Methodenartikel

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

DOI:

10.3791/57519

⸱

10. Mai 2018

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Übersetzung Einleitung ist der Rate-limiting Schritt der Proteinsynthese und ist einen wesentlichen Punkt, bei dem Zellen ihre Protein-Produktion regulieren. Verordnung der Proteinsynthese ist der Schlüssel zur zellulären Stressantwort und Dysregulation ist zentral zu vielen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs. Obwohl zellulären Stress zu die Hemmung der globalen Übersetzung durch mildernde GAP-abhängige Initiation führt, sind bestimmte Stressantwort Proteine beispielsweise selektiv auf GAP-unabhängige Weise übersetzt. Diskrete RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes), ermöglichen die Übersetzung dieser spezifischen mRNAs. Identifizierung von solchen mRNAs und die Charakterisierung ihrer regulatorischen Mechanismen wurden ein wichtiger Bereich in der molekularen Biologie. Toeprinting ist eine Methode für die Untersuchung von RNA-Struktur und Funktion betrifft Übersetzung Einleitung. Das Ziel des Toeprinting ist zur Beurteilung der Fähigkeit von in-vitro- transkribierte RNA bilden stabile komplexe mit Ribosomen unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Zubehör Faktoren im Ribosom beteiligt sind verbindlich – ein Vorläufer für effiziente Übersetzung Einleitung. Neben anderen Techniken, wie westliche Analyse und Polysome profiling ermöglicht Toeprinting eine robuste Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Übersetzung Einleitung.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wie die Übersetzung die zelluläre Energie verbraucht, ist es sinnvoll, dass Übersetzung streng regulierte1ist. Umgekehrt, Dysregulation der Übersetzung- und den daraus resultierenden Änderungen in Protein-Ausgabe-oft in Stress-Reaktion und Krankheit Staaten, z. B. Krebs1,2eingehalten wird. Ein großer Vorteil der translational Control ist die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Protein-Produktion verändern können, um auf verschiedene Reize3reagieren. Übersetzung-Verordnung stellt somit einen wichtigen Mechanismus, der Zelle überleben und Tod1,2,3beeinflussen können. Von den Stufen des Übersetzung ist Initiation die meisten hoch regulierten und komplexen3. Kurz, enthalten die meisten eukaryontischen mRNAs eine 5' m7G Mütze, die fast immer für ihre Übersetzung unerlässlich. GAP-abhängige Initiation erfordert eukaryotic Initiation Faktoren eIF4E, eIF4A und eIF4G (GAP-Anerkennung Komplex), mit 5'-Ende der mRNA zu interagieren. 43 preinitiation Ribosomen Komplex, enthält eIF2 gebundene Initiator tRNA und eIF3, wird eingestellt, um die 5'-Ende der mRNA durch eine Wechselwirkung von eIF4G mit eIF3. Die komplexen Preinitiation wird gedacht, um mRNA, unterstützt von eIF4A Scannen (ein RNA-Helikase) bis der Start-Codon (AUG) befindet. Die 48er Einleitung komplexer entsteht anschließend und tRNA wird in der P-Seite von dem Ribosom geliefert. Schließlich sind die 60er und 40er Ribosomen-Untereinheiten vereint bilden die 80er Jahre Einleitung Komplex, gefolgt von Übersetzung Dehnung1,3,4. Im Gegensatz dazu umgehen interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes) die Voraussetzung für eine 5' Kappe durch die Rekrutierung der 40er Jahre ribosomalen Untereinheit direkt an die Einleitung Codon3. Physiologischen Spannungszustände dämpfen globale mRNA Übersetzung aufgrund von Änderungen der wichtigsten allgemeinen eukaryotischen Einleitung Faktoren (WDVS). Jedoch nicht-kanonischen Übersetzung Einleitung Mechanismen erlauben selektive Übersetzung bestimmter mRNAs, die oft Stressantwort Proteine codieren und Dysregulation der nicht-kanonischen Übersetzung Initiation ist bei Krankheitszuständen wie Krebs verwickelt 1 , 2. diskret RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre IRESes zu ermöglichen, für die Übersetzung von solchen mRNAs2,3.

