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Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

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DOI:

10.3791/57641

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27. März 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Zusammenfassung

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für regenerative Medizin und als Plattform für menschliche Entwicklungsprozesse zu studieren. Stufenweise gerichtet, Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert ist einer der wichtigsten Wege, einschließlich Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Zellen der Bauchspeicheldrüse zu generieren (PDX1+) Pankreas Vorläuferzellen. Konventionelle Protokolle initiieren die Differenzierung mit kleinen Kolonien kurz nach dem Durchgang. Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für Heterogenitäten, die die Differenzierung zu PDX1 behindern könnte+ Zellen. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen. Das Protokoll besteht aus vier Schritten und initiiert die Differenzierung nach Aussaat dissoziierten Einzelzellen. Die Induktion von SOX17+ endgültige Entoderm Zellen folgte der Ausdruck der beiden primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α und eventuelle Differenzierung in PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll bietet einfache Handhabung zu verbessern und stabilisieren die Differenzierung Effizienz einiger hPSC Zeilen, die bisher gefunden wurden, um ineffizient in endodermische Linien oder PDX1 zu unterscheiden+ Zellen.

Einleitung

Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protokoll gegen Zellen der Bauchspeicheldrüse wurde intensiv studierte1,2,3, 4. Die jüngsten Fortschritte bei der in-vitro-Erzeugung von pankreatischer β-Zellen imitieren die Generation der β-Zellen bei erwachsenen Menschen, und diese Zellen zeigen therapeutische Wirksamkeit bei der Implantation in diabetischen Modell Mäuse2,3. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Zellen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von gesunden und Typ 1 Diabetes Patienten Spender generiert keine funktionalen Unterschiede, auch wenn Sie unter Stress5. Darüber hinaus wurden Krankheit Phänotypen in induzierte Pankreaszellen mit Patienten abgeleitet iPSCs oder hPSCs beherbergen genetische Mutationen am gleichen Standort wie die Patienten6,7teilweise reproduziert.

Um Zellen der Bauchspeicheldrüse aus hPSCs erstellen, wird schrittweise gezielte Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert verwendet. Die Bauchspeicheldrüse leitet sich aus dem Entoderm Layer des frühen Embryos, die Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 17 (SOX17) zum Ausdruck bringt und Forkhead Box A2 (FOXA2)8. Basierend auf den Studien an Mäusen, bildet die endodermische Schicht der primitiven Darm-Schlauch, der durch den Ausdruck der Hepatozyten nuklearer Faktor 1-Beta (Hnf1β) und Hepatozyten nuklearer Faktor 4-Alpha (Hnf4α) gekennzeichnet ist. Das primitive Darm Rohr verlängert und in die Atemwege Gerät, Verdauungstrakt und Organe entwickelt. Nach Dehnung, der hinteren Foregut Bereich wird der mutmaßlichen Pankreas Region, wie durch den Ausdruck der transcriptional Faktor Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1 (PDX1)8,9,10markiert. Die dorsalen und ventralen Teil der PDX1+ Darm Rohr verdicken, Form pankreatischen Knospen, die durch die Co Ausdruck der Bauchspeicheldrüse Transkription Faktor 1 Untereinheit Alpha (PTF1A) und NK6 Homeobox 1 (NKX6.1)8,11gekennzeichnet sind. Dieser Ausdruck beginnt morphologische der pankreatischen Organogenese. Pankreas Entoderm Zellen, die Komponenten der pankreatischen Knospen sind, bilden ein verzweigtes röhrenförmigen Netz von epithelialen Strukturen12 und schließlich in exokrinen und endokrinen Zellen, einschließlich der β-Zellen Insulin-sezernierenden differenzieren und Glukagon-sezernierenden α-Zellen. Ausdruck der PDX1 ist zunächst der mutmaßlichen Pankreas Region erkannt wird dann während der gesamten Bauchspeicheldrüse Entwicklung beobachtet und zeigt Lokalisierung zu β und δ-Zellen9,13,14. Obwohl die Pdx1+ Zelle Bereich, der nicht Ptf1a oder Nkx6.1 zum Ausdruck bringt unterscheidet in den Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und einige Darmzellen bei mittleren bis späten Stadium der Entwicklung in Mäusen9PDX1+ Zellen gelten als Vorfahren der Bauchspeicheldrüse in der frühen Entwicklungsphase beim Menschen.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen für die Erzeugung von Pankreas Abstammungen. Die Protokoll Eingeweihten Differenzierung durch impfen dissoziiert Einzelzellen15,16,17. Im Allgemeinen sind undifferenzierte hPSCs als Kolonien oder Zelle Aggregate in der Schwebe oder Adhäsion gepflegt. Infolgedessen initiieren die meisten Protokolle die Differenzierung kurz nach Passagierung Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für räumliche und transkriptionelle Heterogenitäten18,19,20,21,,22, die behindern könnten die erster Differenzierung Schritt zur endgültigen Entoderm gefolgt von ineffizienten Differenzierung nach PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll kann einfache Handhabung zur Verbesserung und Stabilisierung der Differenzierung Effizienz bieten einige hPSC-Linien, die bisher gefunden wurden, ineffizient, endodermische Linien und PDX1 unterscheiden+ Zellen23, 24 , 25.

