden gir en rekke størrelsen på SjEVs, 100 nm til 400 nm, i voksen S. japonicum. De følgende cellen opptaksanalyse som indikerte at EVs isolert under beskrevet protokollen var vellykket internalisert av mottakeren cellene og at deres tilknyttede miRNAs potensielt spille regulatoriske roller17.
EVs, som kan skilles ut av mange forskjellige typer celler, finnes også i ulike typer av kroppsvæsker19. Derfor er det viktig å unngå kunstig innføring eksogene EVs under prosessen med SjEV isolasjon. For eksempel bør kultur medium ikke inneholde serum. Ormen tettheten i kulturen i vitro bør være rimelig å minimere mulig stressrespons og lavere dødelighet av ormer. I tillegg bør det bemerkes at ulike stadier av schistosomes eller ormer fra ulike verter kan presentere ulike EVs. Derfor er det viktig å opprettholde parasitter i i vitro miljøer som ligner vertsmiljøet, og forholdene isolasjon utføres under hvilke SjEV må være konsekvent. I tillegg er vi ikke utelukke avvik knyttet til SjEVs forårsaket av kultur stress.
Her presenterer vi en protokoll for isolering av SjEVs fra 2 h i vitro kultur medier for voksen schistosomes. En fordel med denne protokollen er at kort kultur reduserer stress som parasitter er utsatt, som kan resultere i ikke-fysiologiske EV sekret. I tillegg fant vi at SjEVs isolert som beskrevet i denne protokollen var internalisert mottaker celler, noe som tyder på at disse SjEVs kan være biologisk aktive17. Samlet tillater nåværende protokollen effektiv isolasjon av SjEVs fra voksen ormer bruke standard laboratorieutstyr og gjør deres karakterisering ved hjelp vestlige blotting og celle opptaksanalyse. De isolerte EVs kan brukes å ytterligere karakterisere vert-patogen interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien var delvis eller helt, støttes av National Natural Science Foundation i Kina (31472187 og 31672550) og landbruksvitenskap og teknologi innovasjon Program for det kinesiske akademi for landbruksvitenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
