Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.
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Methodenartikel
Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mit einer steigenden Inzidenz von Prostatakrebs ist die Identifizierung der Tumor Fahranfänger oder Modulatoren entscheidend. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) für Prostatakrebs sind durch Tumor Heterogenität und seine komplexe Mikroevolution Dynamik erschwert. Traditionelle Prostatakrebs-Maus-Modellen gehören unter anderem Keimbahn und bedingte Knockouts, transgene Ausdruck der Onkogene und Xenograft-Modelle. Generation von de Novo Mutationen in diesen Modellen ist komplex, zeitaufwändig und kostspielig. Darüber hinaus zielen die meisten traditionellen Modelle den Großteil der Prostata Epithel, während menschlichen Prostata-Krebs ist bekannt als ein isoliertes Ereignis in nur eine kleine Teilmenge von Zellen zu entwickeln. Wertvolle Modelle müssen jedoch nicht nur Prostatakrebs Einleitung auch Progression zu fortgeschrittener Erkrankung zu simulieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ein paar Zellen in der Prostata Epithel durch 3D-Steuerung Zellen nach Viruspartikel zu adressieren. Die Lieferung eines veränderter Virus an der murinen Prostata ermöglicht Änderung der Genexpression in der Prostata Epithelien. Virus-Typ und die Menge werden hiermit die Anzahl der Zellen zielgerichtet für gen-Änderung definieren, indem transducing ein paar für Krebs Einleitung und viele Zellen für die Gentherapie. Durch Chirurgie-basierte Injektion in die vorderen Lappen, distale aus dem Harn Track kann der Tumor in diesem Modell erweitern, ohne Beeinträchtigung der harnfunktion des Tieres. Darüber hinaus durch die Ausrichtung auf nur eine Teilmenge der epithelialen Zellen der Prostata die Technik ermöglicht klonalen Expansion des Tumors und daher imitiert menschliche Tumorentstehung sowie Verlauf und Invasion durch die Basalmembran.
Diese neuartige Technik bietet eine leistungsstarke Prostatakrebs Modell verbesserte physiologische Relevanz. Leiden der Tiere ist begrenzt, und da keine zusätzliche Zucht erforderlich ist, insgesamt tierischen Graf wird reduziert. Zur gleichen Zeit wird Analyse neue Kandidatengene und Wege beschleunigt, die wiederum ist kostengünstiger.
Einleitung
Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs haben in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert. Dennoch steigt die Inzidenz von Prostatakrebs nach Lebenserwartung. Mit schätzungsweise 1,1 Millionen neue Fälle weltweit gehört er zu den häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesursache bei Männern 1. Prostatakrebs ist in seiner Entwicklung langsam, aber wenn der Krebs in einem fortgeschrittenen metastasierten Stadium fortgeschritten ist, die Prognose ist schlecht aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Bisher nur wenige Gene wurden als gemeinsame Treiber in diesem Krebs identifiziert und ihre Heterogenität und Multifocality behindert Nachweis von Biomarkern und Aktionsleisten Krankheit Treiber2,3.
Klassische Techniken der Erzeugung von GEMMs werden durch ihre Komplexität, rechtzeitige Aufwendungen und Kosten oft beeinträchtigt. Bedingte ko-Modelle wurden weithin zur Prostatakrebs Kandidatengene, studieren, die embryonale Tödlichkeit, wenn in der Keimbahn4inaktiviert führen. Alle gängigen Modelle beinhalten eine Prostata-spezifisches-Cre-Rekombinase angetrieben entweder durch eine modifizierte Probasin5 oder integriert in die GEMM durch zusätzliche Kreuzungszüchtung PSA6 Förderer. In diesen Modellen wird das Gen des Interesses gezielt in der Mehrzahl der epithelialen Zellen der Prostata, Erzeugung von Hyperplasie in das ganze Organ, das das Tier Harnwege Funktion7beeinträchtigen kann.