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Protokoll

Experimente mit hPSCs wurden von der Ethikkommission der Abteilung für Medizin und Graduate School of Medicine, Universität Kyoto genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

Hinweis: Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Wärmen Sie base Nährmedien auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch. Medium für Differenzierung innerhalb 6 h bei RT. Details der Reagenzien verwendet wird finden Sie in Tabelle der Materialien.

  1. Differenzierung (Abbildung 1A)
    1. Stufe 1A Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung, Activin A, CHIR99021 und Y-27632 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, 3 μM und 10 μM bzw..
    2. Stufe 1 b Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Die serumfreien ergänzen, Activin A und CHIR99021 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, ≤1 μM bzw. hinzufügen.
      Hinweis: Die Konzentration der CHIR99021 sollte niedriger sein als im Stadium 1A Medium und Zusatz ist nicht notwendig, aber es erhöht die Anzahl von Zellen.
    3. Stufe 2 Medium: Transfer verbessert MEM (iMEM) Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung und Keratinozyten Wachstumsfaktor (KGF) zu einer Konzentration von 0,5 x und 50 ng/mL, beziehungsweise.
    4. Stufe 3 Medium: iMEM Übertragungsmedium in ein Rohr mit einer Pipette. Hinzufügen die serumfreien Beilage, KGF, Birne, 3-Keto-N-Aminoethyl-N'- Aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (CYC) und 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic Säure (TTNPB) mit Pipette, Konzentrationen von 0,5 X, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM und 10 nM, beziehungsweise.
  2. Durchflusszytometrie (FCM)
    1. 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer: Transfer Wasser in ein Gefäß mit einer Pipette. Eine Konzentration von 1 X Permeabilisierung/Waschpuffer durch eine Pipette hinzufügen.
    2. FCM blockiert Lösung: Transfer 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer in ein Rohr mit einer Pipette. Esel Serum mit einer Pipette zu einer Konzentration von 2 % (Vol/Vol) hinzufügen.
  3. Immunostaining
    1. Blockieren Lösung: Transfer Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie Esel Serum und Triton X Pipette zu einer Konzentration von 5 % (Vol/Vol) und 0,4 % (Vol/Vol), beziehungsweise.

(2) hPSC Differenzierung zum hinteren Foregut Zellen/Bauchspeicheldrüsen Stammväter (PDX1+ Zellen)

Hinweis: Durchführen Sie alle Verfahren mit sterile Techniken. hPSCs werden bei 6-Well-Platten beschichtet durch eine synthetische Oberflächenmaterial für hPSCs mit hPSC Wartung Medium entsprechend des Herstellers Anweisungen17,26beibehalten. Wenn Zellen erreichen 50-80 % Konfluenz (Stufe 0) verwenden sie zur Differenzierung.

