Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

Summary

Hier stellen wir Ihnen und Kontrast zwei Protokolle zum Pflanzengewebe decellularize verwendet: ein Waschmittel-basierten Ansatz und einem Reinigungsmittel-freie Ansatz. Beide Methoden hinterlassen die extrazelluläre Matrix von Pflanzengewebe verwendet, die dann als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen genutzt werden können.

Abstract

Die autologe, synthetische und tierische Transplantate, die derzeit als Gerüste für Gewebeersatz genutzt haben Einschränkungen aufgrund der geringen Verfügbarkeit, schlechte Biokompatibilität und Kosten. Pflanzengewebe haben günstige Eigenschaften machen sie einzigartig für geeignet als Gerüste, wie hohe Oberfläche, hervorragende Wasser-Transport und Aufbewahrung, miteinander verbundenen Porosität, bereits vorhandenen vaskulären Netzwerken und eine breite Palette von mechanischen verwenden Eigenschaften. Zwei erfolgreiche Methoden der Pflanze Decellularization für Gewebe-engineering-Anwendungen werden hier beschrieben. Die erste Methode basiert auf Waschmittel Bäder zellulären Materie zu entfernen, die vorher festgelegten Methoden verwendet, um Säugetier-Gewebe ähnelt. Das zweite ist ein Waschmittel-freie Methode adaptiert von einem Protokoll, die isoliert Blatt Gefäßsystem und beinhaltet die Verwendung einer beheizten Bleichmittel und Salzbad, Blätter und Stängel zu löschen. Beide Methoden liefern Gerüste mit vergleichbare mechanische Eigenschaften und geringen zellulären metabolischen Auswirkungen, so dass des Benutzers, das Protokoll zu wählen, das besser zu ihrer Anwendung passt.

Introduction

Gewebetechnik entstanden in den 1980er Jahren erstelle ich lebendes Gewebe Ersatzstoffe und potenziell Adresse erhebliche Organ- und Engpässe¹. Eine Strategie hat Gerüste verwendet, zu stimulieren und führen den Körper um fehlende Gewebe oder Organe zu regenerieren. Obwohl erweiterte Herstellung Ansätze wie 3D-Druck Gerüste mit einzigartigen physikalischen Eigenschaften hergestellt haben, bleibt die Fähigkeit zur Herstellung von Gerüsten mit den unterschiedlichsten erzielbaren physikalischen und biologischen Eigenschaften eine Herausforderung^{2 , 3}. Darüber hinaus aufgrund mangelnder ein funktionsfähiges vaskuläre Netzwerk, diese Techniken bei der Regeneration von 3-dimensionalen Gewebe begrenzt haben. Die Verwendung von decellularized tierischen und menschlichen Geweben als Gerüste hat in Umgehung dieses Problems^4,5,6,7unterstützt. Jedoch hohe Kosten, Variabilität von Charge zu Charge und begrenzten Verfügbarkeit können weit verbreiteten Einsatz von begrenzen decellularized Tier Gerüste⁸. Es gibt auch Bedenken hinsichtlich möglicher Krankheitsübertragung auf den Patienten und immunologische Reaktion auf einige decellularized Säugetier-Gewebe-⁹.

Zellulose, Pflanze und bakteriellen Quellen abgeleitet wurde ausgiebig zur Biomaterialien für ein breites Anwendungsspektrum in der regenerativen Medizin zu generieren. Hier einige Beispiele: Knochen,^10,11, Knorpel^12,13,14 und¹⁵der Wundheilung. Gerüste, die bestehen aus Zellulose haben einen zusätzlichen Vorteil, dass sie langlebig und resistent gegen Seins Säugerzellen aufgeschlüsselt sind. Dies ist die Säugetier-Zellen nicht die Enzyme zum Abbau von Zellulose Moleküle notwendig produzieren. Im Vergleich dazu Gerüste mit Makromoleküle aus der extrazellulären Matrix, wie Kollagen produziert, sind¹⁶ leicht abgebaut und möglicherweise nicht gut geeignet, um langfristige Anwendungen. Kollagen-Gerüste können durch chemische Vernetzung stabilisiert werden. Allerdings gibt es ein Trade-off wegen der inhärenten Giftigkeit der quervernetzern, die die Biokompatibilität der Gerüste¹⁷betreffen. Zellulose hat hingegen das Potenzial an der Implantationsstelle für längere Zeit zu bleiben, denn es ist unempfindlich gegen enzymatischen Abbau von Säugerzellen^18,19,20. Dies kann durch tuning die Rate der Zerstörung durch Hydrolyse Vorbehandlung und Co-Delivery von Gerüsten mit Cellulasen²¹verändert werden. Die Biokompatibilität des decellularized pflanzlicher Zellulose Gerüste in Vivo wurde auch in einer Studie an Mäusen²²nachgewiesen.