Virale Lieferung des Cre-Proteins durch Injektion in den vorderen Lappen der murinen Prostata kann dieses Problem beheben, indem Sie nur auf ein paar Zellen8. Unter Berücksichtigung Labors technische Voraussetzungen, Know-how und Ziele der Methode profitiert eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten. Erfolgreiche Ansätze nutzen Adenovirus Ausrichtung auf JunB und Pten9 oder Lentivirus targeting Pten und Trp5310 wurden unter anderem gezeigt. Transgene wie Luciferase, das virale Konstrukt oder die GEMM hinzugefügt ermöglicht außerdem nicht-invasive Überwachung des Fortschreitens der Krankheit über Biolumineszenz imaging11.
Genom-Bearbeitung auf der CRISPR/Cas9-Technologie basiert, zeigt eine neue und schnelle Möglichkeit, Krebs durch schnelle Generierung von somatischen Knockouts12zu studieren. Virale Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) an der vorderen Lappen der murinen Prostata gerichtet schafft ein physiologisch relevanter Modell von Prostata-Krebs. Auf diese Weise können Einzelzellen mit ausgewählten Mutationen Klone bilden, die in der Lage sind der Ausbau und die Invasion. Darüber hinaus generiert Verwendung des Guide RNAs für mehrere Zielgene zellklonen mit Veränderungen in verschiedenen Genen. Tumor Heterogenität und einer natürlichen Selektionsdruck wird auf Tumorprogression, dadurch die Bedeutung der einzelnen Gen Veränderung oder epistatic Mechanismen aufdecken können.
Hier präsentieren wir eine Methode um Viruspartikel an der murinen Prostata für Änderung der Genexpression zu liefern. Durch einen kleinen Bauchschnitt der murine anteriore Prostate Lappen ist ausgesetzt und virale Partikel in der Lappen eingespritzt werden. Fünf Tage nach der Operation, chirurgische Clips aus der Haut entfernt werden können und der Prostata Krebs ab 8 Wochen nach analysiert werden kann. Insgesamt ist dies eine schnelle und kostengünstige Verfahren, das hat wenig Einfluss auf die Maus und ermöglicht größere Tumor zu entwickeln, ohne Kompromisse bei der Maus.
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Protokoll
Dieses Protokoll beinhaltet einen chirurgischen Eingriff bei Labormäusen. Alle Tierversuche müssen einzeln überprüft und genehmigt durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Gewährleisten Sie der Ansatz basiert auf tierische Erholung und überleben, geeignete Anästhesie, Schmerztherapie und eine aseptische op-Umgebung jederzeit. Verwenden Sie ein Heizkissen, um Unterkühlung während der Operation und bis zur Genesung aus der Narkose zu verhindern.
1. ausgehend von Überlegungen
- Abhängig von dem Virus verwendet gelten andere Titer Anforderungen; Das Virus entsprechend zu verdünnen.
Hinweis: In diesem Beispiel wird eine Adeno-assoziierten Virus in PBS verdünnt auf einen Titer von 1 x 1012 IU/mL injiziert. Das Virus hat Serotyp 9 und enthält Anleitung RNA Pten und Expression von Cre-Protein unter eine Ubiquitin-Promotor (Abbildung 1). Verlust von Pten pAKT und Verbreitung der prostatischen Epithel13erhöht. - Verwenden Sie männliche Mäuse im Alter von 8 Wochen zum Zeitpunkt der Operation, um angemessene Prostata Entwicklung sicherzustellen.
Hinweis: In diesem Experiment gezeigt-Mäuse sind Rosa26-LSL-Cas9-EGFP Profi Mäuse C57BL/6J Hintergrund12 (Abbildung 1). - Einen Vollnarkose-Mix frisch zubereiten und möglichst steril halten.
