Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1⁺ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protokoll gegen Zellen der Bauchspeicheldrüse wurde intensiv studierte^{1,2,3, 4}. Die jüngsten Fortschritte bei der in-vitro-Erzeugung von pankreatischer β-Zellen imitieren die Generation der β-Zellen bei erwachsenen Menschen, und diese Zellen zeigen therapeutische Wirksamkeit bei der Implantation in diabetischen Modell Mäuse^2,3. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Zellen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von gesunden und Typ 1 Diabetes Patienten Spender generiert keine funktionalen Unterschiede, auch wenn Sie unter Stress⁵. Darüber hinaus wurden Krankheit Phänotypen in induzierte Pankreaszellen mit Patienten abgeleitet iPSCs oder hPSCs beherbergen genetische Mutationen am gleichen Standort wie die Patienten^6,7teilweise reproduziert.

Um Zellen der Bauchspeicheldrüse aus hPSCs erstellen, wird schrittweise gezielte Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert verwendet. Die Bauchspeicheldrüse leitet sich aus dem Entoderm Layer des frühen Embryos, die Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 17 (SOX17) zum Ausdruck bringt und Forkhead Box A2 (FOXA2)⁸. Basierend auf den Studien an Mäusen, bildet die endodermische Schicht der primitiven Darm-Schlauch, der durch den Ausdruck der Hepatozyten nuklearer Faktor 1-Beta (Hnf1β) und Hepatozyten nuklearer Faktor 4-Alpha (Hnf4α) gekennzeichnet ist. Das primitive Darm Rohr verlängert und in die Atemwege Gerät, Verdauungstrakt und Organe entwickelt. Nach Dehnung, der hinteren Foregut Bereich wird der mutmaßlichen Pankreas Region, wie durch den Ausdruck der transcriptional Faktor Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1 (PDX1)^8,9,10markiert. Die dorsalen und ventralen Teil der PDX1⁺ Darm Rohr verdicken, Form pankreatischen Knospen, die durch die Co Ausdruck der Bauchspeicheldrüse Transkription Faktor 1 Untereinheit Alpha (PTF1A) und NK6 Homeobox 1 (NKX6.1)^8,11gekennzeichnet sind. Dieser Ausdruck beginnt morphologische der pankreatischen Organogenese. Pankreas Entoderm Zellen, die Komponenten der pankreatischen Knospen sind, bilden ein verzweigtes röhrenförmigen Netz von epithelialen Strukturen¹² und schließlich in exokrinen und endokrinen Zellen, einschließlich der β-Zellen Insulin-sezernierenden differenzieren und Glukagon-sezernierenden α-Zellen. Ausdruck der PDX1 ist zunächst der mutmaßlichen Pankreas Region erkannt wird dann während der gesamten Bauchspeicheldrüse Entwicklung beobachtet und zeigt Lokalisierung zu β und δ-Zellen^9,13,14. Obwohl die Pdx1⁺ Zelle Bereich, der nicht Ptf1a oder Nkx6.1 zum Ausdruck bringt unterscheidet in den Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und einige Darmzellen bei mittleren bis späten Stadium der Entwicklung in Mäusen⁹PDX1⁺ Zellen gelten als Vorfahren der Bauchspeicheldrüse in der frühen Entwicklungsphase beim Menschen.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1⁺ Zellen für die Erzeugung von Pankreas Abstammungen. Die Protokoll Eingeweihten Differenzierung durch impfen dissoziiert Einzelzellen^15,16,17. Im Allgemeinen sind undifferenzierte hPSCs als Kolonien oder Zelle Aggregate in der Schwebe oder Adhäsion gepflegt. Infolgedessen initiieren die meisten Protokolle die Differenzierung kurz nach Passagierung Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für räumliche und transkriptionelle Heterogenitäten^18,19,20,21,,²², die behindern könnten die erster Differenzierung Schritt zur endgültigen Entoderm gefolgt von ineffizienten Differenzierung nach PDX1⁺ Zellen. Dieses Protokoll kann einfache Handhabung zur Verbesserung und Stabilisierung der Differenzierung Effizienz bieten einige hPSC-Linien, die bisher gefunden wurden, ineffizient, endodermische Linien und PDX1 unterscheiden⁺ Zellen^{23, 24 , 25}.