Durch Hunderte von Millionen von Jahren der Evolution haben Pflanzen verfeinert, ihre Struktur und Zusammensetzung zur Steigerung der Effizienz des flüssigen Transport und Aufbewahrung. Pflanze vaskulären Schiffe minimieren hydraulische Widerstand durch Verzweigung in kleinere Gefäße, ähnlich wie bei den Säugetieren Gefäßsystem nach Murrays Gesetz²³. Nach Decellularization wird die Pflanze komplexes Netzwerk von Schiffen und miteinander verbundenen Poren beibehalten. In Anbetracht der Vielzahl von verschiedenen Pflanzenarten zur Verfügung haben pflanzliche Gerüste das Potenzial, derzeit betroffen Gerüste im Tissue engineering^24,25Einschränkungen zu überwinden. Modulevsky Et Al. zeigte beispielsweise, dass Angiogenese und Zelle Migration ereignete sich, als decellularized Apfel Gewebe auf der Rückseite von einer Maus²²subkutan implantiert wurde. Gershlak Et Al. zeigten ebenso, dass Endothelzellen in das Gefäßsystem der decellularized Blätter²⁴angebaut werden konnte. In einem separaten Experiment Gershlak Et Al. konnten auch zeigen, dass Herzmuskelzellen auf der Oberfläche der Blätter angebaut werden könnte und wurden²⁴abschließen.

Pflanzen sind auch komplexe Organisation von der zellulären, der makroskopischen Skala, die schwierig ist, auch mit den modernsten Herstellungstechniken entwickelt, um Datum zu erreichen. Die komplexe hierarchische Gestaltung der Pflanzengewebe macht sie stärker ist als die Summe ihrer Bestandteile²⁶. Pflanzen besitzen eine Fülle von unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften von starren und harten Komponenten wie Stängel, zu viel flexibler und biegsam wie Blätter²⁷. Blätter variieren je nach Spezies in Bezug auf Größe, Form, Stärke, den Grad der Vaskularisierung, brechen und können unterschiedliche Grade der Hydrophilie tragen. Diese Pflanze Eigenschaften zufolge insgesamt decellularized Pflanzen als einzigartige und höchst funktionelle medizinische Geräte, unter anderem als Gewebezüchtung Gerüste dienen können.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei Methoden, um decellularize Pflanzengewebe, wie z. B. verlässt und herrührt, für den Einsatz als Gerüste in Gewebetechnik. Die erste Methode ist eine Waschmittel-basierte Technik, die verwendet eine Reihe von Bädern, DNA und zelluläre Materie, die aus einer weit verbreiteten Technik decellularize Säugetier-und Gewebe^{6,22,25 Pflanzen angepaßt worden ist zu entfernen ,28,29,30}. Die zweite Methode ist frei von Waschmittel und ist von einem "Skelettierung" Protokoll in der Regel verwendet, um das weiche Gewebe der Blätter³¹angepasst. Vorherige Arbeiten zeigten, dass Sieden Blätter in einer Chlorid und Natrium Bikarbonat-Lösung Trennung des Gefäßsystems von den umgebenden Weichgewebe-^{31 erleichtert}. Diese Technik kann zurück zu Experimenten in der 17^th und^{18 Jahrhundert, wie die Arbeit von Albertus Seba32 und Edward Parrish33} angeführt werden. Diese Experimente zentriert um verlassen Pflanzenteile, wie Blätter und Früchte, in Wasser getaucht, über einen längeren Zeitraum (Wochen bis Monate) und ermöglicht die weicheren Gewebe natürlich zerfallen. Hier ist der Ansatz "Skelettierung" um milderen Bedingungen, z. B. längere Inkubationszeiten bei niedrigeren Temperaturen zu verwenden, um zelluläre Rückstände zu entfernen und nicht zu erheblich stören die Weichgewebe-Struktur angepasst. Für die detaillierte hierin Experimente dienten drei Anlagentypen: Ficus Hispida, Pachira Aquatica und eine Art von Garcinia. Ergebnisse von DNA-Quantifizierung, mechanische Prüfungen und Auswirkungen auf die zelluläre Stoffwechselaktivität von beiden Methoden werden beschrieben.

