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Neuroscience

Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe los pasos críticos y precauciones necesarias para realizar la célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp. Esta técnica es un método simple y eficaz para analizar el perfil de expresión de un conjunto predeterminado de genes de una sola célula caracterizada por grabaciones de patch-clamp.

Abstract

La corteza cerebral está compuesta por numerosos tipos celulares exhibe varias características morfológicas, fisiológicas y moleculares. Esta diversidad dificulta la identificación y caracterización de estos tipos de celulares, requisitos previos para el estudio de sus funciones específicas. Este artículo describe el protocolo de reacción en cadena (RT-PCR) multiplex unicelular transcripción reversa polimerasa, que permite, después de patch-clamp en rebanadas, para detectar simultáneamente la expresión de decenas de genes en una sola celda. Este sencillo método puede aplicarse con caracterización morfológica y es ampliamente aplicable para determinar los rasgos fenotípicos del diversos tipos celulares y su entorno celular particular, como en las proximidades de los vasos sanguíneos. El principio de este protocolo es para registrar un celular con la técnica de patch-clamp, cosecha e invertir transcribir su contenido citoplásmico, y para detectar cualitativamente la expresión de un conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requiere un diseño cuidadoso de la abrazadera del remiendo intracelular solución compatible con RT-PCR y primers PCR. Para asegurar una transcripción selectiva y confiable detección, esta técnica también requiere controles apropiados de citoplasma cosechar a pasos de amplificación. Aunque aquí debe ser estrictamente precauciones, prácticamente cualquier laboratorio electrofisiológico puede usar el múltiplex célula técnica de RT-PCR.

Introduction

La corteza cerebral comprende numerosos tipos de células intervienen en diversos procesos fisiológicos. Su identificación y caracterización, un requisito previo para la comprensión de sus funciones específicas, pueden ser muy difíciles dada la gran diversidad morfológica, fisiológica y molecular que caracteriza los tipos de células corticales1 ,2,3,4.

Sola célula multiplex RT-PCR se basa en la combinación de técnicas de RT-PCR y abrazadera del remiendo. Puede probar al mismo tiempo la expresión de más de 30 genes predefinidos en células electrophysiologically identificados5. La inclusión de un trazador neuronal en la pipeta de grabación adicional permite la caracterización morfológica de las células registradas después de la revelación histoquímicas6,7,8,9, 10. es una técnica muy útil para la clasificación de tipos neuronales basados en análisis multivariado de sus rasgos fenotípicos5,9,10,11,12 ,13,14. Sola celda multiplex RT-PCR también se adapta a la caracterización de células no-neuronales tales como astrocytes15,16,17y puede aplicarse prácticamente a cada cerebro estructura18, 19,20,21,22,23 y célula tipo, asumiendo que pueden grabarse en configuración de celulares.

Esta técnica es muy conveniente para la identificación de fuentes celulares y/o objetivos de transmisión sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, especialmente cuando carecen de anticuerpos específicos. Se basa en grabaciones de patch-clamp de células identificados visualmente29y así también permite la segmentación de células en un entorno específico celular8,15,16. Además desde la Citoarquitectura del tejido de cerebro se conserva en rebanadas de cerebro, este enfoque también permite el estudio de las relaciones anatómicas de las células caracterizadas con elementos neuronales y no neuronales7,8 , 18.

Ya que esta técnica es limitada por la cantidad de citoplasma cosechada y por la eficacia de la RT, la detección de mRNA expresado en número de copias bajo puede ser difícil. Aunque otros enfoques basados en la tecnología RNaseq permiten analizar el transcriptoma conjunto de células3,4,30,31, que no necesariamente necesitan caros secuenciadores de alto rendimiento disponible en cada laboratorio. Puesto que la técnica de RT-PCR multiplex de unicelular utiliza PCR de punto final, sólo requiere termocicladores ampliamente disponibles. Puede desarrollarse fácilmente en laboratorios equipados con configuraciones electrofisiológicos y no requiere de equipo costoso. Puede proporcionar, dentro de un día, un análisis cualitativo de la expresión de un conjunto predefinido de genes. Por lo tanto, este enfoque ofrece un fácil acceso a la caracterización molecular de las células de una manera rápida.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales con animales se realiza en estricta conformidad con la normativa francesa (Código Rural R214/87 a R214/130) y ajustados a las normas éticas de la comunitarias (86/609/CEE) y la carta nacional de francés sobre la ética de experimentación animal. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de ética de Charles Darwin y enviados al Ministerio francés de educación e investigación (aprobación 2015 061011367540). El Animalario IBPS es acreditado por las autoridades francesas (A75-05-24).

1. Consideraciones preliminares

Nota: Para evitar contaminaciones, se ajustan a las siguientes recomendaciones antes de célula única empresa RT-PCR después de patch-clamp.