Hinweis: Für bessere Tier Erholung nach der Operation, ist Gegengift Narkose empfohlen.- Um ein Gesamtvolumen von 5 mL Narkose vorzubereiten, mischen Sie 0,15 mL Medetomidine Hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL Midazolam (5 mg/mL) und 0,25 mL Butorphanol (10 mg/mL) mit 4,2 mL steriles salzhaltigem Wasser.
Hinweis: Alternative Anästhesie Methoden, z. B. Inhalierbare Isofluran können nach den institutionellen Tierpflege-Richtlinien verwendet werden. - Um die Wirkung der Medetomidine Hydrochlorid postoperative stornieren, mischen Sie 0,1 mL Atipamezol (5 mg/mL) mit 4,9 mL steriles Kochsalzlösung Wasser.
- Um ein Gesamtvolumen von 5 mL Narkose vorzubereiten, mischen Sie 0,15 mL Medetomidine Hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL Midazolam (5 mg/mL) und 0,25 mL Butorphanol (10 mg/mL) mit 4,2 mL steriles salzhaltigem Wasser.
- Bereiten Sie eine aseptische op-Umgebung durch ordnungsgemäße Desinfektion und Sterilisation. Autoklaven chirurgische Instrumente vor Gebrauch.
(2) Virus-Lieferung an der murinen Prostata
- Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Verwenden Sie eine Narkose-Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht. Dauert das Verfahren länger als 30 min, pflegen Betäubung durch Einspritzen von 1/3 der ersten Dosis alle 30 Minuten.
- Prüfen Sie die Narkose Tiefe durch die Bewertung, Muskelentspannung, Pedal Rückzug und palpebrale Reflexe. Wenn Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren des unteren Bauches des Tieres.
- Decken Sie das Tier Augen sorgfältig mit tierärztliche Augenheilkunde Salbe mit einem sterilen Wattestäbchen gegen Blindheit aufgrund mangelnder Hornhaut Reflex ab.
- Wischen Sie den rasierten Bauch mit 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod zu desinfizieren den OP-Bereich. Schrubben Sie den OP-Bereich von der Mitte des OP-Bereich in Richtung der Peripherie.
- Führen Sie einen vertikalen Hautschnitt an der niedrigen Bauch Mittellinie von ca. 1 cm mit einer sterilen chirurgischen Schere.
- Heben Sie das Bauchfell mit einer feinen Spitze Pinzette, damit die Organe, die unter Verlegung sind nicht beschädigt. Machen Sie vorsichtig einen < 8 mm Einschnitt mit einer chirurgischen Schere durch das Peritoneum.
Hinweis: Im Gegensatz zu Menschen, ein Nagetier Prostata umfasst vier separate Lappen. Der vordere Lappen ist der Samenblase beigefügt. - Sanft bewegen das Fettgewebe beiseite, fruchtbaren Vesicle aufzudecken. Heben Sie vorsichtig mit einer Pinzette Ring der Samenblase bis die vordere Prostata kann identifiziert (Abbildung 1).
- Injizieren Sie ein Gesamtvolumen von 30 µL Virus (3 x 1010 Viruspartikel) Lösung in der vorderen Prostata Epithel mit einer 0,5 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm. Minimieren Sie Leckage zu und sicherzustellen Sie, dass die Flüssigkeit im Gewebe, bilden eine kleine Blase absorbiert wird. Legen Sie die Samenblase zurück in die Bauchhöhle.
- Das Bauchfell mit 2-3 einfache unterbrochenen Nähten mit 6-0 resorbierbaren Fäden mit einer 13 mm, 3/8 Kreis und einer konischen Punkt Nadel Naht.
- Heften Sie die Haut mit 3 sterile 4,8 x 6,5 mm-Clips Anheben der Haut mit einer Pinzette zu beschädigen das Bauchfell.
- Bessere Erholung beantragen Sie die Anästhesie Gegenmittel in einer Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Legen Sie vorsichtig die Tiere zurück in seinen Käfig.