Ein besonders interessanter Aspekt von translational Control ist es, Mechanismen der kanonischen versus nicht-kanonischen Übersetzung von einem bestimmten mRNA zu verstehen. Toeprinting ist eine Technik, die der mechanistischen Detailstudie über Übersetzung Einleitung der spezifischen RNAs in Vitroermöglicht. Das Ziel des Toeprinting ist die Fähigkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von einer Übersetzung Initiation Komplex mit dem Ribosom unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Accessoire Keimbildung zu bewerten Faktoren sind für effiziente Übersetzung Einleitung erforderlich. Beispielsweise könnte Ribosom Rekrutierung in Ermangelung eines 5'-Cap behindert aber angeregt durch die Anwesenheit von einer IRES.

Das Prinzip der Technik ist, in-vitro- transkribieren eine RNA von Interesse, es in Anwesenheit von Zellextrakten mit Übersetzung (oder die gereinigten Komponenten) ermöglichen Einleitung komplexe zu bilden, und umgekehrt zu transkribieren inkubieren die RNA mit einem speziellen Primer. Stabile RNA-Ribosom komplexe verursacht reversen Transkription zum Strömungsabriss am 3' Rand der Ribosom-die so genannte 'Toeprint'5,6,7.

In diesem Protokoll der ribosomalen Untereinheiten, WDVS, tRNAs und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs) werden bequem durch Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) beigetragen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Primer eindringmittel beschriftet und Fluoreszenz Gel-basierte Imager, anstatt einer radioaktiven Grundierung. Dadurch entfallen zusätzliche Schritte, einschließlich enzymatische die Grundierung sowie das Gel Trocknen und setzen Sie sie auf eine Intensivierung Bildschirm. Die fluoreszierende Bänder werden in Echtzeit, als die Gel läuft, ermöglicht größere Auflösung aufgezeichnet. Entdeckelte X-chromosomal-Inhibitor von Apoptosis Protein (XIAP) IRES RNA wird hier, als Beispiel verwendet, obwohl angeschnittene Ärmel mRNAs auch mit dieser Technik8analysiert werden kann.

Im Gegensatz zu westlichen Analyse, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses in Zelle Lysates misst, ist Toeprinting ein in-vitro- Ansatz zur Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf einer RNA zu messen. Diese reduktionistische Ansatz ermöglicht es, für die sehr detaillierte Untersuchung von Substraten oder Faktoren, die Übersetzung Einleitung zu regulieren (zB., angeschnittene Ärmel oder UN-angeschnittene Ärmel mRNA, IRES-Struktur, Vorhandensein oder Fehlen von Poly-A Tail, Bestimmung von spezifischen Proteins Faktoren, ( usw.). Daher kann Toeprinting verwendet werden, verschiedene Modi der Übersetzung8 oder die Auswirkungen der mRNA Strukturen, z. B. IRESes, am Protein Synthese9,10zu studieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hinweis: RNA ist sehr anfällig gegen Abbau durch Ribonuclease (RNases). Vorkehrungen Sie treffen, standard, die RNA intakt zu halten. Ändern Sie häufig Handschuhe. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, Nuklease-freie Plastikware und Nuklease-freie Chemikalien in allen Schritten des Protokolls. Nuklease-freie Nutzung oder Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltes Wasser für alle Lösungen.