  1. Bereiten Sie Basalmembran Matrix-beschichteten Platten.
    1. Transfer 6 mL RPMI 1640 (4 °C) in einem Rohr auf 4 °C auf Eis gekühlt. Fügen Sie 2 mg der Basalmembran Matrix (4 °C) mit gekühlten 1 mL-Pipettenspitzen und mischen Sie gut durch sanfte Pipettieren um 0,33 mg/mL Basalmembran Matrix zu machen.
    2. 2 mL der verdünnten Basalmembran Matrix Transfer in jede Vertiefung des 6-Well Zellplatten Kultur mit einer Pipette. Legen Sie die Platten bei 37 °C für 60-90 min. im Inkubator. Danach halten Sie die Platten bei RT bis zur Verwendung (innerhalb von 3 h).
  2. Samen Sie der hPSCs und initiieren Sie Differenzierung zum endgültigen Entoderm (Stadium 1A) zu.
    1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (RT) pro Bohrloch mit Pipette, die hPSCs in der 6-Well-Platten kultiviert zu waschen.
    2. Aspirieren Sie 0,5 mM EDTA und 2 mL 0,5 mM EDTA pro Bohrloch mit Pipette. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 5 min.
    3. Aspirieren 0,5 mM EDTA und 1 mL hPSC Wartung Medium bei RT ergänzt mit 10 μM pro von Pipette gut Y-27632. Pipette vorsichtig, aber schnell zum Abblasen der angeschlossenen Zellen auf den Tellern und aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen zu trennen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.
    4. Übertragen die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL hPSC Wartung Medium bei RT mit 10 μM ergänzt Y-27632. Pipette vorsichtig die Zellsuspension.
    5. Zählen Sie die Anzahl von Zellen in der Zellsuspension mit dem Trypan blau Fleck-Ausschluss-Verfahren.
      1. Mix 15 μl Zellsuspension und 15 μl Trypan blau in einem Rohr.
      2. 10 μL der Zellsuspension verdünnt mit Trypan blau auf Zelle zählen Folien in zweifacher Ausfertigung mit einer 10 μl Pipette zu übertragen.
      3. Zählen Sie die Zelle Nummer mit einem automatischen Zelle Zähler zu und rechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension. Rentabilität ist in der Regel > 98 %.
    6. Aliquoten die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 1-1,5 x 106 Zellen pro Bohrloch des 6-Well-Platten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2).
    7. Zentrifugieren Sie die 50 mL-Tube mit 200 X g bei RT 5 min.
    8. Den Überstand mit einer Pipette abzusaugen und die Zellen mit 1 mL der Stufe 1A Medium (RT) pro Bohrloch Aufschwemmen. Sanft die Zellsuspension pipette und ein weiteres 1 mL Stufe 1A Medium (insgesamt, 2 mL pro Well).
    9. Aspirieren Sie die verdünnte Basalmembran Matrix in den Vertiefungen der die Zellplatten Kultur von einer 1.000 μl Pipette im Schritt 2.1.2 vorbereitet. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    10. Sanft pipette die Zellsuspension in Schritt 2.2.8 wieder. Sofort nach dem Mischen übertragen Sie die Zellsuspension (2 mL) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Abdeckplatte mit einer Alu-Folie auf die Platte vor Licht zu schützen. Legen Sie die Platte in den sauberen Werkbank bei RT für 10-15 min.
      Hinweis: Bewegen Sie die Platte nicht nach der Aussaat.
    11. Legen Sie die Platte vorsichtig in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator (feuchte Atmosphäre) und Kultur für 24 h.
      Hinweis: Schütteln Sie die Platte nicht nach der Aussaat.
  3. Induzieren Sie die Differenzierung in endgültige Entoderm (Stufe 1 b).
    1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS in die Vertiefungen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
      Hinweis: Um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage entfernen, schütteln Sie vorsichtig die Platte vor jedem Anspruch.
    2. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit einer Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in 37 °C Inkubator (feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 48 h.
    3. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
      Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen aus der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch.
    4. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 24 h.
  4. Induzieren Sie die Differenzierung in den primitiven Darm Rohr (Stufe 2).
    1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette.
      Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch.
    2. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 2 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 4 Tage.
  5. Induzieren die Differenzierung in PDX1+ Zellen (Stufe 3).
    1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
    2. Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 3 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 3 Tage.
  6. Die Differenzierung in endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse zu induzieren.
    1. Führen Sie NKX6.1+ Zelle Induktion (Stufe 4, für 8 Tage) gefolgt von endokrinen Zellen Induktion (Stufe 5, 12 Tage) mit den zuvor beschriebenen Protokolle3,16,26. Charakterisieren und die endokrine Zelldifferenzierung Immunostaining und quantitative Real-Time reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse zu überprüfen.
      Hinweis: Beziehen sich auf Toyoda Et Al.16 und Kimura Et Al.26 für detaillierte experimentelle Verfahren. Primer-Sequenzen für die qRT-PCR-Analyse finden Sie unter Tabelle 1 .