  1. No utilizar plásmidos que contienen genes de interés en el laboratorio ya que son una fuente potencial de contaminación.
  2. Reservamos una mesa de laboratorio de la habitación de electroforesis de gel para preparar PCRs.
  3. Dedicar una serie de pipetas y puntas de filtro resistentes de aerosol para manipular el ADN y el ARN en concentraciones inferiores a 1 ng/μl. Nunca use estos para analizar productos de PCR.
  4. Siempre usar productos libres de RNasa y DNasa y guantes.
  5. Utilizar productos químicos dedicados para la preparación de soluciones de parche-abrazadera interna. Nunca use una espátula pero pesa bastante papel para pesar polvos.
  6. Utilizar un electrodo de pH dedicado y soluciones estándar de pH, como pueden ser una fuente de contaminación (por ejemplo, RNasa).
  7. Capillares de vidrio de borosilicato de tienda; 20 μl largo, fino y flexible puntas; una micropipeta de 20 μl; una torta hecha en casa (patch-clamp pipeta soporte conectado a una jeringa de 10 mL); Tubos de PCR de 500 μl; 10 μl puntas de filtro resistentes de aerosol; y finas marcadores permanentes en una caja dedicada (figura 1).

2. primer diseño

Nota: Multiplex RT-PCR se basa en dos pasos de amplificación. Durante la primera PCR, todos los genes de interés son amplificados conjuntamente por mezclando todos los primers PCR. Para detectar confiablemente las transcripciones de las células, es esencial para el diseño de primers PCR selectivas y eficientes. El uso de cartillas (internos) anidados para las segunda rondas de PCR mejora la especificidad y la eficacia de la amplificación.

  1. Recuperar el comisariado secuencias de mRNA de los genes de interés en la base de datos de secuencia de NCBI referencia32 como los de su familia (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Escriba el nombre de los genes y las especies de interés como una consulta y haga clic en la secuencia relevante obtenida.
    2. Para restringir el análisis a la secuencia de codificación de los genes, haga clic en Enviar a (esquina superior derecha) y seleccione codificación secuencias y FASTA nucleótido como formato. Luego haga clic en Crear archivo y guarde la secuencia FASTA utilizando una extensión de archivo ".nt".
  2. Utilice guacamayo software33 (construcción de alineación múltiple y Banco de trabajo de análisis) o cualquier otro software de alineación múltiple para determinar las regiones de homología.
    1. Haga clic en archivo de | Nuevo proyecto... y seleccione el ADN como el tipo de secuencia. Para importar las secuencias de genes, seleccione secuencia | Secuencia de importación... y cargar un archivo de ".nt". Repita el procedimiento para todas las secuencias relacionadas.
    2. Haga clic y arrastre todas las secuencias en la ventana de esquema para seleccionar las secuencias de todas.
    3. Las regiones de homología de búsqueda seleccionando alineación | Búsqueda de bloques... (CTRL + S). Seleccione el par de segmentos se superponen en el Método de búsqueda. Ajustar la Pairwise puntuación corte a un valor relativamente alto (p. ej., 1.000) y el seqs. de minutos por bloque para el número total de secuencias a alinear y haga clic en iniciar.
    4. En la ventana Resultados de búsqueda que aparece, seleccionar los resultados con la máxima puntuación de MP y haga clic en el enlace. Si no se encuentra ningún resultado, disminuir la Pairwise puntuación límite o seqs. minutos por bloque.
    5. Para facilitar la visualización de regiones homólogas, seleccione alineación | Malla sombreadora | Significa puntaje.
    6. Seleccionar piezas disociadas de las secuencias y repetir los pasos 2.2.3–2.2.4 para determinar potencialmente otras regiones de homología con una MP-puntuación más baja.
    7. Para obtener las cartillas más específicas, seleccione las regiones de la homología de secuencia por lo menos.
  3. Obtener las secuencias de todas las variantes del empalme y repita los pasos 2.2.1–2.2.6. Seleccione su región común para una detección general. Considerar alternativas cassettes para dedicado empalme variantes análisis20,34,35,36.
  4. Alinear las secuencias de mRNA en el genoma de modelo animal con genomas de37 BLAST (Basic Local búsqueda herramienta de alineación) para determinar la estructura intrón-exón de los genes (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Seleccione el genoma de ratón explosión haciendo clic en el ratón y sube la secuencia FASTA obtenida en la sección de Entrar en secuencia de consulta . En la Selección del programa, seleccione optimizar para secuencias altamente similares (megablast)y, a continuación, haga clic en el botón de ráfaga .
    2. En la sección de Descripción , seleccione la alineación con la identidad más alta (100%). Asegúrese de que corresponde al gen de interés como se indica en las características de la sección alineación .
    3. Ordenar la alineación por consulta posición de arranque en la misma sección para obtener la sucesión de los exones de la secuencia de codificación. Tenga en cuenta las posiciones inicial y final de todos los golpes que corresponden aproximadamente a la posición de los intrones en la secuencia de consulta (figura 2A).
  5. Seleccione dos exones diferentes para los cebadores sentido y antisentido para diferenciarse fácilmente cDNA genomic amplificación de ADN (gDNA) basada en un criterio de tamaño (figura 2).
    Nota: La amplificación del gDNA puede ocurrir en una frecuencia baja cuando se cosecha el núcleo con el citoplasma. Por lo tanto, es fundamental diseñar intrón overspanning pares de cartilla (figura 2A). En el caso menos intrón de genes, la colección del núcleo es problemática como puede llevar a la confusión potencialmente resultados. Para tratar este tema, incluyen un conjunto de iniciadores para amplificar una secuencia intronic a punta de prueba para la presencia del gDNA25. Si el control genómico es positivo, los resultados de todos los genes del intrón menos deben ser desechados.
  6. Para lograr una eficiente amplificación, seleccione cartillas generar amplicones con una longitud ideal comprendida entre 200 y 400 pares de bases (figura 2).
  7. Para amplificar simultáneamente varios cDNAs durante el paso de la polimerización en cadena múltiplex, diseño de primers con una longitud de entre 18 y 24 nucleótidos y una temperatura de fusión (Tm) entre 55 y 60 ° C.
  8. Para minimizar la formación de estructuras secundarias, que reducen el rendimiento de la amplificación, seleccione sentido y anti-sentido cartillas con horquilla mínima y longitudes de dos caras (figura 2B).
  9. Diseño de primers internos utilizando los mismos criterios (pasos 2.5-2.8).
  10. Verificar la especificidad de los iniciadores de la polimerización en cadena alineando los iniciadores en la base de secuencia de ARN de referencia del organismo de interés utilizando un nucleótido BLAST.
    1. En BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), haga clic en nucleótido BLAST. Pegue la secuencia de una cartilla en la Secuencia de consulta entrar.
    2. En la sección Elegir conjunto de búsqueda , haga clic en otros (nr, etc.), seleccionar secuencias de ARN de referencia (refseq_rna) en la opción de base de datos y especificar el organismo (p. ej., Mus musculus (taxid:10090) ) para restringir el análisis a la especie deseada.
    3. En la Selección del programa seleccione optimizar para secuencias algo similares (blastn). En la sección de parámetros de algoritmo reduce el tamaño de palabra hasta 7 para aumentar la posibilidad de obtener éxitos.
  11. Para el diseño de primers selectivas, mantener sólo aquellos cuya secuencia tiene al menos 3 desajustes con cDNAs indeseada cuando sea posible.
  12. Solicitar cartillas desaladas en una concentración relativamente alta (por ejemplo, 200 μm) para asegurarse de que los iniciadores externos se pueden mezclar juntos en una concentración final de 1 μm.

