Methodenartikel

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

DOI:

10.3791/57615

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15. Juli 2018

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1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.

Zusammenfassung

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Bärtierchen sind mikroskopisch kleine Tiere, die einen Ametabolic Staat eingeben genannt Anhydrobiosis gegenüber Austrocknung und kann in ihren ursprünglichen Zustand zurück, wenn Wasser zugeführt wird. Die Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Tieren wie Bärtierchen Risiken bakterielle Kontamination, die manchmal führt zu falschen Interpretationen, zum Beispiel über den Umfang der horizontalen Gentransfer bei diesen Tieren. Hier bieten wir eine Frequenzverschiebungen Eingabemethode um das Genom der Bärtierchen Hypsibius Dujardini, aus einem einzigen Exemplar zu sequenzieren. Durch den Einsatz von strengen waschen und Schadstoffbelastung Ausgrenzung sowie eine effiziente Extraktion der 50 ~ 200 Pg genomische DNA aus einer einzelnen Person, errichteten wir eine Bibliothek mit einem DNA-Sequenzierung sequenziert. Diese Bibliotheken wurden hoch reproduzierbare und unvoreingenommene und eine Informatik-Analyse des sequenzierten lautet mit anderen H. Dujardini Genome zeigte eine minimale Menge an Verunreinigungen. Diese Methode kann auf unculturable Bärtierchen angewendet werden, die mit bisherigen Methoden nicht sequenziert werden könnte.

Einleitung

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Bärtierchen sind mikroskopisch kleine Tiere, die einen Ametabolic Staat namens Anhydrobiosis gegenüber Austrocknung eingeben können. Sie wiederherstellen, indem Sie die Absorption von Wasser1,2. Im Ametabolic Zustand sind Bärtierchen in der Lage, verschiedene extreme Umgebungen, die auch extremen Temperaturen3 und Druck4,5, eine hohe Dosierung von UV Licht6, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen zu dulden 7 , 8und kosmischen Raum9

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Protokoll

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1. Vorbereitung

  1. Bereiten Sie 2 % Agarose-Gel mit destilliertem Wasser (DW) als Lösungsmittel in einer 90-mm-Kunststoff-Kulturschale und 10 mL einer 1 % Penicillin/Streptomycin cocktail mit DW. Das Gel kann 2-3 Wochen im Brutkasten gesetzt bei 18 ° c gelagert werden
    Hinweis: Vermeiden Sie jede Lagerung des Gels unter 10 ° C, für die niedrige Temperatur schrumpft Agarosegel, was in einem winzigen Spalt zwischen dem Gel und der Kultur Gericht Wand, in der die Bärtierchen gefangen werden können.

2. Probieren Sie Vorbereitung und Schadstoff-Ausschluss

  1. Ein einzelnes Bärtierchen zu sammeln, legen Sie sie auf die vorber....

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Ergebnisse

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Schadstoff-Ausschluss:

Dieses Protokoll beinhaltet ein gründliches Waschen der Bärtierchen und eine Sterilisation mit Antibiotika-Behandlung um Kontamination zu minimieren. Dazu gehört auch eine visuelle Überprüfung um die Vollständigkeit dieser Prozesse sicherzustellen. Ein Mikroskopbild gemacht während der Validierung (Schritt 2.4 des Protokolls) ist in Abbildung 2dargestellt. Wen.......

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Diskussion

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Bakterielle Kontamination stellt eine Bedrohung für die Genom-Sequenzierung von mikroskopischen Organismen. Während frühere Studien zu tardigrade Genomsequenzierung, Kontamination mit umfangreichen Informatik Methoden12,20herausgefiltert haben, sequenziert wir das Genom von einer einzelnen Person das Risiko von Kontaminationen zu minimieren. Da eine einzelne Bärtierchen enthält ungefähr 50-200 Pg genomische DNA16 und ist umhüllt von einer .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren danken Nozomi Abe, Yuki Takai und Nahoko Ishii für ihre technische Unterstützung bei der Genom-Sequenzierung. Diese Arbeit wurde unterstützt von Beihilfe für die japanische Gesellschaft für Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Beihilfe für junge Wissenschaftler (No.22681029) und KAKENHI Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (B), Nr. 17 H 03620 von JSPS, durch eine Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte der Sumitomo Foundation (No.140340) und andererseits durch Forschungsgelder von der Regierung der Präfektur Yamagata und Tsuruoka City, Japan. Chlorella Vulgaris verwendet, um die Bärtierchen ernähren wurde mit ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SZ61 MikroskopOLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
Penicillin Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco von life technologies15140-148
VHX-5000 SystemKeyence
0,2 mL SilikonbeschichtungstubeBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Microprep KitZYMO ResearchD3021Die Verwendung dieses Kits ist absolut kritisch; siehe Schritt 3.1
1,5 mL MikroröhrchenGreiner Bio-One616-201Siehe 4.1.1
Gekühlte Mikrozentrifuge mit hoher GeschwindigkeitTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
ThruPLEX DNA-Seq kitRubicon GenomicsCAT. NO. R400406Die Verwendung dieses Kits ist absolut kritisch; siehe Schritt 4.2
ThermocyclerBioer TechnologyTC-96GHbC
AMPure XP ReagenzBECKMAN COULTER Life ScienceA63881
EthanolWako054-027335
EB PufferQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 ReagenzienAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Puffer/ReagenzThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-ZentrifugeRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3Illumina Inc.MS-102-3003
MiSeq SequenzerIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

Referenzen

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  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P.

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Schlagwörter

Sequenzierung mit ultraniedrigem InputDNA aus Einzelpr paratenTardigraden GenomDNA ExtraktionGefrier Tau Homogenisierungmanuelles ZerkleinernDNA FragmentierungKontaminationsausschluss

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