Experimente mit hPSCs wurden von der Ethikkommission der Abteilung für Medizin und Graduate School of Medicine, Universität Kyoto genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

Hinweis: Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Wärmen Sie base Nährmedien auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch. Medium für Differenzierung innerhalb 6 h bei RT. Details der Reagenzien verwendet wird finden Sie in Tabelle der Materialien.

1. Differenzierung (Abbildung 1A)
   1. Stufe 1A Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung, Activin A, CHIR99021 und Y-27632 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, 3 μM und 10 μM bzw..
   2. Stufe 1 b Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Die serumfreien ergänzen, Activin A und CHIR99021 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, ≤1 μM bzw. hinzufügen.
      Hinweis: Die Konzentration der CHIR99021 sollte niedriger sein als im Stadium 1A Medium und Zusatz ist nicht notwendig, aber es erhöht die Anzahl von Zellen.
   3. Stufe 2 Medium: Transfer verbessert MEM (iMEM) Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung und Keratinozyten Wachstumsfaktor (KGF) zu einer Konzentration von 0,5 x und 50 ng/mL, beziehungsweise.
   4. Stufe 3 Medium: iMEM Übertragungsmedium in ein Rohr mit einer Pipette. Hinzufügen die serumfreien Beilage, KGF, Birne, 3-Keto-N-Aminoethyl-N'- Aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (CYC) und 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic Säure (TTNPB) mit Pipette, Konzentrationen von 0,5 X, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM und 10 nM, beziehungsweise.
2. Durchflusszytometrie (FCM)
   1. 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer: Transfer Wasser in ein Gefäß mit einer Pipette. Eine Konzentration von 1 X Permeabilisierung/Waschpuffer durch eine Pipette hinzufügen.
   2. FCM blockiert Lösung: Transfer 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer in ein Rohr mit einer Pipette. Esel Serum mit einer Pipette zu einer Konzentration von 2 % (Vol/Vol) hinzufügen.
3. Immunostaining
   1. Blockieren Lösung: Transfer Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie Esel Serum und Triton X Pipette zu einer Konzentration von 5 % (Vol/Vol) und 0,4 % (Vol/Vol), beziehungsweise.

(2) hPSC Differenzierung zum hinteren Foregut Zellen/Bauchspeicheldrüsen Stammväter (PDX1⁺ Zellen)

Hinweis: Durchführen Sie alle Verfahren mit sterile Techniken. hPSCs werden bei 6-Well-Platten beschichtet durch eine synthetische Oberflächenmaterial für hPSCs mit hPSC Wartung Medium entsprechend des Herstellers Anweisungen^17,26beibehalten. Wenn Zellen erreichen 50-80 % Konfluenz (Stufe 0) verwenden sie zur Differenzierung.