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. Toeprinting Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5 % (w/V) Saccharose, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Spermidine.
    1. Speichern Sie DVB-t und Spermidine in Einweg-Aliquote bei-20 ° C, wiederholte Frost-Tau-wechseln zu vermeiden.
      Hinweis: DVB-t und Spermidine sollte in den Puffer Toeprinting unmittelbar vor der Anwendung hinzugefügt werden. Eine Lösung ohne DVB-t und Spermidine kann bei-20 ° c gelagert werden
  2. Bereiten Sie Aliquote von 85 mM-5'-Guanylyl-Imidodiphosphate (GMP-PNP) und 91 mM Adenosintriphosphat (ATP). Speichern der Aliquote bei-20 ° C.
  3. 450 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel Mischung vorbereiten: 67,5 mL 40 % Acrylamide:bis-Acrylamid (19:1), 189 g Harnstoff, 112,5 mL 5 x TBE (Tris/Borat/Thylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)) und 120 mL Wasser. Lösen Sie den Harnstoff durch Erwärmung im Wasserbad 37 ° C oder auf einer Heizplatte unter Rühren auf. Filtern Sie die Lösung (zB., 0,2 μm Nitrozellulose Vakuumfilter).
    Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens einen Monat aufbewahrt werden.
    Achtung: Monomere Acrylamid ist ein Nervengift, das durch die Haut absorbiert werden kann. Achten sehr darauf, Kontakt mit der Haut zu vermeiden (zB., tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz). Polyacrylamid sollte auch mit Sorgfalt, behandelt werden, wie Polymerisation nicht 100 % vollständig erfolgen kann.
  4. Formamid laden Farbstoff vorbereiten: 95 % Formamid, 18 mM EDTA, 0,025 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 0,025 % (w/V) Bromophenol Blue, Xylol Cyanol 0,025 % (w/V). Shop bei-20 ° C.
  5. 1 Nmol Grundierung (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' Ende beschriftet mit IRDye 800) in 100 μl Wasser für eine arbeiten-Konzentration von 10 Pmol/μL auflösen. Bei-20 ° C in Einweg-Aliquote (ca. 10 µL), vor Licht geschützt aufbewahren.

2. Vorbereitung der mRNA

  1. DNA-Templates für die Synthese von mRNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus entsprechende Vorlagen zu verstärken (i.e., genomische DNA oder Plasmid DNA, je nach Bedarf). Verwenden Sie ein High-Fidelity-DNA-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit den folgenden Reaktionsbedingungen (35 Zyklen): Schmelzen, 98 ° C, 10 s; Tempern, 53 ° C, 20 s; verlängern, 72 ° C, 30 s.
    Hinweis: Der forward Primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) beinhaltet die T7 promotorsequenz für RNA-Transkription ermöglichen; die rückwärts-Primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) umfasst 51 Thymin Rückstände um ein Poly-A-Rute für die transkribierten RNA zu bieten. Beachten Sie, dass RNA auch in Vitro von Plasmid DNA transkribiert werden kann.
  2. Einsatz eines entsprechenden Transkription-Kit zur in-vitro- Transkription IRES-haltigen RNA oder angeschnittene Ärmel RNA aus der DNA-Vorlage. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Die RNA-Probe in 20 μL Reaktion Standardvolumes vorbereiten. Behandeln Sie die neu synthetisierten RNA mit 2 Einheiten von RNase-freie DNase für 30 min bei 37 ° C.
  3. Verdünnen Sie die DNase-behandelten RNA auf 110 µL mit Nuklease-freies Wasser hinzufügen 110 µL Säure Phenol, Wirbel 5 s und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie 100 µL der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch zu, fügen Sie 10 µL 3 M Natriumacetat und Vortex 2 s. hinzufügen, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s und überstürzen Sie sich die RNA bei-20 ° C über Nacht.
  4. Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie die Tablette mit 500 µL eiskalte 70 % (V/V) Ethanol und wiederholen Sie die Zentrifugation. Aspirieren Sie so viel des Überstands wie möglich und trocknen Sie das Pellet für 5-10 min. vorsichtig nicht zu die Pellets zu verdrängen sein.
  5. Aufschwemmen der RNS in das entsprechende Volumen der Nuklease-freies Wasser um eine arbeiten-Konzentration von 0,5 μg/μL zu erzielen. Dies kann bei-80 ° C gelagert oder sofort verwendet werden.

