Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.
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Methodenartikel
Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mit einer steigenden Inzidenz von Prostatakrebs ist die Identifizierung der Tumor Fahranfänger oder Modulatoren entscheidend. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) für Prostatakrebs sind durch Tumor Heterogenität und seine komplexe Mikroevolution Dynamik erschwert. Traditionelle Prostatakrebs-Maus-Modellen gehören unter anderem Keimbahn und bedingte Knockouts, transgene Ausdruck der Onkogene und Xenograft-Modelle. Generation von de Novo Mutationen in diesen Modellen ist komplex, zeitaufwändig und kostspielig. Darüber hinaus zielen die meisten traditionellen Modelle den Großteil der Prostata Epithel, während menschlichen Prostata-Krebs ist bekannt als ein isoliertes Ereignis in nur eine kleine Teilmenge von Zellen zu entwickeln. Wertvolle Modelle müssen jedoch nicht nur Prostatakrebs Einleitung auch Progression zu fortgeschrittener Erkrankung zu simulieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ein paar Zellen in der Prostata Epithel durch 3D-Steuerung Zellen nach Viruspartikel zu adressieren. Die Lieferung eines veränderter Virus an der murinen Prostata ermöglicht Änderung der Genexpression in der Prostata Epithelien. Virus-Typ und die Menge werden hiermit die Anzahl der Zellen zielgerichtet für gen-Änderung definieren, indem transducing ein paar für Krebs Einleitung und viele Zellen für die Gentherapie. Durch Chirurgie-basierte Injektion in die vorderen Lappen, distale aus dem Harn Track kann der Tumor in diesem Modell erweitern, ohne Beeinträchtigung der harnfunktion des Tieres. Darüber hinaus durch die Ausrichtung auf nur eine Teilmenge der epithelialen Zellen der Prostata die Technik ermöglicht klonalen Expansion des Tumors und daher imitiert menschliche Tumorentstehung sowie Verlauf und Invasion durch die Basalmembran.
Diese neuartige Technik bietet eine leistungsstarke Prostatakrebs Modell verbesserte physiologische Relevanz. Leiden der Tiere ist begrenzt, und da keine zusätzliche Zucht erforderlich ist, insgesamt tierischen Graf wird reduziert. Zur gleichen Zeit wird Analyse neue Kandidatengene und Wege beschleunigt, die wiederum ist kostengünstiger.
Einleitung
Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs haben in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert. Dennoch steigt die Inzidenz von Prostatakrebs nach Lebenserwartung. Mit schätzungsweise 1,1 Millionen neue Fälle weltweit gehört er zu den häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesursache bei Männern 1. Prostatakrebs ist in seiner Entwicklung langsam, aber wenn der Krebs in einem fortgeschrittenen metastasierten Stadium fortgeschritten ist, die Prognose ist schlecht aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Bisher nur wenige Gene wurden als gemeinsame Treiber in diesem Krebs identifiziert und ihre Heterogenität und Multifocality behindert ....
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Protokoll
Dieses Protokoll beinhaltet einen chirurgischen Eingriff bei Labormäusen. Alle Tierversuche müssen einzeln überprüft und genehmigt durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Gewährleisten Sie der Ansatz basiert auf tierische Erholung und überleben, geeignete Anästhesie, Schmerztherapie und eine aseptische op-Umgebung jederzeit. Verwenden Sie ein Heizkissen, um Unterkühlung während der Operation und bis zur Genesung aus der Narkose zu verhindern.
1. ausgehend von Überlegungen
- Abhängig von dem Virus verwendet gelten andere Titer Anforderungen; Das Virus entsprechend zu verdünnen.
Hinweis: In diesem Beis....
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Ergebnisse
Virus-Lieferung an der murinen Prostata zu bewerten, wurden Proben analysiert, drei Monate nach der Operation. Die Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Mäusen12 express GFP in Zellen, die Cre Protein ausgedrückt durch das Virus ausgesetzt gewesen. Die Prostata Proben untersucht mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, Bereiche mit GFP Signal (Abb. 2A) zu identifizieren. Die GFP-Signal zeigt Kre-Aktivität in der Prostata Epithel aber nicht ob gen Bearbeitung.......
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Diskussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode um die Genexpression in der vorderen Lappen der murinen Prostata durch Virus Injektion zu ändern, erstellen ein leistungsfähiges neues Mausmodell für Prostatakrebs (Abbildung 2). Die erfolgreiche Verwaltung eines Adenovirus wurde erstmals von Leow Et Al. 20058beschrieben. Wir haben bereits gezeigt, wie ein Adenovirus-Codierung für eine Cre-Rekombinase-Protein zeitraubende Kreuzung eine Cre-Allel für gewebespezi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Herr wurde durch ein Stipendium von der dänischen Krebsgesellschaft (R146-A9394-16-S2) finanziert. MFB und MKT wurden durch AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) finanziert. Herr und MFB wurden von Graduate School, Gesundheit, AU mitfinanziert. Das E.F.W. Labor wird unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wirtschaft (SAF2015-70857, mitfinanziert von der EFRE-EU) und eine ERC advanced Grant (741888 - CSI-Fun).
Wir wollen danken Liliana Fajardo Mellor (Gene, Entwicklung und Krankheit; National Cancer Research Center) für kritische Lektüre des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J Mäuse | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 Insulinspritze | BD | 324825 | zur Virusinjektion |
| 1 ml Spritze | BD | 300013 | zur Anästhesieinjektion |
| 30 G 1/2" ' Nadel | BD | 304000 | für die Anästhesieinjektion |
| 6-0 Polysorb Naht | Medtronic | GL889 | zum Verschließen des Bauchfells |
| Sterilisiertes Einweg-OP-Tuch mehrere | Lieferanten | ||
| Heizkissen | mehrere Lieferanten | ||
| Povidon-Jod Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimmen Maschine | Aesculap | GT415 | zum Rasieren des Bauches |
| Dumont Pinzette | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Nadelhalter | F.S.T | 12500-12 | |
| Irisschere | F.S.T | 14094-11 | |
| Schmalmusterzange | F.S.T | 11002-12 | |
| Ringzange | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Griff inkl. Clips | F.S.T | 12030-01 | zum Verschließen der Haut |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Mikroskop | Leica | Modelle wurden verwendet | |
| Reagenzien | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | gewonnen aus der tierischen Einrichtung | ||
| Butorphanol | gewonnen aus der tierischen Einrichtung | ||
| Medetomidinhydrochlorid | gewonnen aus der tierischen Einrichtung | ||
| Midazolam | gewonnen aus der tierischen | ||
| Einrichtung 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Augensalbe | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | mehrere Lieferanten | in diesem Protokoll verwendet wird, ist ein in eigener Produktion | |
| hergestellter pAKT-Antikörper | CST | 4060 | verwendet 1:200 Dillution |
| GFP Anitbody | CST | 2956 | verwendet 1:100 Dillution |
Referenzen
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evoluti....
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Nachdrucke und Genehmigungen