1. Bereiten Sie Basalmembran Matrix-beschichteten Platten.
   1. Transfer 6 mL RPMI 1640 (4 °C) in einem Rohr auf 4 °C auf Eis gekühlt. Fügen Sie 2 mg der Basalmembran Matrix (4 °C) mit gekühlten 1 mL-Pipettenspitzen und mischen Sie gut durch sanfte Pipettieren um 0,33 mg/mL Basalmembran Matrix zu machen.
   2. 2 mL der verdünnten Basalmembran Matrix Transfer in jede Vertiefung des 6-Well Zellplatten Kultur mit einer Pipette. Legen Sie die Platten bei 37 °C für 60-90 min. im Inkubator. Danach halten Sie die Platten bei RT bis zur Verwendung (innerhalb von 3 h).
2. Samen Sie der hPSCs und initiieren Sie Differenzierung zum endgültigen Entoderm (Stadium 1A) zu.
   1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (RT) pro Bohrloch mit Pipette, die hPSCs in der 6-Well-Platten kultiviert zu waschen.
   2. Aspirieren Sie 0,5 mM EDTA und 2 mL 0,5 mM EDTA pro Bohrloch mit Pipette. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 5 min.
   3. Aspirieren 0,5 mM EDTA und 1 mL hPSC Wartung Medium bei RT ergänzt mit 10 μM pro von Pipette gut Y-27632. Pipette vorsichtig, aber schnell zum Abblasen der angeschlossenen Zellen auf den Tellern und aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen zu trennen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.
   4. Übertragen die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL hPSC Wartung Medium bei RT mit 10 μM ergänzt Y-27632. Pipette vorsichtig die Zellsuspension.
   5. Zählen Sie die Anzahl von Zellen in der Zellsuspension mit dem Trypan blau Fleck-Ausschluss-Verfahren.
      1. Mix 15 μl Zellsuspension und 15 μl Trypan blau in einem Rohr.
      2. 10 μL der Zellsuspension verdünnt mit Trypan blau auf Zelle zählen Folien in zweifacher Ausfertigung mit einer 10 μl Pipette zu übertragen.
      3. Zählen Sie die Zelle Nummer mit einem automatischen Zelle Zähler zu und rechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension. Rentabilität ist in der Regel > 98 %.
   6. Aliquoten die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 1-1,5 x 10⁶ Zellen pro Bohrloch des 6-Well-Platten (1-1,5 x 10⁵ Zellen/cm²).
   7. Zentrifugieren Sie die 50 mL-Tube mit 200 X g bei RT 5 min.
   8. Den Überstand mit einer Pipette abzusaugen und die Zellen mit 1 mL der Stufe 1A Medium (RT) pro Bohrloch Aufschwemmen. Sanft die Zellsuspension pipette und ein weiteres 1 mL Stufe 1A Medium (insgesamt, 2 mL pro Well).
   9. Aspirieren Sie die verdünnte Basalmembran Matrix in den Vertiefungen der die Zellplatten Kultur von einer 1.000 μl Pipette im Schritt 2.1.2 vorbereitet. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   10. Sanft pipette die Zellsuspension in Schritt 2.2.8 wieder. Sofort nach dem Mischen übertragen Sie die Zellsuspension (2 mL) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Abdeckplatte mit einer Alu-Folie auf die Platte vor Licht zu schützen. Legen Sie die Platte in den sauberen Werkbank bei RT für 10-15 min.
       Hinweis: Bewegen Sie die Platte nicht nach der Aussaat.
   11. Legen Sie die Platte vorsichtig in einem 37 °C, 5 % CO₂ -Inkubator (feuchte Atmosphäre) und Kultur für 24 h.
       Hinweis: Schütteln Sie die Platte nicht nach der Aussaat.
3. Induzieren Sie die Differenzierung in endgültige Entoderm (Stufe 1 b).
   1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS in die Vertiefungen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
      Hinweis: Um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage entfernen, schütteln Sie vorsichtig die Platte vor jedem Anspruch.
   2. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit einer Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in 37 °C Inkubator (feuchte Atmosphäre des 5 % CO₂) und Kultur für 48 h.
   3. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
      Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen aus der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch.
   4. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO₂) und Kultur für 24 h.
4. Induzieren Sie die Differenzierung in den primitiven Darm Rohr (Stufe 2).
   1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette.
      Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch.
   2. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 2 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO₂) und Kultur für 4 Tage.
5. Induzieren die Differenzierung in PDX1⁺ Zellen (Stufe 3).
   1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
   2. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 3 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO₂) und Kultur für 3 Tage.
6. Die Differenzierung in endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse zu induzieren.
   1. Führen Sie NKX6.1⁺ Zelle Induktion (Stufe 4, für 8 Tage) gefolgt von endokrinen Zellen Induktion (Stufe 5, 12 Tage) mit den zuvor beschriebenen Protokolle^3,16,26. Charakterisieren und die endokrine Zelldifferenzierung Immunostaining und quantitative Real-Time reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse zu überprüfen.
      Hinweis: Beziehen sich auf Toyoda Et Al.¹⁶ und Kimura Et Al.²⁶ für detaillierte experimentelle Verfahren. Primer-Sequenzen für die qRT-PCR-Analyse finden Sie unter Tabelle 1 .