(3) Durchflusszytometrie (FCM)

  1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM EDTA zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Aspiration und Zugabe von 0,5 mM EDTA ein Mal.
    Hinweis: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen.
  2. Trennen der Zellen (ca. 3-6 × 106 pro Bohrloch), fügen Sie 2 mL von 0,25 % Trypsin mit 0,5 mM EDTA pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für ca. 5-10 min.
  3. Pipette vorsichtig, aber schnell zu distanzieren aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.
  4. Fügen Sie ca. 8-10 mL Basis Medium (RPMI 1640 oder iMEM, RT) mit 0,5 x serumfreien Ergänzung und 10 μM Y-27632 pro gut und mischen die Zellsuspension. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.
  6. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipette vorsichtig die Zellsuspension.
  7. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.
  8. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der Fixierung und Permeabilisierung Puffer pro 106 Zellen unter einer Haube. Pipette vorsichtig die Zellsuspension unter einer Haube. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.
  9. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT 5 min.
  10. Aspirieren des Überstands unter eine Haube und Aufschwemmen der Zellen mit 500 μL FCM blockiert Lösung pro 106 Zellen. Pipette vorsichtig die Zellsuspension. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.
  11. 50 μL der Zellsuspension auf ein Rohr (ca. 1 x 105 Zellen) übertragen. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM blockiert Lösung und inkubieren Sie bei 4 °C für > 16 h.
  12. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.
  13. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM Lösung blockiert. Inkubation der Zellen bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h mit Lichtschutz.
  14. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.
  15. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 180 μL von 2 % Esel Serum in DPBS.
  16. Filtern Sie die Zellsuspension durch Übertragung auf eine 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr mit einer Zelle Sieb (35 µm-Nylon-Mesh) und halten Sie bei 4 °C mit Schutz vor Licht bis die Analyse.
  17. Einen Teil der positiv gefärbten Zellen durch einen Flow Cytometer27zu analysieren.

4. Immunostaining

  1. Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
    Hinweis: Schütteln Sie die Platte, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen.
  2. Fügen Sie 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) (4 °C) pro Bohrloch mit Pipette unter einer Haube. Halten Sie die Platte bei 4 °C für 20 Minuten.
  3. Der PFA mit Pipette unter eine Haube zu entfernen. Geben Sie 2 mL des DPBS bei RT in der Pipette unter einer Haube. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
  4. Fügen Sie 2 mL der blockierenden Lösung pro Bohrloch und lassen für 30 min bei RT.
  5. Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. Inkubation bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h.
  6. Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 und 10 min. wiederholen das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation einmal bei RT inkubieren.
  7. Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. 60 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren.
  8. Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 (RT) und 5 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren. Wiederholen Sie das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation zwei Mal.
  9. Nehmen Sie Mikrographen, die Differenzierung Effizienz unter einem Fluoreszenz-Mikroskop-28zu untersuchen.

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Ergebnisse

Verbreitende HiPSCs (585A129,30) verdichten sich und bilden eine homogene Monolayer (Abbildung 1 b), die zur Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte HiPSCs (Stufe 0) sind getrennt und neu ausgesät als Einzelzellen bei niedrigen Zelldichten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2). Innerhalb von 1 h die Zellen sind an der Platte befestigt und zu Vorsprung zu zeigen beginnen. Am 1. Tag werden die Zellen stark vermehrt und ...

