Summary
Burada, Yetişkin Schistosoma japonicum vitro kültür ortamından izolasyonda ekstraselüler veziküller (EVs) açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EVs) membranöz veziküller hücreler çeşitli hücre dışı microenvironment içine tarafından yayımlanan vardır. EVs heterojen veziküller, nüfusu 40 ve 1000 nm arasında bağlantı boyutu aralığı temsil eder. Birikmiş kanıt EVs patojen-host etkileşimlerde önemli düzenleyici rol oynarlar belirtti. Paraziti EVs derin bir anlayış anlayışlar paraziti-ana etkileşimler, şistozomiyazis karşı yeni strateji geliştirme sağlayan temel mekanizmaları sağlamalıdır. Burada, daha fazla yetişkin Schistosoma japonicum (S. japonicum) yalıtım ve EVs karakterizasyonu için bir protokol sunarak schistosomes işlevlerinde EVs çalışma hedefliyoruz. EVs vitro kültür bir ticari eksozom izolasyon kiti ile kombine Santrifüjü kullanarak ortamdan izole edildi. İzole S. japonicum EVs (SjEVs) genellikle 100-400 nm çapında sahip ve iletim elektronik mikroskobu ve western Blot ile karakterizedir. SjEVs boya etiketli PKH67 kullanımını SjEVs alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş göstermiştir. Genel olarak, bizim iletişim kuralı EVs yetişkin schistosomes izole için alternatif bir yöntem sağlar; izole SjEVs fonksiyonel analiz için uygun olabilir.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EVs) küçük membran bağlı veziküller çeşitli proteinler, lipidler ve nükleik asitler ile kapsüllü bir nüfusu vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs hücre-hücre iletişim çok önemli bir rol oynamaktadır ve hücre gelişimini, bağışıklık düzenlemesi, anjiogenez ve hücre geçiş2de dahil olmak üzere çok sayıda fizyolojik süreçlerin yönetmelikte yer gösterdi, 3,4,5. Delil biriktiriyor EVs, exosomes ve onların miRNA kargo dolaşan bazı hastalıklar6potansiyel biyolojik temsil ettiğini gösterir.
Trikomonas vajinalis, Trypanosoma cruzive LEISHMANIA sppgibi birkaç protozoa., EVs; salgılar edebilmek için gösterilen archlar Ayrıca bulundu EVs yaşam içine salgılaması için7ev sahipliği yaptı. Paraziter EVs enfeksiyon, patojen8ve bağışıklık Yönetmeliği9bakım dahil olduğu gösterilmiştir. Son schistosomes içinde her iki Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 çalışmalar ve S. japonicum12 yetişkin schistosomes olabilir eksozom benzeri veziküller salgılar belirtilmiştir var Belirli biyolojik süreçlerin fonksiyonel Yönetmeliğinde yer.
Bugüne kadar çeşitli yöntemler ultrasantrifüj, Ultrafiltrasyon13, polimer esaslı reaktifler, boyut-dışlama Kromatografi ve immunoaffinity yalıtım kullanımı gibi hücre dışı veziküller izole etmek için kullanılmıştır. Bu farklı yöntemler kendi avantajları ve sınırlamalar14bulunur. Genel olarak, ultrasantrifüj vezikül yalıtım için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Ancak, bu yöntem potansiyel EV toplama14sınırlama uğrar.
Schistosomes, yöntemleri bir çift EV yalıtımı için bildirilmiştir: Bu ultrasantrifüj11,12,10 ve çeşitli aşamalarında (yumurta16, ticari EV yalıtım Seti16 kullanımını içerir schistosomula11, Yetişkin schistosomes10,12,17). Microvesicles birkaç yüz nanometre boyutundan bin nanometre için geniş bir göz önüne alındığında olduğuna göre biz tezgah santrifüj, Ultrafiltrasyon ve üzerinden EVs yalıtmak için ticari bir EV izolasyon kit kullanımı ile birleştiren alternatif bir yöntem geliştirdi Yetişkin Schistosoma japonicum. İzole EVs genellikle 100-400 nm çapında sahip ve başarıyla alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Yerel Etik Komite Shanghai veteriner Araştırma Enstitüsü, Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından kabul edildi (izin numarası: SHVRIAU-14-0101).