3. preparación de los reactivos de RT

  1. 5 x RT-mix: preparar en agua libre de ARNasa 400 μL de la solución de mezcla RT (x 5) con cebadores aleatorios a 25 μm y dNTPs 2,5 mm. Guarde esta mezcla trabajo como 20 alícuotas μL en tubos μl 500.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): preparar 1 mL de 0,2 M TDT en libre de Rnasa agua y guárdelo como alícuotas μl 50.
  3. Almacenar 2.500 U de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL) y 10.000 U de transcriptasa reversa (RTase, 200 U/μL) con 5 alícuotas μl.
  4. Para asegurar una óptima calidad de los reactivos de RT, almacenar las alícuotas a-80 ° C. Utilizarlos para hasta 10 células y sólo por un día.

4. PCR validación

  1. Preparar cDNAs haciendo una transcripción inversa en una cantidad relativamente grande de ARN (típicamente 1 μg) extraído total38 de la estructura de interés.
    1. No utilice las pipetas dedicadas a sola célula RT-PCR para estos pasos preliminares, pero usar las pipetas libres de Rnasa. Diluir el ARN total hasta 1 μg/μl.
    2. En tubo 500 μl PCR, añadir 1 μl de RNA total diluido y 8 μl de agua libre de ARNasa. Desnaturalizar a 95 ° C por 1 min y enfriar el tubo en hielo.
    3. Añadir 4 μL de la RT 5 x buffer suministrado por el fabricante, 4 μL de solución de mezcla RT, 1 μl de RTase, 1 μl de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de 200 mM TDT (ver sección 3).
    4. Película el tubo, girar e incubar durante una noche a 37 ° C.
    5. Almacenar los cDNAs a-80 ° C por hasta varios años. Preparar una alícuota de cDNAs diluido a 1 ng/μl de equivalentes de ARN total.
  2. Mezclar y diluir cada par de cartilla en 1 μm con pipetas dedicadas a unicelular RT-PCR. Utilice 20 μl de cada mezcla de cartilla para 100 μl PCRs.
  3. En el hielo, preparar para cada par de primer una premezcla que contiene: agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de 10 X 0,5 μl (2.5 U, 5 U/μL) de Taq polimerasa, tampón y 1 μl de 100 x dNTPs (50 μm cada uno), 500-1.000 pg del cDNA diluidos en 1 ng/μl.
  4. Utilizar tubos PCR que se ajustan bien los pozos de la máquina de la polimerización en cadena para un control óptimo de temperatura. Añadir 2 gotas (~ 100 μL) de aceite mineral a la mezcla preparada de antemano sin tocar la pared o la tapa del tubo PCR.
  5. Para minimizar la formación de dímeros de primer, realizar un arranque en caliente mediante la colocación de los tubos PCR en termociclador precalentado a 95 ° C. Después de 30 s, expulsar rápidamente a 20 μl de la mezcla de imprimación sobre el aceite.
  6. Después de 3 min a 95 ° C, correr 40 ciclos (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s, 72 ° C, 35 s) seguido por un paso de elongación final a 72 ° C durante 5 minutos.
  7. Analizar 10 μl de cada producto PCR mediante gel de agarosa electroforesis (2%, peso/volumen)39. Si algunos productos de la PCR no tiene el tamaño esperado rediseño otras imprimaciones (ver sección 2).
    PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un intercalante químico que puede inducir mutaciones de la DNA. Consulte la oficina local de seguridad antes de usar. Siempre utilice guantes al manipularlo. Utilice una solución comercialmente disponible de solución (10 mg/mL) el bromuro de etidio en lugar de polvo para minimizar el riesgo de inhalación. Del mismo modo, la luz UV puede ser perjudicial, así que asegúrese de llevar gafas de seguridad de protección de rayos UV o una mascarilla. Retirar suciedad geles, consejos, guantes y buffer en contenedores de basura de etidio.
  8. Una vez que todos los pares de cartilla han sido validados individualmente, probar el protocolo multiplex (figura 3).
    1. Mezclar y diluir cebadores externos todos juntos en 1 μm. Almacene las primers multiplexores mezclan a-20 ° C por hasta varias semanas.
    2. En el hielo, preparar una premezcla que contiene: agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de 10 X buffer, 1 μl de 100 x dNTPs (50 μm de cada uno), 500-1.000 pg de cDNAs diluido en 1 ng/μl y 0,5 μl (2.5 U, 5 U/μL) de Taq polimerasa.
    3. Quitar el tubo PCR, girar y añadir dos gotas (~ 100 μL) de aceite mineral.
    4. Realizar un arranque en caliente como se describe en el paso 4.5 con 20 μl de la mezcla del primer múltiplex. Después de 3 min a 95 ° C, 20 PCR ciclos idénticos a los de paso 4.6.
    5. Preparar una serie de tubos PCR idénticos al número de genes para analizar. Preparar una mezcla preparada de antemano como en paso 4.8.2, pero usando 1 μl del producto PCR primer por gene como plantilla. Ajuste todos los volúmenes según el número de genes para analizar y considerar el uso de 10% de volumen adicional para compensar los errores de pipeteo.
    6. Agite suavemente, girar el tubo, enviar 80 μl de la mezcla preparada de antemano en cada tubo PCR y añadir dos gotas (~ 100 μL) de aceite mineral por el tubo sin tocar la pared o la tapa de los tubos.
    7. Realizar un hot start (consulte el paso 4.5) por expulsión 20 μl de mezcla interna cartilla preparada en el paso 4.2. Correr 35 ciclos PCR idéntico al paso 4.6.
    8. Analizar el segundo productos PCR por electroforesis en gel de agarosa. Asegúrese de que cada segundo PCR genera un amplicón del tamaño esperado. En caso de amplificaciones ineficientes o no específicos, volver a diseñar nuevos cebadores (pasos 2.5 – 2.12) y validarlos (pasos 4,2 – 4,8).

