Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.
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Methodenartikel
Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt den Bau und die funktionelle Studien ein bispezifische Antikörper (BsAb), GPC3-S-Fab. BsAbs erkennt man zwei verschiedene Epitope durch ihre zwei verschiedenen Waffen. BsAbs sind aktiv für ihre Fähigkeit, direkt rekrutieren Immunzellen zu töten Tumorzellen untersucht worden. Gegenwärtig werden die meisten BsAbs in Form von rekombinanten Proteinen, Fc-haltigen BsAbs oder als kleiner BsAb Derivate ohne die Fc-Region hergestellt. In dieser Studie wurde GPC3-S-Fab, ein Antikörper-Fragment (Fab) basierte bispezifische Antikörper, durch die Verknüpfung der Fab Anti-GPC3 Antikörper GC33 mit einem Anti-CD16 Einzeldomäne Antikörper entwickelt. GPC3-S-Fab werden in Escherichia coli ausgedrückt und durch zwei Affinität Chromatographies gereinigt. Die gereinigte GPC3-S-Fab kann speziell an binden und Krebszellen töten GPC3 positive Leber durch die Rekrutierung von natürlichen Killerzellen, was auf eine mögliche Anwendung der GPC3-S-Fab in Leberkrebs-Therapie.
Einleitung
Monoklonale Antikörper dienen heute im großen und ganzen für Krebs Behandlung1. Aufgrund der Flexibilität der Antikörper wurden verschiedene Antikörper-basierte Formate aktiv untersucht. Im Vergleich mit monoklonalen Antikörpern, haben BsAbs zwei verschiedene Antigen Bindung Module, damit sie erkennen, dass zwei verschiedene Ziele gleichzeitig und effizient lösen die Rekrutierung von immun-Effektorzellen und Tumor Zellen2töten.
Aktuelle rekombinante BsAb Formate können in der Regel zwei Klassen zugeordnet werden: Fc-haltigen BsAbs und BsAbs ohne eine Fc-Region. Verglichen mit Fc-haltigen Forma....
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Protokoll
Aller Verfahren, einschließlich menschliche Blutentnahme wurden von Sun Yat-Sen Universität Ethik-Kommission genehmigt.
1. GPC3-S-Fab Design-Strategie
- Entwerfen Sie GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung einer Fab Anti-GPC3 (vermenschlichten GC3313) mit einer Anti-CD16 LHKW14 (Abbildung 1).
- Synthetisieren Sie und Klonen Sie die VH-CH1-CD16-LHKW und VL-CL in der pET26b und pET21a Vektoren wie bereits berichtet12.
2. Transformation und Kultur
- Addieren Sie 100 ng von pET26b mit VH-CH1-C....
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Ergebnisse
GPC3-S-Fab-Reinigung
GPC3-S-Fab wurde von E. Coli durch eine zweistufige Affinitätsreinigung erst mit Ni-NTA-Agarose, gefolgt von IgG-CH1 Affinitätsreinigung gereinigt. Nach dem zweistufigen Affinitätsreinigung gereinigt wurde GPC3-S-Fab zur Homogenität mit zwei Ketten in der Nähe von 1:1 (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von VH-CH1-CD16 LHKW und VL-CL Polypeptide kann iden.......
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Diskussion
In dieser Studie präsentieren wir eine Strategie, um ein neues Format von BsAbs, konstruieren GPC3-S-Fab, die NK-Zellen GPC3 positive Tumorzellen gezielt rekrutieren kann. Die S-Fab basiert auf der natürlichen Fab Format durch das Hinzufügen einer Anti-CD16 LHKW11,12. Im Vergleich mit der BsAbs enthaltenden Fc Region, kann GPC3-S-Fab leicht in das Periplasma von Bakterien in großem Maßstab hergestellt werden.
Mit der im Protokoll besch.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der R & D Planen der Provinz Guangdong (VR China) (2016A050503028) finanziell unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Schüttelinkubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Schüttelinkumeter | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Zentrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Zentrifuge | Beckman Schar | Avanti j-26S XPI | |
| Zentrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolett Spektralphotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytisches Polyacrylamid-Gelelektrophoresegerät | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-Blot-Gerät | Criterion | Bio-rad | |
| Bildgebungssystem | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogramm | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF Säule | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Durchflusszytometer | Beckman-Schar | FC500 | |
| Zentrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision Plattenleser | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti-His-Tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| Anti-Flaggen-Tag | Sigma | F1804 | |
| Anti-Human(H& L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-Maus-IgG-HRP-gebundener Antikörper | Zellsignalisierung | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 Affinitätsharz | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK-Zellanreicherungskit | Stammzelle | 19055 | |
| Magnet | Stammzelle | 18000 | |
| CCK8 Kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Zellkultur |
| Standardmarker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gelfiltration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranosid (IPTG) | VWR Chemikalien | VWRC0487-100G | |
| Dialyseschlauch | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycin | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Trypton | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Hefeextrakt | Thermo | Fisher LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycin | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Kaliumphosphat, monobasisch wasserfrei (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Natriumphosphat, zweibasisch, wasserfrei (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozym | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromphenolblau | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100 mm x 20 mm Kunststoffschale | Corning | 430167 | |
| 25 cm2 Flasche | Corning | 430639 | |
| 96-Well-Zellkulturcluster | Corning | 3599 | |
| Saccharose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | die Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | die Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften | SCSP-528 | |
| HepG2 | die Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften | TCHu 72 | |
| Huh7 | die Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften | TCHu182 | |
| Hep3B | die Type Culture Collection der Chinesischen Akademie der Wissenschaften | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referenzen
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