(3) Durchflusszytometrie (FCM)

1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM EDTA zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Aspiration und Zugabe von 0,5 mM EDTA ein Mal.
   Hinweis: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen.
2. Trennen der Zellen (ca. 3-6 × 10⁶ pro Bohrloch), fügen Sie 2 mL von 0,25 % Trypsin mit 0,5 mM EDTA pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für ca. 5-10 min.
3. Pipette vorsichtig, aber schnell zu distanzieren aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.
4. Fügen Sie ca. 8-10 mL Basis Medium (RPMI 1640 oder iMEM, RT) mit 0,5 x serumfreien Ergänzung und 10 μM Y-27632 pro gut und mischen die Zellsuspension. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.
6. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipette vorsichtig die Zellsuspension.
7. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.
8. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der Fixierung und Permeabilisierung Puffer pro 10⁶ Zellen unter einer Haube. Pipette vorsichtig die Zellsuspension unter einer Haube. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.
9. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT 5 min.
10. Aspirieren des Überstands unter eine Haube und Aufschwemmen der Zellen mit 500 μL FCM blockiert Lösung pro 10⁶ Zellen. Pipette vorsichtig die Zellsuspension. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.
11. 50 μL der Zellsuspension auf ein Rohr (ca. 1 x 10⁵ Zellen) übertragen. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM blockiert Lösung und inkubieren Sie bei 4 °C für > 16 h.
12. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.
13. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM Lösung blockiert. Inkubation der Zellen bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h mit Lichtschutz.
14. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.
15. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 180 μL von 2 % Esel Serum in DPBS.
16. Filtern Sie die Zellsuspension durch Übertragung auf eine 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr mit einer Zelle Sieb (35 µm-Nylon-Mesh) und halten Sie bei 4 °C mit Schutz vor Licht bis die Analyse.
17. Einen Teil der positiv gefärbten Zellen durch einen Flow Cytometer²⁷zu analysieren.

4. Immunostaining

1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
   Hinweis: Schütteln Sie die Platte, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen.
2. Fügen Sie 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) (4 °C) pro Bohrloch mit Pipette unter einer Haube. Halten Sie die Platte bei 4 °C für 20 Minuten.
3. Der PFA mit Pipette unter eine Haube zu entfernen. Geben Sie 2 mL des DPBS bei RT in der Pipette unter einer Haube. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
4. Fügen Sie 2 mL der blockierenden Lösung pro Bohrloch und lassen für 30 min bei RT.
5. Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. Inkubation bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h.
6. Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 und 10 min. wiederholen das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation einmal bei RT inkubieren.
7. Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. 60 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren.
8. Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 (RT) und 5 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren. Wiederholen Sie das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation zwei Mal.
9. Nehmen Sie Mikrographen, die Differenzierung Effizienz unter einem Fluoreszenz-Mikroskop-²⁸zu untersuchen.