5. elaboración y validación de la solución intracelular de Patch-clamp

Nota: El siguiente protocolo describe la preparación y validación de un /gluconate K+base solución interna, pero puede utilizarse prácticamente cualquier tipo de solución de patch-clamp como no obstaculizan la eficacia de la RT-PCR. Uso de guantes es obligatorio para obtener una solución interna libre de Rnasa.

  1. Para 60 mL de solución de grabación interna abrazadera del remiendo, preparar espontáneamente 10 mL de 0,1 M de KOH.
  2. Disolver 11,4 mg de EGTA (0,5 mM final) en 0,9 mL de 0,1 M de KOH.
  3. Añadir 40 mL libre de Rnasa de agua y disolver 2,02 g de K-gluconato (144 mM final), 143 mg de HEPES 10 mM (final) y 180 μl de 1 M de MgCl2 (3 mM final).
  4. Ajustar el pH a 7.2 Añadir ~ 6 mL de 0,1 M de KOH.
  5. Ajuste de la osmolaridad a 295 mOsm ~ 13 ml de agua libre de ARNasa.
  6. Puesto que la solución interna también se utiliza como almacenador intermediario para la transcripción inversa, controlar concentración de Mg2 + . Compensar una menor Mg2 + concentración en la solución interna mediante la adición de MgCl2 luego para alcanzar una concentración final de 2 mM en la reacción de RT.
  7. Para etiquetar las células cosechadas después de patch-clamp de grabación, añadir de 2 a 5 mg/mL de biocitina libre de Rnasa a la solución interna descrita anteriormente (pasos 5.1 – 5.5).
  8. La solución interna del filtro (tamaño de poro de 0,22 μm) y almacenar a-80 ° C alícuotas de como 100 – 250 μl.
  9. Para validar el uso de la solución interna para RT-PCR unicelular, Añadir 0,5 μl de ARN total diluido en 1 ng/μl a 6 μl de solución de patch-clamp y dejarlo en el Banco durante unos 30 minutos.
  10. Con una micropipeta de 2 μl, añadir 2 μl de 5 x RT-mix, 0.5 μl de DDT de 20 x, inhibidor de Rnasa de 0.5 μl y 0,5 μl RTase e incubar toda la noche a 37 ° C.
  11. Girar el tubo. En el hielo añadir agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de 10 X buffer y 0,5 μl (2.5 U, 5 U/μL) de Taq polimerasa.
  12. Realizar 40 ciclos de PCR utilizando un conjunto de cartillas validados (pasos 4.4-4.6).
  13. Analizar los productos PCR por electroforesis en gel de agarosa (ver paso 4.7) y verificar que tengan el tamaño esperado.
    Nota: Omitir el 0,5 μl de RNA total y reemplazarlo con 0,5 μl de agua libre de ARNasa se asegurará de que la solución interna está libre de contaminaciones de RNA o DNA.