3. Toeprinting Reaktion

  1. Mix 15 μl der Kaninchen Retikulozytenzahl Lysate (RRL, nicht Nuklease behandelt), 1 μl RNase-Inhibitor, 1 µL 91 mM ATP (1,82 mM final) und 1 μL von 85 mM GMP-PNP-(1,7 mM final) in einer 1,5 mL Microfuge Röhre (40 Einheiten). Bei 30 ° C für 5 min inkubieren.
    Hinweis: Die RRL regelmäñig für den einmaligen Gebrauch, sich wiederholende Einfrieren Auftauen zu vermeiden sollte. Eine kritische Kontrolle ist eine Reaktion fehlt RRL, um die natürlichen Pausen der reversen Transkription durch die sekundäre Struktur der RNA aufzuklären. Fügen Sie Toeprinting Puffer um RRL für dieses Steuerelement zu ersetzen.
  2. Fügen Sie 0,5 µg RNA (1 µL) und bei 30 ° C für 5 min inkubieren.
  3. Fügen Sie 22 µL Toeprinting-Puffer und bei 30 ° C für 3 min inkubieren.
  4. Hinzufügen von 0,5 µL (5 Pmol) mit der Bezeichnung von IRDye Grundierung und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
  5. Fügen Sie 2 µL 25 mM dNTPs (Endkonzentration: 1 mM), 2 µL 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL des Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transkriptase (AMV-RT) und 3,5 µL Toeprinting-Puffer. Der letzte Band ist 50 μL.
  6. Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 ° C für 45 min.
  7. 200 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen und sofort mit 250 µL 25:24:1 Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (pH-Wert ca. 8.0) zu extrahieren. Vortex 5 s und Zentrifuge bei 20.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Entfernen der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s hinzufügen und über Nacht bei-20 ° C Niederschlag.
  8. Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 µL eiskaltes Ethanol 70 % (V/V). Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Aspirat soviel überstand als möglich und mit Luft trocknen das Pellet für 5-10 min. nicht zu verdrängen das Pellet vorsichtig sein.
  9. Das Pellet in 6 μL der Nuklease-freies Wasser auflösen und 3 μl Formamid laden Farbstoff hinzufügen.

4. Sequenzierung Reaktionen

  1. Verwenden Sie der DNA-Vorlage von 2.1 und die IRDye beschriftet Grundierung aus Schritt 3.4 für standard-Sequenzierung Reaktionen, mit Dideoxynucleotides (DdNTPs) als Kette Terminatoren. Verwenden Sie eine entsprechende DNA-Sequenzierung Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  2. Mix 6 μL jeder Sequenzierung Reaktion mit 3 μl Formamid Farbstoff beladen.

5. Vorbereitung der Sequenzierung Gel und Elektrophorese

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Fluoreszenz-Gel-basierten-Imager und eine 21 cm x 23 cm x 0,2 mm Gel, sondern kann bei Bedarf für andere Sequenzer oder Gel-Größen angepasst werden.