1. Schistosomes in Vitro kültür
Not: Schistosomes bir biohazard temsil eder. İşçi hepsini ne zaman işleme solucanlar, schistosomal süspansiyonlar veya diğer biyolojik malzemeler ilgili kez lateks eldiven giymek gerekir. Yeni Zelanda tavşanları ~ 2.000 cercariae yolu ile karın pozlama ile bulaşmış. Schistosomes karaciğer aşamada tavşan S. japonicum cercariae 28 gün sonrası enfeksiyon, karaciğer ve mezenterik damarların perfüzyon tarafından enfekte üzerinden toplanmıştır. Solucan koleksiyonu yordamlar önceki yayınlarda fareler18çalışmalarda raporlama başvuru.
- Parazitleri bir 500 mL ölçek toplamak. Onları iyice yıkayın ve yavaşça 3 x 200 mL ile (37 ° C) PBS (pH 7,4) ısıtılmış.
- Her 90 mm Petri kabına için ~ 200 solucan çiftleri ayırmak. Parazitler iyice yıkayın ve hafifçe 2 x 50 mL ile (37 ° C) RPMI-1640 Kültür 100 U penisilin ve 100 mg/mL streptomisin içeren orta ısıtılmış.
- Parazitler olmadan antibiyotik altında %5 CO2 ~ 5 solucan çiftleri /mL 2 90 mm Petri s için yoğunluğu, çanak 37 ° C'de ısıtılmış RPMI-1640 kültür ortamının 40 ml korumak.
Notlar: RPMI 1640 orta serum içermemesi gerekir, aksi takdirde eksojen ekstraselüler vezikül tanıtılacaktır.
2. tedavi ön koşulu medya
- Kültür orta toplamak ve 2.000 × g yumurta kaldırıp tegmental enkaz solucan 30 dk için 4 ° C'de orta santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant aktarmak için taze bir tüp ve 0,22 µm şırınga filtre kullanarak çözüm filtre uygulayabilirsiniz.
- Filtre uygulanmış çözüm diyaliz çantaya toplamak (moleküler ağırlık kesme: 3.5kD) ve gecede 4 ° C'de % 8 ' PEG8000 çözüm kullanarak çözüm diyaliz.
Notlar: SjEVs yalıtım verimi artırmak için SjEVs zenginleştirmek önemli bir adımdır.
3. SjEVs yalıtım
- Diyaliz çözüm için yeni bir tüp aktarmak ve toplam eksozom yalıtım reaktif 0.5 birimleri ekleyin.
- Çözüm de tarafından vortexing veya yukarı ve aşağı polimerlerin çözüm sağlamak için pipetting karıştırın.
- 2 ° C-8 ° C karisimin gecede kuluçkaya.
- 2 ° c ile 8 ° c 1 h için 15.000 × g karisimin santrifüj kapasitesi
- Aspire edin ve süpernatant atın.
Notlar: EVs (görünmeyen Olguların çoğunda) tüp alt Pelet bulunur. - EVs Pelet 2 mL PBS resuspend ve daha fazla çözümleme kadar EVs çözüm-80 ° C'de depolayın.
4. Western blot tarafından EVs karakterizasyonu
- Örneğin, BCA tahlil tarafından SjEVs örnek protein konsantrasyonu belirlemek.
- 10-20 µg EVs 22.5 µL RIPA arabelleği, hazır olun. Sonra arabellek ve ısı 95 ° C'de 5 min için yükleme x 4 7,5 µL ekleyin
- Ayrı SjEVs proteinler tarafından % 12 SDS-sayfa jel.
- PVDF membran proteinleri aktarmak ve anti-tavşan IgG-HRP ile (1:5, 000 seyreltme) sondalama tarafından takip anti-CD63 antikorlar (1:1, 000 seyreltme), ile sonda.