6. agudo rodaja preparación

Nota: Este protocolo describe el procedimiento de corte para menores (es decir, menos de 28 días postparto) ratones masculinos y femeninos. Otras soluciones de corte, como la basada en sacarosa de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) también son utilizables40.

  1. Preparar 2 L de la aCSF que contiene (en mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glucosa y sacarosa 15. Para reducir la actividad glutamatérgica en rodaja preparación, preparar una solución de corte mediante la adición de 1 mM de ácido quinurénico.
  2. Antes de cortar, preparar un kit de disección con tijeras quirúrgicas, tijeras iris fino, dos espátulas, fórceps, un disco de papel filtro y el pegamento del cianocrilato.
  3. Corte helado solución saturada de O2/CO2 (95% / 5%) y enfriamiento de la cámara de la corte a-20 ° C.
  4. Anestesiar el ratón con una toalla de papel pequeña empapada con isoflurano. Después de 2 min, asegúrese de que el ratón está bajo anestesia profunda mediante la verificación de la ausencia de respuesta a la pizca de la pata.
  5. Rápidamente decapitar el ratón. Quitar el cuero cabelludo y abrir el cráneo. Extraer el cerebro cuidadosamente y coloque en un vaso de precipitados pequeño llenado de hielo frío (~ 4 ° C) solución de corte oxigenada con O2/CO2.
  6. Extraiga la cámara de corte de-20 ° C condiciones y eliminar la humedad con una toalla de papel.
  7. Disecar cuidadosamente el cerebro para aislar la región de interés, pegamento en la cámara de corte y corte helada solución oxigenada con O2/CO2.
  8. Corte rebanadas gruesas de 300 μm con un vibratome. Transferencia a temperatura ambiente en una cámara de descansa llenada de solución del corte oxigenada y permitirles recuperar durante al menos 0,5 h.

7. célula RT-PCR después de la grabación de Patch-clamp

  1. Limpiar el sistema de perfusión con ~ 100 mL de solución de 30% H2O2 y enjuague con ~ 500 mL de agua destilada para evitar el crecimiento de las bacterias, ya que es una fuente pasada por alto de contaminación de Rnasa.
  2. Cloro el filamento con una pipeta de parche llenada de blanqueador concentrado cada día de recolección. No utilice una micropipeta para llenar la pipeta de parche sino más bien una 20 μl largo, fino, flexible punta conectada a una jeringa de 1 mL. Luego, enjuague exhaustivamente con agua libre de ARNasa y séquela con un paño de gas.
  3. Preparar una pequeña caja de hielo que contiene 5 x RT-mix y 20 alícuotas de x DTT. Almacenar las alícuotas inhibidor RTase y Rnasa a-20 ° C en un enfriador de sobremesa.
  4. Transferencia de un segmento en la cámara de grabación de perfusión a 1-2 mL/min con oxigenada aCSF.
  5. Tirar pipetas de patch (1-2 μm abrir diámetro de la punta, 3 – 5 MΩ) de vidrio borosilicato usando guantes y uno de ellos se llenan de 8 μL de la solución interna. Tenga en cuenta que los mandos del tirador pipeta son una fuente de contaminación de Rnasa.
  6. Coloque la pipeta en el soporte de pipeta nuevo guantes y no tocar el filamento con los dedos.
  7. Acercarse a la pipeta del parche con una presión positiva y realizar el registro de celulares para caracterizar la célula específica (figura 4).
  8. Con el fin de preservar los mRNAs, limitar el tiempo en configuración de celulares a 20 min41.
  9. Al final de la grabación, preparar un tubo PCR de 500 μl con 2 μl de 5 x RT mezcla 0,5 μl de 20 x DTT, girar y almacenar en hielo.
  10. El citoplasma de la célula de la cosecha aplicando una suave presión negativa (figura 4). Visual control que contenido de la celda viene dentro de la pipeta manteniendo un sello hermético.
    1. Evitar tanto como sea posible recoger el núcleo si se consideran algunos genes del intrón-menos. En tal caso siempre incluyen un conjunto de iniciadores para amplificar gDNA sondeo genómico de contaminación.
    2. Si el núcleo está saliendo cerca de la punta de la pipeta, suelte la presión negativa y mueva la pipeta lejos del núcleo. Asegurarse que el sello hermético y reinicie para recoger el citoplasma en la nueva ubicación de la pipeta.
  11. Parar la recolección viniendo no más material o antes de perder el sello hermético.
  12. Retirar la pipeta suavemente para formar un parche fuera de salida para limitar la contaminación por los desechos extracelular (figura 4) y para favorecer el cierre de la membrana celular para posterior análisis histoquímico.
  13. Tenga en cuenta las perillas, micromanipuladores, teclado o ratón de la computadora son las fuentes potenciales de contaminación de Rnasa. Si se han tocado durante la grabación, cambiar de guantes.
  14. Coloque la pipeta en el expeller y vierta su contenido en el tubo PCR aplicando una presión positiva (figura 1).
  15. Romper la punta de la pipeta en el tubo PCR a la colección de su contenido.
  16. Brevemente el tubo de centrífuga, agregar 0.5 μl de inhibidor de la Rnasa y 0,5 μl de RTase, mezclar suavemente, centrifugar nuevamente e incubar durante una noche a 37 ° C.
  17. Girar el tubo y guardarlo a-80 ° C por hasta varios meses, hasta el análisis de PCR.
  18. Realizar el primer paso de amplificación directamente en el tubo que contiene el ~ 10 μl de los productos de la RT añadiendo agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de tampón de x 10 y (2.5 U) de 0,5 μl de Taq polimerasa. A continuación, siga las indicaciones descritas en pasos 4.8.2–4.8.8.