Protocol

1. Decellularization von Pflanzengewebe mit dem Waschmittel-basierten Ansatz

1. Verwenden Sie frische oder gefrorene F. Hispida, Blattproben. Frieren Sie nicht verwendete frische Proben in einem Gefrierschrank-20 ° C und Shop für zukünftigen Gebrauch (bis zu einem Jahr).
   Hinweis: Verwenden Sie Stamm oder Blatt Gewebe fast jede gewünschte Pflanze. Längere Lagerzeiten können das Gewebe beschädigen.
   1. Bestimmen die Größe und Form der Proben auf der Grundlage der Probe Verwendungszweck verarbeitet werden (d.h. Proben in Streifen geschnitten eignen sich gut für mechanische Prüfanwendungen, inzwischen 8 mm Scheibe Proben eignen sich Multi-gut Kultivierung Anwendungen ). Schneiden Sie das Blatt in 8-mm-Scheiben mit einer scharfen, sauberen Biopsie Schlag während untergetaucht unter Raumtemperatur (20-25 ° C) entionisiertem H₂O.
      Hinweis: Dieses Protokoll kann auf ganze Blätter und Stängel verwendet werden. Allerdings werden kleinere Proben schneller decellularize.
   2. Brüten Sie die Proben für 5-10 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C) entionisiertem H₂O auf einem Shake Platte auf eine niedrige Drehzahl-Einstellung zu waschen und/oder tauen sie aus. Verwenden Sie genug entionisiertem H₂O, um sicherzustellen, dass alle Proben gründlich benetzt sind.
2. Bereiten Sie eine Lösung von 10 % (w/V) Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in entionisiertem H₂O. Ort die Proben in einem geeigneten Behälter (Glas oder Plastikschale ist ideal) und fügen Sie SDS-Lösung um die Proben vollständig zu bedecken. 5 Tage bei Raumtemperatur (20-25 ° C) inkubieren Sie Proben auf einem Shake Platte auf eine niedrige Drehzahl um Schäden an den Proben.
   Hinweis: Überfüllen Sie den Container nicht, da dies die Decellularization verlangsamen und zu ungleichen Behandlung von SDS führen. Bei diesem Schritt sollten Proben einen braunen Farbton erwerben.
   1. Ersetzen Sie nach 5 Tagen die SDS-Lösung mit entionisiertem H₂O. Incubate Proben für eine zusätzliche 10-15 min auf der Platte schütteln alle restlichen SDS-Lösung gründlich abwischen.
3. Bereiten Sie eine 1 % (V/V) nichtionische Tenside in 10 % (V/V) Bleichmittel-Lösung. Eine 500 mL-Lösung zu machen, mischen 5 mL des nichtionischen Tensids mit 50 mL Bleichmittel dann hinzufügen 445 mL entionisiertem H₂O. Submerge Proben in der frisch zubereiteten Lösung.
   Hinweis: Der nichtionischen Tenside/Bleichmittel-Lösung muss daher keine lange Haltbarkeit, sollte innerhalb von 48 Stunden der Vorbereitung verwendet werden.
4. Die nichtionischen Tenside/Bleichmittel-Lösung alle 24 h zu ersetzen, bis die Proben vollständig gelöscht werden (siehe Abbildung 1A zum visuellen Vergleich). Dann inkubieren Sie die Probe in entionisiertem Wasser auf einem Shake-Teller für 2 min um das überschüssige nichtionisches Tensid/Bleichmittel-Lösung abspülen. Legen Sie die Shake-Platte auf eine niedrige Einstellung, damit die Proben nicht beschädigt.
   Hinweis: Der Zeitaufwand für die verwendeten Proben deutlich variiert, je nach Typ und Art der Anlage. Die komplette Verfärbungen der Proben ist bezeichnend für volle Decellularization (führen Sie DNA Quantifizierung um gründliche Lichtung zu gewährleisten).
   1. Lyophilize der Proben bis zu einem Jahr zu speichern (Blitz einfrieren mit flüssigem Stickstoff wird bevorzugt, Einfrieren der Proben bei-80 ° C ist auch in Ordnung) und bei Raumtemperatur (20-25 ° C) in niedriger Luftfeuchtigkeit lagern.
   2. Rekonstituieren Proben in Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) mit genug, um Mantel Proben. Spülen Sie Proben 2-3 Mal in serumfreien Medien sanft mit einer Mikropipette vor Gebrauch (d. h. Verwendung 150-300 µL pro Spülgang in einem standard 24-well-Platte).
      Hinweis: Tris-HCl-Puffer und serumfreie Medien (z. B. DMEM, aber grundlegende Zellkultur, die Medien ersetzt werden können) sind effektiver bei der Senkung der Auswirkungen auf die Zellviabilität SDS behandelt Proben als diejenigen mit entionisiertem H₂O allein behandelt.