3. postoperative Verfahren
- Halten Sie den Käfig mit Mäusen, die operiert auf ein Heizkissen für 1 h nach dem Eingriff, um Unterkühlung bis vollständig erholt zu verhindern. Wenn das Gegenmittel angewendet wird, sollte das Tier werden wach wenige Minuten nach der Injektion.
- Beobachten Sie die Tiere täglich für entsprechende Wunde heilen und Schmerzen Indikationen. Bei Bedarf verwalten Sie zusätzliche Schmerzmittel nach institutionellen Tierbetreuung Richtlinien.
- Entfernen Sie Haut Clips nach 4-5 Tagen, sobald die Wunde geschlossen ist.
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Ergebnisse
Virus-Lieferung an der murinen Prostata zu bewerten, wurden Proben analysiert, drei Monate nach der Operation. Die Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Mäusen12 express GFP in Zellen, die Cre Protein ausgedrückt durch das Virus ausgesetzt gewesen. Die Prostata Proben untersucht mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, Bereiche mit GFP Signal (Abb. 2A) zu identifizieren. Die GFP-Signal zeigt Kre-Aktivität in der Prostata Epithel aber nicht ob gen Bearbeitung...
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Diskussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode um die Genexpression in der vorderen Lappen der murinen Prostata durch Virus Injektion zu ändern, erstellen ein leistungsfähiges neues Mausmodell für Prostatakrebs (Abbildung 2). Die erfolgreiche Verwaltung eines Adenovirus wurde erstmals von Leow Et Al. 20058beschrieben. Wir haben bereits gezeigt, wie ein Adenovirus-Codierung für eine Cre-Rekombinase-Protein zeitraubende Kreuzung eine Cre-Allel für gewebespezi...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Herr wurde durch ein Stipendium von der dänischen Krebsgesellschaft (R146-A9394-16-S2) finanziert. MFB und MKT wurden durch AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) finanziert. Herr und MFB wurden von Graduate School, Gesundheit, AU mitfinanziert. Das E.F.W. Labor wird unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wirtschaft (SAF2015-70857, mitfinanziert von der EFRE-EU) und eine ERC advanced Grant (741888 - CSI-Fun).
Wir wollen danken Liliana Fajardo Mellor (Gene, Entwicklung und Krankheit; National Cancer Research Center) für kritische Lektüre des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J Mäuse | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 Insulinspritze | BD | 324825 | zur Virusinjektion |
| 1 ml Spritze | BD | 300013 | zur Anästhesieinjektion |
| 30 G 1/2" ' Nadel | BD | 304000 | für die Anästhesieinjektion |
| 6-0 Polysorb Naht | Medtronic | GL889 | zum Verschließen des Bauchfells |
| Sterilisiertes Einweg-OP-Tuch mehrere | Lieferanten | ||
| Heizkissen | mehrere Lieferanten | ||
| Povidon-Jod Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimmen Maschine | Aesculap | GT415 | zum Rasieren des Bauches |
| Dumont Pinzette | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Nadelhalter | F.S.T | 12500-12 | |
| Irisschere | F.S.T | 14094-11 | |
| Schmalmusterzange | F.S.T | 11002-12 | |
| Ringzange | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Griff inkl. Clips | F.S.T | 12030-01 | zum Verschließen der Haut |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Mikroskop | Leica | Modelle wurden verwendet | |
| Reagenzien | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | gewonnen aus der tierischen Einrichtung | ||
| Butorphanol | gewonnen aus der tierischen Einrichtung | ||
| Medetomidinhydrochlorid | gewonnen aus der tierischen Einrichtung | ||
| Midazolam | gewonnen aus der tierischen | ||
| Einrichtung 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Augensalbe | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | mehrere Lieferanten | in diesem Protokoll verwendet wird, ist ein in eigener Produktion | |
| hergestellter pAKT-Antikörper | CST | 4060 | verwendet 1:200 Dillution |
| GFP Anitbody | CST | 2956 | verwendet 1:100 Dillution |
Referenzen
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