8. coloración histoquímica de la célula registrada (opcional)

  1. Tras las grabaciones electrofisiológicas, mantener la rodaja por 20 min en aCSF oxigenada para permitir la difusión de la biocitina en el árbol dendrítico y axonal.
  2. Coloque la rebanada en un pozo de una placa de 24 pocillos y fix noche a 4 ° C con 1 mL de paraformaldehído al 4% en 0.1 M tampón fosfato.
  3. Lavar las rodajas de 4 veces, 5 minutos cada uno, con 1 mL de tampón fosfato salino (PBS).
  4. En el mismo, permeabilizar y saturar la rebanada durante 1 h a temperatura ambiente con 1 mL de PBS suplementado con 0.25% Tritón X-100 y 0.2% de gelatina de piel de pescado de agua fría (PBS-GT).
  5. Incubar durante una noche con una fluorescencia etiquetada avidina diluido en 1/400 en 250-500 μl de PBS-GT.
  6. Lavar 5 veces, 5 minutos cada uno, con 1 mL de PBS y Monte las rebanadas.

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Representative Results

Un representante de validación multiplex RT-PCR se muestra en la figura 3. El protocolo fue diseñado para probar simultáneamente la expresión de genes diferentes 12. El vGluT1 del transportador de glutamato vesicular fue tomada como control positivo para glutamatérgica neuronas42. El GABA síntesis de enzimas (GAD65 y GAD 67), el neuropéptido Y (NPY) y la somatostatina (SOM) fueron utilizados como marcadores de GABAérgico interneuronas3,5,11. La enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2) fue utilizada como un marcador de la subpoblación de células piramidales3,16.

Las subunidades de la ATP1α1-3 de Na++ ATPasa de k y las subunidades Kir6.2 y SUR1 de los canales de K sensibles a ATP+ fueron elegidas para evaluar la relación entre la actividad neuronal y estados metabólicos43. Kir6.2 es un gen menos del intrón, el intrón SOM se incluyó como control genómico. El protocolo ha sido probado en 1 ng de atrás transcrito ARN total extraído de ratón todo el cerebro, que corresponde aproximadamente a las transcripciones de 20 células de44. La polimerización en cadena múltiplex produce 12 amplicones del tamaño esperado (figura 3 y tabla 1) que demuestra la sensibilidad y la eficiencia del protocolo. El control negativo sin RNA no producido ningún amplicón (datos no mostrados).

Una neurona piramidal de la capa V fue identificada visualmente por su gran soma y una dendrita apical prominente (figura 5A, inserción). Grabación de toda célula reveló típicas propiedades electrofisiológicas de la capa V regular de clavar las neuronas5,45,46 , sobre todo, una resistencia de entrada baja, potenciales de acción de larga duración y spike pronunciado adaptación de frecuencia (figura 5A). El análisis molecular de esta neurona reveló la expresión de vGluT1 (figura 5B), confirmando su glutamatérgica fenotipo42,46. Esta neurona también expresó SOM, ATP1α1 y 3 subunidades de la Na++ ATPasa de k. Biocitina etiquetado de las neuronas registradas confirmó una morfología piramidal (figura 5).

Como se esperaba de las neuronas glutamatérgica, el análisis molecular de 26 células piramidales de la capa V revela expresión de VGluT1, pero ninguno de los dos GADs (figura 5). Marcadores de interneuronas rara vez se observaron5,42,46. COX-2, principalmente expresado por capa II-III células piramidales3,16, no fue detectado en las células piramidales de la V capa. El ATP1α1 y 3 subunidades fueron más frecuentemente observados de la subunidad ATP1α2 del3. Las subunidades Kir6.2 y SUR1 raramente se detectaron en las neuronas piramidales de la capa V, que es consistente con su expresión preferencial en capas superiores3,43. Era procurar no cosechar los núcleos, dando lugar a una rara detección de intrones SOM (3 de 26 células, es decir, 12%).