  1. Reinigen Sie 0,2 mm spacer sowie die kurzen (23 × 25 cm) und lange (30 × 25 cm) Glasplatten mit 100 % igem Ethanol gründlich. An der Luft trocknen.
  2. Mischung 30 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel zu mischen, mit 200 μl 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Gießen Sie Gel, kümmert sich um die Vermeidung von Luftblasen, und fügen Sie den "Hai-Zahn" Gel Kamm. Lassen Sie das Gel für 1 h bei Raumtemperatur zu polymerisieren.
  3. Die Sequenzierung Apparat zusammenbauen und füllen Sie den Behälter mit 1 X TBE.
  4. Bereits für 15 min bei 1500 V laufen Sie, bis die optimale Temperatur von 55 ° C erreicht wird.
  5. Erhitzen Sie den Probenaufnahme/Farbstoff-Mix (aus Schritte 3,9 oder 4.2) auf 85 ° C für 5 min. Last 1 μL auf die Sequenzierung Gel.
  6. Führen Sie das Gel bei 1500 V für 8 h. Das Gerät liest die Bands in Echtzeit.
  7. Zerlegen Sie das Gerät zu, und entsorgen Sie die Acrylamid-Gel und laufenden Puffer.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zuvor haben wir die Möglichkeit der XIAP IRES zur Unterstützung von GAP-unabhängige Übersetzung Einleitung in-vitro-8,10beschrieben. Toeprinting war der Key-Technik, die mechanistischen Details der komplexen XIAP IRES Einleitung zu befragen. Ein DNA-Konstrukt Codierung eine mRNA mit XIAP IRES (Abb. 1A) wurde in Vitro transkribiert und Toeprinting Analyse unterzogen. ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toeprinting ist eine leistungsstarke Technik, die Möglichkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von Übersetzung Einleitung komplexen unter sehr kontrollierten Bedingungen unterstützen direkt zu messen. Dieses Protokoll beschreibt eine vereinfachte Technik für Toeprinting Säugetieren RNAs. Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) dient als bequeme Quelle von Ribosomen, WDVS, Initiator tRNA und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs). Der Experimentator bietet ihre RNA der Wahl und kann auch die Toeprinting Reakt...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Konflikt-of-Interest, offen zu legen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch eine Natur- und Engineering Research Council von Kanada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), der Kanada-Stiftung für Innovation-John R. Evans Leaders Fund (35017), am Campus Alberta innoviert Programm und das Ministerium für Alberta finanziert. Wirtschaftliche Entwicklung und Handel.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DEPC (Diethylpyrocarbonat)SigmaD5758-100ML
TRIS-Base, hochreinesJT Baker4109-01
KOAc (Kaliumacetat)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (Magnesiumacetat-Tetrahydrat)Bio BasicMB0326
Saccharose, molekularbiologische QualitätCalbiochem573113-1KG
SpermidinSigma85558
GMP-PNP (Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat trinatriumsalz hydrat) 0,1 M LösungSigmaG0635
ATP (Adenosin 5′-triphosphat) Dinatriumsalz, 100 mM LösungSigmaA6559
19:1 Acrylamid:bis-acrylamid, 40%Bio BasicA0006
UreaBio BasicUB0148
500 ml Flaschenverschluss-Filtrationseinheiten, 0,2 & Mikro; mSarstedt83.1823.101
FormamidSigmaF9037-100ML
EDTA (Dinatriumsalz, Dihydrat)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
BromphenolblauBio BasicBDB0001
Xylolcyanol FFBio BasicXB0005
MEGAshortscript T7 TranskriptionskitAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 TranskriptionskitAmbionAM1344
Säure Phenol:Chloroform (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:IsoamylalkoholInvitrogen15593-049
Kaninchen-Retikulozytenlysat (RRL). Sollte NICHT mit Nuklease behandelt werden.Green Hectares, USAKontaktieren Sie Green Hectares, fragen Sie nach 1:1 RRL:Wasser
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µ L)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Mischen Sie gleiche Teile für einen Vorrat von je 25 mM.
AMV-RT, 10 U/µ LPromegaM5101
Sequenase Version 2.0 DNA-SequenzierungskitThermoFisher 707701KT
Modell 4200 IR2 DNA-AnalysatorLI-CORProdukt wurde eingestellt
APS (Ammoniumpersulfat)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion High Fidelity PolymeraseNeu England BiolabsM0530
Turbo DnaseThermo FisherAM2238

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
  3. Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).
  4. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
  5. Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
  6. Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
  7. Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).
  8. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  9. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  10. Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
  11. Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
  12. Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
  13. Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
  14. Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
  15. Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
  16. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295(2014).
  17. Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).
  18. Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

IRES Mediated TranslationRNA PurificationReverse TranscriptionPolyacrylamide Gel ElectrophoresisFluorescent ImagingRibosome BindingCap Dependent Initiation

Verwandte Artikel