2. Vorbereitung der Proben mit dem Waschmittel-freie Decellularization-Ansatz

Hinweis: Die ersten Schritte dieses Verfahrens zusammen mit Schritte 1.1-1.1.2 (siehe oben).

1. Bereiten Sie einen 5 % (V/V) Bleichmittel (NaClO) und 3 % (w/V) Natriumbicarbonat (Nahco3₃) Lösung. Wärmen Sie die Lösung in einer Dampfhaube auf 60-70 ° C für F. Hispida Blattproben in 8-mm-Scheiben unter Rühren auf einer heißen Platte schneiden.
   Hinweis: Das Natriumbicarbonat kann mit Natriumkarbonat (Na₂CO₃) oder Natriumhydroxid (NaOH) ersetzt werden. Die gewünschte Temperatur variiert stark (von Raumtemperatur bis 90 ° C) und sollte entsprechend den Eigenschaften der verwendeten Proben angepasst werden.
2. Sobald die Lösung den gewünschten Temperaturbereich erreicht, Tauchen Sie die Proben und reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit um diese Schäden zu vermeiden. Nachdem die Proben sichtbar gelöscht werden (siehe Abbildung 1 b zum visuellen Vergleich), entfernen Sie vorsichtig aus dem Bad. Inkubieren Sie Proben einmal in entionisiertem H₂O für 1-2 min, überschüssige Bleichmittel-Lösung zu entfernen.
   Hinweis: Der Zeitaufwand für die Proben klar kann stark variieren. Geschnittene Petersilie kann beispielsweise in 10-15 min, während dickere und/oder größere Proben gelöscht werden, wie z. B. ganze Blätter oder Stiele Stunden, in Hochtemperatur-Bäder dauern können, komplett zu löschen.
3. Lyophilize der Proben und bei Raumtemperatur (20-25 ° C) in niedriger Luftfeuchtigkeit lagern.

Results

Beide Methoden ergab Gerüste, die für die Zellkultur und Tissue engineering-Anwendungen geeignet waren. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen Workflow über den Decellularization-Prozess mit einer intakten Blatt für die Reinigungsmittel basierende Methode und geschnittenen Proben (8 mm Durchmesser) für die Waschmittel-freie Methode. Erfolgreiche Decellularization des Ficus Hispida Gewebe nach beiden Methoden ergab klare und intakte Proben (

Discussion

Hier sind zwei Methoden, um Pflanzengewebe decellularize beschrieben. Die hier vorgestellten Ergebnisse gepaart mit den Ergebnissen von früheren Studien²⁵, legen nahe, dass die Protokolle streckte dürften für ein breites Spektrum an Pflanzenarten und an Stängeln und Blättern ausgeführt werden kann. Diese Verfahren sind einfach und erfordern keine Spezialausrüstung, so dass die Pflanze Decellularization in den meisten Labors durchgeführt werden kann. Es ist bemerkenswert, dass nach Decellularizatio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natriumdodecylsulfat	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Nichtionisches Tensid, auf das in der Arbeit verwiesen wird. Sehr viskoses Reagenz, kann helfen, das Ende der Pipettenspitze beim Hochziehen abzuschneiden.
Konzentriertes Bleichmittel (8,25 % Natriumhypochlorit)	Clorox	Artikel #: 31009	Konzentriertes Standardbleichmittel.
Natriumbicarbonat	Acros Organics	217120010	Kann durch Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat substituiert werden.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Schneidet Proben, die gut in die 24-Well-Platte
passen Bauchtänzer-Schütteltisch	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Verwenden Sie niedrige Geschwindigkeiten, um das Gewebe nicht zu beschädigen. Kann jedes Modell/jede Marke von Rütteltisch verwenden.
Isotemp Heiz-/Rührplatte	Fisher Scientific		Kann jede Art und Marke von Heiz-/Rührplatte verwenden.
Becher	Beliebig		Kann Becher jeder Größe verwenden, solange er zu Ihren Proben passt und sie nicht überfüllt
Tris-Hydrochlorid	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA-Assay	Life Technologies	P11496	Kann jedes verfügbare dsDNA-Quantifizierungsmittel verwenden.