Figure 1
Figura 1: caja dedicada para sola celda RT-PCR. Lista de materiales reservados por RT-PCR después de patch-clamp. (1) Capillares de vidrio de borosilicato, largo (2) 20 μl, puntas finas, flexibles, micropipeta μl (3) 20, expulsor (4) hecha en casa, tubos PCR de (5) 500 μl, (6) 10 μl de puntas de filtro resistentes al aerosol y marcadores (7) permanentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: estrategia de diseño de la cartilla PCR. (A) representación esquemática de la secuencia de codificación del cDNA de la COX 2 alineado a la secuencia del cromosoma 2 del ratón que contiene el gen de la COX 2. Los exones son representados por cajas negras y introns en gDNA por cajas blancas. Tenga en cuenta las diferencias en el cDNA correspondiente a las secuencias intrónicas en gDNA. Ejemplos representativos de oligonucleótidos malas y buenas, representados como flechas rojas y verdes, respectivamente. Flechas izquierda y derecha denotan cartillas de avance y retroceso. (B) secuencias y estructuras secundarias de los oligonucleótidos que se muestra en (A). Paneles izquierdos y derecho indican horquilla uno mismo-complementariedad y uno mismo-dimer formación, respectivamente. El oligonucleótido B1 muestra una formación de uno mismo-complementariedad y dímero de horquilla fuerte mientras que el oligonucleótido B2 sólo muestra formación de dímeros. Oligonucleótidos B3 y B4 tienen ninguna uno mismo-complementariedad de la horquilla y no hay formación de dímeros; son overspanning (intrónA) y han sido seleccionados como posibles iniciadores PCR (ver cuadro 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: validación de PCR múltiplex. 1 ng de RNA total de todo el cerebro del ratón fue sometido a una transcripción reversa seguida de dos rondas de amplificación por PCR. Los 12 productos PCR fueron resueltos en carriles separados por electroforesis del gel de agarosa en paralelo con Φx174 digerido por HaeIII. Los productos PCR de segunda tenían tamaños (en bp) predichos por las secuencias: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) y 182 (SOMint). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: recolección de Patch-clamp en rebanadas de cerebro. Una vez que una célula se identifica visualmente, la pipeta de grabación es aborda con una presión positiva para evitar la contaminación de detritos celulares en la punta de la pipeta. Tenga en cuenta la muesca en la membrana de esta neurona. Presión positiva se interrumpe entonces para formar una configuración de conexión celular con un sello hermético Gigaohm. Se aplican breves succiones para cambiar a la configuración de célula entera. Al final de la grabación, el citoplasma se cosecha aplicando una suave presión negativa en la pipeta manteniendo el sello hermético. Tenga en cuenta la contracción del cuerpo de la célula durante el proceso de cosechando. La pipeta de grabación luego retira suavemente para formar un parche en el exterior-hacia fuera, que favorece el cierre de la membrana de la célula para biocitina posterior revelación y la preservación de material cosechado en la pipeta de parche. Reproducido de Cauli y Lambolez47 con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: caracterización de las células piramidales neocorticales capa V. Membrana (A) respuesta potencial de una célula piramidal de la capa V inducida por impulsos de corriente de -100 -40, -10, + 60, + 120 y + 500 pA (rastros de fondo). La neurona muestra una desviación potencial débil después de la inicial respuesta hiperpolarizantes (trazos superiores). En respuesta a una despolarización supraliminal, la neurona descarga potenciales de acción de larga duración con desarrollo lentamente después de la hiperpolarización (traza superior). Cerca de saturación, la neurona descarga a baja frecuencia y exhibió una adaptación pronunciada (rastro gris superior). Recuadro: imágenes infrarrojas de la neurona piramidal de la capa grabado V. La superficie pial es hacia arriba. Barra de escala: 20 μm. (B) análisis de RT-PCR Multiplex revela expresión de vGluT1, SOM, ATP1α1 y ATP1α3. (C) Perfil de expresión génica en una muestra de 26 capas de las células piramidales de la V. vGluT1 expresó en todas las neuronas mientras GAD65 y GAD67 COX2 no fueron nunca detectados. Raramente se observaron NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 y SOMint . Las células piramidales expresan ATP1α3, 1 subunidad de Na++ ATPasa de k y ATP1α2 en menor medida. (D) máxima proyección de intensidad de imágenes confocales mostrando biocitina etiquetado de la neurona registrada en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gen / GenBank número Cebadores externos Tamaño (PB) Iniciadores internos Tamaño (PB)
vGlut1
NM_182993		 Sentido,-113 259 Sentido, -54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Anti-sentido, 126 Anti-sentido, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Sentido, 99 375 Sentido, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Anti-sentido, 454 Anti-sentido, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Sentido, 529 598 Sentido, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Anti-sentido, 1109 Anti-sentido, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Sentido, 199 268 Sentido, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Anti-sentido, 445 Anti-sentido, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
MP:
NM_023456		 Sentido, 16 294 Sentido, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Anti-sentido, 286 Anti-sentido, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Sentido, 43 208 Sentido, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Anti-sentido, 231 Anti-sentido, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Sentido, 1287 288 Sentido, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Anti-sentido, 1556 Anti-sentido, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Sentido, 1392 268 Sentido, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Anti-sentido, 1640 Anti-sentido, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Sentido, 127 216 Sentido, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Anti-sentido, 324 Anti-sentido, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Sentido, 306 431 Sentido, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Anti-sentido, 719 Anti-sentido, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Sentido, 1867 385 Sentido, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Anti-sentido, 2231 Anti-sentido, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Sentido, 8 240 Sentido, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Anti-sentido, 228 Anti-sentido, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tabla 1. Secuencias de iniciadores PCR de primera y segunda. La posición de cada cartilla de la polimerización en cadena y sus secuencias se dan de 5' a 3'. Excepción del intrón de la somatostatina, la posición 1 corresponde a la primera base del codón de inicio de cada gen.