- ECL algılama reaktif membran geliştirme için kullanın ve görüntüleme sistemi Kemiluminesan tarafından sinyalleri tespit.
5. EVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu
- İzole SjEVs 2 µL 200 mesh formvar kaplamalı ızgaralar için ekleyin ve sonra oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
- Phosphotungstic asit, 1 dk. için %2 ile leke ve sonra oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
- Izgaralar transmisyon elektron mikroskobu örnek sahibinin üzerine yük ve bir 80 kV elektron ışını görüntü yakalama için maruz.
6. SjEVs PKH67 ve hücre alımı tahlil etiketle
Notlar: Tüm sonraki adımları ortam sıcaklığında (20-25 ° C), aksi belirtilmedikçe yapıldı.
- 5 µg SjEVs çözüm Konik alt polipropilen boru aktarmak ve 12 ml RPMI 1640 orta ekleyerek ses seviyesini.
- SjEVs cips için SjEVs 110.000 × g 4 ° C'de 90 dk için de santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü sonra dikkatle süpernatant Aspire edin.
Not: Bu türdeş olmayan boyama ve azaltılmış hücre canlılığı neden gibi PKH67 ethanolic boya SjEV Pelet doğrudan, eklenmelidir değil. - 2 x EV süspansiyon çözüm SjEV Pelet Dilüent c 1 mL ekleyerek hazırlamak; tam dağılım sağlamak için nazik pipetting ile resuspend.
- Dilüent C boyama önce taze bir 2 x boya çözüm PKH67 ethanolic boya çözüm 2 µL Dilüent C 1 mL polipropilen santrifüj tüpü içinde ekleme ve de dağıtmak için karıştırma hazırlayın.
- Hızlı bir şekilde EV süspansiyon (adım 6.4) 2 x boya çözüm (adım 6.5) ve hemen 1 ml örnek pipetting tarafından mix 2 x 1 mL ekleyin.
- Karışımı, oda sıcaklığında 4 dk için kuluçkaya.
- 4 mL FBS ekleyerek boyama durdurmak ve 1 dk. için kuluçkaya.
- RPMI1640 orta 12 ml ses seviyesini ve 110.000 × g 90 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi için ekleyin.
- Süpernatant kaldırın ve RPMI1640 orta SjEV granül etiketli PKH67 resuspend ekleyin.
- Bir kez yıkama ve PBS SjEVs granül resuspend eklemek için 90 dakika için 4 ° C'de 110.000 × g, santrifüj kapasitesi.
7. SjEVs hücre alımı tahlil
- Tohum memeli hücreleri NCTC gibi clone 1469 hücreleri ya da 6-şey plaka (2 × 105 hücreleri de başına) hücrelerde HEK293T ve hücreleri gecede kültür.
- 5 µg PKH67 etiketli SjEVs ekleyin ve 2-4 h için 37 ° C'de hücreler kültür.
- Kuluçka sonra orta kaldırmak ve PBS hücrelerle iki kez yıkayın.
- %4 formaldehit solüsyonu 15dk için hücreleri tamir ve iki kez PBS ile daha fazla yıkadım.
- Hücre çekirdeği ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile leke.
- Floresans mikroskobu kullanarak hücreleri gözlemlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzole SjEVs açıklanan protokolünü kullanarak verimini ölçmek için biz BCA protein tahlil izole SjEVs protein konsantrasyonu 28 günlük yetişkin schistosomes erişmek için kullanılır. Tablo 1' de gösterildiği gibi SjEV protein konsantrasyonu 208 µg Orta (Tablo 1) 100 mL başına 250 µg arasında değişiyordu. İzole SjEVs 100 değişiyordu Malvern nanopartikül analiz, belirlenen partikül büyüklüğü belirtilen 400 nm nm ile en yüksek nüfus yaklaşık 220 nm boyutunda (Şekil 1). Daha fazla SjEVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu yaklaşık 100-200 Nm çapında (Şekil 2) yuvarlak veziküller olmak EVs saptandı. Western blot Analizi izole SjEVs CD63 antikorlar, kullanarak tipik bir EV marker (Şekil 3) olduğu kabul belirtti. Floresans mikroskobu gözlem PKH67 etiketli SjEVs NCTC klon 1,469 hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve SjEVs (Şekil 4) alıcı hücrelerin sitoplazma içinde ağırlıklı olarak dağıtıldı göstermiştir.