Verbreitende HiPSCs (585A129,30) verdichten sich und bilden eine homogene Monolayer (Abbildung 1 b), die zur Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte HiPSCs (Stufe 0) sind getrennt und neu ausgesät als Einzelzellen bei niedrigen Zelldichten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2). Innerhalb von 1 h die Zellen sind an der Platte befestigt und zu Vorsprung zu zeigen beginnen. Am 1. Tag werden die Zellen stark vermehrt und gut verteilt, um 80-90 % der Fläche bedecken. Während Phase 1 b erscheinen die Medien trübe durch abgestorbene Zellen. Die Entfernung der abgestorbenen Zellen ist entscheidend für hocheffiziente Differenzierung, da abgestorbene Zellen wahrscheinlich das Überleben und die Differenzierung von Zellen, die darunter liegenden stören. An Tagen ca. 3-4 bilden Zellen ein homogenes Monolayer-Blatt, das als ein Kopfsteinpflaster Aussehen beschrieben werden kann. Zu diesem Zeitpunkt die meisten Zellen auszudrücken Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 2 (SOX2), ein Marker für die undifferenzierte Zellen zu stoppen und stattdessen express einen definitive Entoderm Marker, SOX17, bei mehr als 90 % (Abb. 2A und B). Die meisten SOX17+ Zellen ausdrückliche FOXA2 (Abbildung 2A). Ausgehend von der Differenzierung eine unangemessene Zelle Dichte Kompromisse der Differenzierung Wirkungsgrad bei diesem Schritt (Abbildung 3). In den Stufen 2 und 3 Zelltod entspannt und das eingesetzte Medium ist nicht so trüb wie in Phase 1 b. Zellen zum Ausdruck bringen die primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α (Abbildung 2) und schließlich express einen posteriore Foregut/Pankreas Stammvater Marker PDX1, bei mehr als 90 % (Abb. 2D und E). Die PDX1+ Zelle Induktion ist reproduzierbar in einer anderen HiPSC Linie, 1231A3 31und eine hESC-Line, KhES-3 32 (Abbildung 4). qRT-PCR-Ergebnisse der mRNA Expression Phase Markierungen waren konsistent mit Immunostaining (Abb. 5A). Die mRNA Expression von PDX1 zeigt sich auf Stufe 3 und Nachwort wesentlich erhöht.

PDX1+ Zellen in frühen Entwicklungsstadien haben das Potenzial, sich in nicht nur Pankreaszellen sondern auch Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und ein Teil des Darms 9differenzieren. Die Differenzierung Potenzial von in vitro generierten PDX1+ Zellen, die Zellen der Bauchspeicheldrüse durch längere Kultur mit gemeldeten Protokolle für Bauchspeicheldrüsenkrebs Entoderm beurteilt werden können und pankreatischen endokrinen Zellen3,16, 26. die Ausdrücke des Pankreas Entoderm Marker, NKX6.1und zwei pankreatischen endokrinen Marker, INSULINund GLUCAGON, bzw. an den Tagen 19 (Stufe 4) und 31 (Stufe 5), beobachtet wurden (Abbildung 5).