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Discussion

Sola célula multiplex RT-PCR después de patch-clamp puede probar confiablemente y simultáneamente la expresión de más de 30 genes en células electrophysiologically identificados5. Análisis de expresión génica a nivel unicelular requiere iniciadores PCR altamente eficientes. Uno de los pasos más limitantes es la colección de contenido de la celda. Su eficiencia depende del diámetro de la punta de la pipeta de parche, que debe ser tan grande como sea posible mientras que el tamaño de celda. Pipetas de 1-2 μm de diámetro punta fueron probados para ser convenientes para los tipos neuronales más. También es esencial para asegurarse de que sólo el contenido celular se recoge y no los tejidos circundantes. Esto se logra controlando electrophysiologically la preservación de un cierre hermético durante la cosecha. La formación de una configuración exterior-out patch durante la retirada de la pipeta más protege el citoplasma cosechado de detritos celulares. La tasa de éxito de la célula única que Multiplex RT-PCR también depende de la abundancia de mRNAs del tipo célula investigados. Por ejemplo, el rendimiento obtenido con los astrocitos, que expresan mRNAs en cantidades relativamente bajas3, suele ser menor que el obtenido con las neuronas y por lo tanto requiere aumento de tamaño de muestra de15,16. Transcripción inversa, que tiene una baja eficiencia en tubos48, es la reacción limitante de solo la célula multiplex RT-PCR. Por lo tanto es fundamental utilizar reactivos de calidad superior, almacenarlos como alícuotas a-80 ° C y a utilizarlos sólo para un día. Por último, la actividad de la polimerasa de la DNA de la RTase es a menudo una fuente olvidada de la formación de dímeros de primer. Para solucionar este problema, realizar un arranque en caliente con las cartillas es fundamental para aumentar la eficiencia de amplificación. Además esto reduce el efecto inhibitorio de RTase en la Taq ADN polimerasa actividad49.

La técnica de RT-PCR multiplex de unicelular es muy versátil. Se ha utilizado ampliamente en roedores10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 , pero se pueden adaptar a modelos casi todos animales y genes suponiendo que tejido y secuencias del gene están disponibles. Diversas soluciones de patch-clamp pueden utilizarse siempre y cuando no interfieran con la RT-PCR en ensayos libres de la célula. Por ejemplo soluciones internas basadas en K+ o cationes Cs+ , Cl– o gluconato han sido usados con éxito6,36,41,55.

Clásicos falsos negativos provienen de contaminación de la Rnasa del filamento de la pipeta de parche o solución interna abrazadera del remiendo. Cloración del filamento y validar la solución interna generalmente resuelven este problema. Falsos negativos pueden ocurrir también cuando un gen se expresa a nivel unicelular baja, ya que sólo una parte del citoplasma se cosecha. La calidad de la cosecha puede incrementarse utilizando pipetas más grandes y/o por reducir el tiempo de la grabación de celulares. Cosecha de calidad puede ser evaluada mediante la inclusión de un gen llamado a expresarse en un nivel bajo en las células20. Resultados falsos positivos pueden ocurrir con calidad de tejido mal, en el que la cantidad de contaminantes desechos celulares es alta. Pruebas de la presencia de residuos se realiza introduciendo una pipeta de parche en el segmento sin realizar ningún sello y liberando la presión positiva antes de la eliminación de la pipeta. La presencia de materiales amplificable entonces es sondada por RT-PCR multiplex42. Silanizar la pipeta del parche también se ha utilizado para reducir la colección de contaminantes extracelular56. Sola celda PCR es una técnica muy sensible que puede detectar tan poco como una copia de doble trenzado DNA57. En el caso del intrón menos genes, gDNA contenida en el núcleo también puede producir falsos positivos. Evitar la colección de gDNA mediante la colocación de la pipeta del núcleo durante la cosecha ayuda a resolver este problema. La presencia del gDNA puede ser confiablemente sondada por amplificación de una secuencia intronic25.

La detección de moléculas de mRNA por RT-PCR se convierte en poco fiable en 10 copias44, probablemente debido a la baja eficiencia del RTase48y puede llevar a un bajo de detección de las transcripciones de baja abundancia26,42. Esto puede ser problemático en el caso del intrón menos genes. De hecho, evitando la cosecha del núcleo reduce la cantidad de citoplasma que se puede recoger y, por tanto, la sensibilidad de detección. La combinación de RT-PCR de la sola célula después de la abrazadera del remiendo con biocitina etiquetado requiere que la forma de la célula se mantiene tanto como sea posible (figura 3). Inevitablemente, esto reduce la cantidad de material que puede ser recogido, reduciendo así la tasa de éxito. Un compromiso entre la colección de citoplasma y la preservación de la morfología celular es obligatorio.

Datos de RT-PCR unicelular multiplexores no son cuantitativos ya que sólo dan información sobre si son cDNAs presentes o ausentes en el material recogido. Sin embargo, debido a los límites de detección descritos, la ocurrencia de detección a nivel de población puede reflejar la abundancia de genes a nivel unicelular. Enfoques alternativos permiten la generación de datos cuantitativos más, pero las limitaciones técnicas impuestas por sus estrategias de amplificación específica (es decir, la cuantificación relativa de genes homólogos o RT-qPCR) en gran parte restringen el número de genes que pueden ser simultáneamente analizan41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. La reciente combinación de grabaciones de patch-clamp y unicelular RNaseq, conocido como parche-seq30,31, permite el análisis transcriptómico cuantitativa de células electrophysiologically caracterizado. Es un enfoque nuevo y prometedor, pero se requiere acceso a secuenciadores de alto rendimiento y los datos generados requieren análisis desperdiciador de tiempo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Alexandre Mourot sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por becas de la Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 y ANR-17-CE37-0010-03), BLG es apoyado por becas de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos la facilidad animal de los IBPS (París, Francia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

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References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

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Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

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