| Örnekleri | EVs / 100ml kültür orta |
| #1 | 250 µg |
| #2 | 208 µg |
| #3 | 220 µg |
Tablo 1: SjEVs protein elde edilen kültür ortamından; ~ 500 solucan çiftlerini içeren BCA tahlil kültür ortamının 100 mL başına tarafından erişilen SjEVs miktarı gösterilir.
Resim 1 : Boyut SjEVs izole dağılımı kültürlü ortamdan. SjEVs çözümün 20 µL 1000 µL PBS ile seyreltilmiş; sonra karışımı bir yüksek performanslı iki açı parçacık ve moleküler boyutu Çözümleyicisi kullanarak analiz edildi. Gösterilen sonuç üç bağımsız izolasyonların verilerden bir temsilcisidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : SjEVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Western blot Analizi CD63 antikorlar karşı izole SjEVs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : SjEVs memeli hücreleri tarafından alımını. SjEVs etiketli PKH hücre çekirdeği mavi renkle gösterilir iken yeşil renkle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EVs üzerinde son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs ana bilgisayar-patojen etkileşimleri3,9,12,16' önemli bir rol oynamaktadır bu paraziti gösterdi. Daha fazla adrese düzenleyici işlevleri, EVs schistosomes yalıtmak için gerekli olduğunu. Burada, SjEV yalıtım için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem SjEVs, geniş Aralık boyutunu 100 verimleri nm 400 nm, Yetişkin S. japonicum. Aşağıdaki hücre alımı tahlil altında açıklanan protokol izole EVs başarıyla alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve onların ilişkili miRNAs potansiyel olarak düzenleyici rol17oyun belirtti.
EVs, birçok farklı türde hücreleri tarafından salgılanan, ayrıca vücut sıvıları19çeşitli mevcuttur. Sonuç olarak, yapay olarak SjEV yalıtım işlemi sırasında eksojen EVs tanıtımı için önlemek önemlidir. Örneğin, kültür orta serum içermemesi gerekir. Vitro kültür solucan dansitesi potansiyel stres tepkisi en aza indirmek ve solucanlar mortalite oranları düşürmek için makul olmalıdır. Buna ek olarak, schistosomes veya solucanlar farklı aşamalarında farklı bilgisayarlardan farklı EVs takdim unutulmamalıdır. Sonuç olarak, bu parazitler ana ortamı yakından benzer vitro ortamlarda korumak için zorunludur ve koşullar altında hangi SjEV yalıtım gerçekleştirilir tutarlı olmalıdır. Ayrıca, kültür stresin neden SjEVs ilgili sapma olasılığını ekarte edemiyoruz vardır.
Burada, SjEVs izolasyonu yetişkin schistosomes için 2 h vitro Kültür medya için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokol kısa kültür zaman fizyolojik olmayan EV salgı neden olabilir stres için parazitler maruz kalır, en aza indirir avantajlıdır. Buna ek olarak, bu protokol için açıklandığı gibi izole SjEVs bu SjEVs biyolojik olarak aktif17olabilir düşündüren alıcı hücreler tarafından içselleştirilmiş bulduk. Genel olarak, mevcut protokol SjEVs verimli yalıtım yetişkin gelen Standart laboratuvar donanımları kullanarak solucanlar ve western Blot kullanarak karakterizasyonu ve hücre alımı tahlil sağlar sağlar. İzole EVs daha fazla ana bilgisayar-patojen etkileşimleri karakterize etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada, kısmen ya da bütün olarak, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31472187 ve 31672550) ve tarım bilim ve teknoloji yenilik programı Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından desteklenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al.
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F.
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