Abbildung 1: repräsentatives Erscheinungsbild der Zellen unter schrittweise Differenzierung. (A) A Schema der gerichteten Differenzierung von hPSCs zum Pankreas Linien. Zahlen in Klammern geben Konzentrationen (Einheiten sind unten geschrieben). (B) repräsentative Hellfeld Mikrographen des HiPSCs wichtige Schritte der Differenzierung Kultur. 585A1 HiPSCs wurden getrennt als Einzelzellen und veranlasst, in endgültige Entoderm, primitive Darm Rohr und posterior Foregut/Pankreas Vorläuferzellen differenzieren. Die unteren Platten sind vergrößerte Ansichten der oberen Platten. RPMI, RPMI 1640; AA, Activin (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, Birne (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (μM); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic Säure (nM). Skalieren von Balken = 300 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: repräsentative Induktion gegenüber Pankreas Linien von HiPSCs. (A) der Anteil der SOX2–SOX17+ Zellen durch Durchflusszytometrie vor Differenzierung (Stufe 0) und am Tag 4 (Stufe 1 b) analysiert. Undifferenzierten HiPSCs (SOX2+SOX17–) wurden differenziert nach endgültiger Entoderm (SOX2–SOX17+). Die meisten SOX17+ Zellen Co ausgedrückt FOXA2. (B) repräsentative immunofluorescent Mikrographen an Tag 4 (Stufe 1 b). Die festen Zellen wurden für SOX17 (grün), SOX2 (rot) und Zellkerne (blau) gefärbt. (C) repräsentative immunofluorescent Mikrographen an den Tagen 4 (Stufe 1 b) und 8 (Stufe 2). Die festen Zellen waren für HNF1β (grün), HNF4α (rot) und Kerne (blau) gefärbt. (D) der Anteil der Zellen positiv für PDX1, wie an den Tagen 4 (Stufe 1 b) und 11 (Stufe 3) durch Durchflusszytometrie analysiert. (E) repräsentative immunofluorescent Mikrographen PDX1 (grün) und Zellkerne (blau) an Tag 11 (Stufe 3). Skalieren von Balken = 100 μm.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: repräsentative Induktion zur endgültigen Entoderm, initiiert von unterschiedlichen Zelldichten. (A) repräsentative Hellfeld Mikrographen Zellen 1 h nach Differenzierung. HiPSCs wurden getrennt als Einzelzellen und veranlasst, in endgültige Entoderm bei unterschiedlichen Zelldichten (1-50 x 104/cm2) zu differenzieren. Die unteren Platten sind vergrößerte Ansichten der oberen Platten. (B) der Anteil der SOX2–SOX17+ Zellen durch Durchflusszytometrie vor Differenzierung (Stufe 0) und am Tag 4 (Stufe 1 b) analysiert. (C) der Anteil der PDX1+ Zellen, die an den Tagen 8 (Stufe 2) und 11 (Stufe 3) von Durchflusszytometrie analysiert. Skalieren von Balken = 300 μm.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Repräsentative Induktion in Richtung PDX1+ Zellen in HiPCSs und hes. Eine HiPSC Linie, 1231A3 (A), und eine hESC-Linie, KhES-3 (B), wurden differenziert zu endgültigen Entoderm und PDX1+ Zellen. Die Zusammensetzung der Zelle wurde Durchflusszytometrie analysiert. Der Anteil der SOX2–SOX17+ Zellen wurde analysiert, bevor Differenzierung (Stufe 0) und am Tag 4 (Stufe 1 b). Der Anteil der PDX1+ Zellen wurde an den Tagen 8 (Stufe 2) und 11 (Stufe 3) analysiert.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: repräsentative Induktion gegenüber Pankreas Entoderm und endokrinen Zellen. HiPSCs (585A1) wurden differenziert nach PDX1+ Zellen. Die Zellen wurden weiter differenziert in Pankreas Entoderm und endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit gemeldeten Protokolle3,16,26. (A) mRNA Ausdruck der Bühne Markierungen wurden durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) gemessen. Die Daten wurden auf GAPDH Ausdruck normiert und als Falte-Veränderungen in der Genexpression im Verhältnis zu den Spitzenwert vorgestellt. Beachten Sie, dass PDX1 Ausdruck erhöht wurde > 20-fold von Tag 8 (Stufe 2) bis 11 (Stufe 3) und bei > 100-fold von Tagen (Stufe 3) 11 bis 19 (Phase 4). Der Ausdruck in der Erwachsenen menschlichen Bauchspeicheldrüse wird als Bowle angezeigt. SOX2, schwarz; SOX17, lila; HNF1β, braun; HNF4α, orange; PDX1, hellgrün; NKX6.1, grün; INSULIN, blau; GLUCAGON, rot. (B) repräsentative immunofluorescent Mikrographen des Pankreas Entoderm Marker, NKX6.1 (rot), an den Tagen 11 (Stufe 3) und 19 (Phase 4). PDX1 (grün) und Zellkerne (blau) waren Co gebeizt. (C) repräsentative immunofluorescent Mikrographen zwei pankreatischen endokrinen Entscheidungsträger, Insulin (INS, grün) und Glukagon (GCG, rot), an den Tagen 19 (Stufe 4) und 31 (Stufe 5). Zellkerne (blau) wurden Co gebeizt.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Primer für qPCR.

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