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Diskussion

Die Generation der PDX1+ Zellen besteht aus mehreren Schritten; Daher ist es wichtig, Zellen zu gegebener Zeit zu behandeln. Unter den Schritten der Induktion Effizienz der endgültigen Entoderm wirkt sich weitgehend auf die endgültige Induktion Effizienz, möglicherweise durch Interferenzen von anderen kontaminierenden Abstammung-Zellen (d. h. Mesoderm und Ektoderm), die vermehren sich und/oder absondern können Faktoren, die die spezifische Differenzierung zu stören. Wenn der Anteil der SOX17+ Zellen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch die Finanzierung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) durch Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 und 18 K 08510) t.t. und Beihilfe für JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant-Nummer 17J07622), a.k., und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) durch seine Forschung gewähren "Core Center für iPS Zellforschung, Research Center-Netzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin" K.O. Die Autoren danken Dr. Peter Karagiannis für das Manuskript zu lesen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopaminToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoeSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenThermo Fisher Scientific339652
Anti-CDX2 Antikörper [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, &mal 1/1000 Verdünnung
B-27 Ergänzung (50 &mal;)Thermo Fisher Scientific17504-044Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel
BD FACSAria II ZellsortiererBD BiosciencesFür die Durchflusszytometrie
Biomedizinischer GefrierschrankSANYOMDF-U538Für -30 ° C Lagerung
Objektträger für die Zellzählung für TC10/TC20 Zellzähler, ZweikammerBIO-RAD1450011Zählobjektträger
Glas ZELLKULTUR MULTIWELL-PLATTE, 6 WELL, PS, KLARGreiner bio-one657165Für Differenzierungskulturen/6-Well-Platte
ZentrifugeTOMYAX-310Für die Zellkultivierung
ZentrifugeTOMYMX-305Für RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRVClean
bench Corning CellBIND 6-Well-PlatteCorning3335Für die feederfreie Kultur von hPSCs/6-Well-Platte
Corning Matrigel Basalmembran-Matrix-Wachstumsfaktor reduziertCorning354230Basalmembran-Matrix
Corning Synthemax II-SC SubstratCorning3535Für die feederfreie Kultur von hPSCs/synthetischem Oberflächenmaterial für hPSCs
KryostatLeicaLeica CM1510 SZur Immunfärbung von Aggregaten.
Cytofix/Cytoperm KitBecton Dickinson554714Perm/Wash Puffer ist  Permeabilisierung/Waschpuffer. Cytofix/Cytoperm-Puffer ist ein Fixierungs- und Permeabilisierungspuffer.
Dako PenDakoS2002Für die Immunfärbung von Aggregaten
dNTP-Mix (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Für RT-qPCR
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Sekundärantikörper, × 1/500 Verdünnung
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Sekundärantikörper, × 1/500 Verdünnung
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Sekundärantikörper, × 1/500 Verdünnung
Esel SerumMerck MilliporeS30Esel Serum
D-PBS(-) ohne Ca oder MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Für die Feeder-freie Kultivierung von hPSCs/hPSC-Erhaltungsmedium
Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb SchnappkappeCorning3522355 mL Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und Zellsieb
Filterspitze, 1.000 & micro; LWatoson124-1000SVerwendung zusammen mit Pipetten
Filterspitze, 20 & Mikro; LWatoson124-P20SVerwendung zusammen mit Pipetten
Filterspitze, 200 & Mikro; LWatoson124-P200SVerwendung zusammen mit Pipetten
FluoreszenzmikroskopKeyenceBZ-X700Für die Immunfärbung
Forma Steri-Cycle CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific370AInkubator
HNF-1β Antikörper (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, × 1/200 Verdünnung
HNF-4α Antikörper (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, &mal 1/200 Verdünnung
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Für die Zellkernfärbung, &mal 1/200 Verdünnung
Menschliche Bauchspeicheldrüse Gesamt-RNAAmbion AM7954Für RT-qPCR
Humane PDX-1/IPF1 AntikörperR& D SystemsAF2419Anti-PDX1, Ziegen-IgG, × 1/200 Verdünnung
Humane SOX17 AntikörperR& D SystemsAF1924Anti-SOX17, × 1/200 Verdünnung
Verbessertes MEM Zink Option MediumThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
InkubationskammerCosmo Bio10DOFür die Immunfärbung von Aggregaten
Latex UntersuchungshandschuheAdachi
MAS beschichtetes ObjektträgerglasMatsunami Glas83-1881Für Immunfärbung von Aggregaten
MicroAmp Fast 96-Well-ReaktionsplatteApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907Für RT-qPCR-Mikroskop
OlympusCKX41N-31PHPFür die Zellkultivierung
Microtube Watoson131-515CS
Monoklonales Anti-Α-FetoproteinSIGMAA8452Anti-AFP, × 1/200 Verdünnung
Nanodrop 8000Thermo Fisher Scientificfür RT-qPCR
Oligo dTFASMACMaßgeschneidertes OligoFür die RT-qPCR ist die Sequenz "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyd, PulverNacalai tesque26126-54PFA, Fixiermittel, verdünnt in DPBS
Pharmazeutischer KühlschrankSANYOMPR-514Für 4 ° C Lagerung
von PIPETMAN P GILSONPipette
Rekombinante humane KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Rekombinant Mensch NogginPeproTech120-10CNOGGIN
Rekombinant Mensch/Maus/Ratte Aktivin AR& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101Für RT-qPCR
RNase-freies DNase-Set (50)QIAGEN79254Für RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Für RT-qPCR
RPMI 1640 mit L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Versiegelungsfolie für EchtzeitTakaraNJ500Für serologische RT-qPCR-Pipetten
10 mLCostar/Corning4488Für die Zellkultivierung
Serologische Pipetten 25 mLCostar/Corning4489Für die Zellkultivierung
Serologische Pipetten 5mL Costar/Corning4487Für die Zellkultivierung
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbZellsignalisierung3579SAnti-SOX2, × 1/200 Verdünnung
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher Wissenschaftlichfür RT-qPCR
SaccharoseNacalai tesque30406-25Für die Immunfärbung von Aggregaten
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Referenzen

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