Summary
هنا، نحن تصف تنظيم دورات تعريفية للمتلازمة الكلوية التجريبية في الفئران 129S1/سفيمج بالحقن السريع خلف المقلة من ميتوتريكسات. نحن أيضا علاج الفئران الكلوية مع الإفراج المطرد الكريات المحتوية على aprotinin تكبح النشاط حوزتي سيرين البولية ومنع الاحتفاظ بالصوديوم.
Abstract
المتلازمة الكلوية هو المظهر الأكثر تطرفاً لأمراض الكلي بروتينوريك وتميزت بروتينية ثقيلة وطفيفا وذمة بسبب الاحتفاظ بالصوديوم والدهون. دراسة الفسيولوجيا المرضية لهذه المتلازمة، القوارض ووضعت نماذج استناداً إلى حقن المواد السامة مثل ميتوتريكسات مما تسبب في أضرار بودوسيتي. في الفئران، إلا بعض سلالات معرضة لهذا النموذج. في wildtype 129S1/سفيمج الفئران، يدفع إدارة ميتوتريكسات بالحقن الوريدي السريع للجيوب الأنفية خلف المقلة المتلازمة الكلوية التجريبية أن ميزات كل أعراض الأمراض البشرية بما في ذلك الاحتفاظ بالصوديوم وذمة. بعد ظهور بيله، معرض الفئران زيادة النشاط حوزتي سيرين البول الذي يؤدي إلى تفعيل قناة الصوديوم الظهارية (ايناك) والاحتفاظ بالصوديوم. يلغي تنشيط ايناك الدوائي تثبيط البروتياز سيرين البولي بالمعاملة مع aprotinin الإفراج المطرد ويمنع الاحتفاظ بالصوديوم. هذا النموذج مثالي لدراسة الفسيولوجيا المرضية بروتيسوريا، أي.، إفراز البروتياز سيرين النشطة التي تسبب تنشيط ايناك proteolysis γ-فرعية لها. وهذا يمكن اعتبار الآلية الرئيسية للتنشيط ايناك والاحتفاظ بالصوديوم في أمراض الكلي بروتينوريك.
Introduction
المتلازمة الكلوية يتصف بروتينية ثقيلة، طفيفا، وذمة والدهون، ويمكن أن تعتبر أشد مظاهر أمراض الكلي بروتينوريك. في القوارض، يمكن أن يتسبب المتلازمة الكلوية التجريبية بحقنه واحدة من أنثراسيكلينيس أو بوروميسين مما يؤدي إلى الأضرار بودوسيتي وتمثل الأمراض البشرية سوى تغيير طفيف والتنسيق القطاعي glomerulosclerosis (FSGS)1. وبعد الوصف الأولى في عام 1955 فرينك وآخرون. 2، بوروميسين نوكليوزيد كلاء (PAN) بالنسبة للفئران قد أصبح نموذج قياسي للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للمتلازمة الكلوية في عدة دراسات3،4،،من56. في الفئران، يمكن فعل هذا النموذج المطابق ميتوتريكسات انثراسيكلين7. ومع ذلك، هناك سلالة قوية-تبعية التي تتحدد وراثيا المكاني الوراثية اثنين على الأقل8. وبالإضافة إلى ذلك، هناك اختلافات في الاستجابة بروتينوريك ودورة9،المتلازمة الكلوية10. استخدام الفئران 129S1/سفيمج والحقن الوريدي السريع من ميتوتريكسات عن طريق الجيوب الأنفية خلف المقلة، التوصل إلى استجابات بروتينية القيم التي تكفي للحث على الميزات النموذجية متلازمة الكلوية، ولا سيما حجم الاحتفاظ تتميز استسقاء والبول خالية من الصوديوم حوالي7. الاحتفاظ بالصوديوم في المتلازمة الكلوية التجريبية قد تم يفترض أن يكون نتيجة لتنشيط قناة الصوديوم الظهارية (ايناك) في أنبوب القاصي من البروتياز سيرين أبيرانتلي المصفاة مثل لازمين تسبب proteolysis به γ فرعية4 ،،من1112. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت هذا المفهوم في الفئران الكلوية الذي يحميها من proteolytic ايناك التنشيط والاحتفاظ بالصوديوم في المعاملة مع أبروتينين مثبط البروتياز سيرين التي كانت على نفس القدر من الفعالية كال amiloride مانع ايناك13. لضمان تسليم المستمر إلى أنبوب القاصي، تدار أبروتينين عن طريق الكريات الإفراج المطرد مزروع تحت الجلد. الدراسات المستقبلية المطلوبة لتحديد البروتياز سيرين التي المسؤولة عن التنشيط ايناك proteolytic في المتلازمة الكلوية التي يعتقد أن موازية للحالة البشرية. لهذا الغرض، هو فعل ميتوتريكسات المتلازمة الكلوية نموذج قيمة التي يمكن أن تستخدم في الفئران البرية من نوع أو توسيع للفئران المهندسة وراثيا. وتشمل مزاياها منخفضة التكلفة من المخدرات وأقل تعقيد الإدارة وإمكانية تكرار نتائج جيدة14.
في هذه المقالة، نبدي التعريفي للمتلازمة الكلوية التجريبية بالحقن الوريدي السريع من ميتوتريكسات إلى الجيوب الأنفية خلف المقلة وغرس الكريات الإفراج المستدام الذي يحتوي على أبروتينين تمنع حوزتي سيرين البولي النشاط كما تقاس مقايسة اللونية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الأساليب وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والقانون الألماني لرعاية الحيوانات، والتي وافق عليها السلطات المحلية (توبنغن Regierungspräsidium).
1-تنظيم دورات تعريفية للمتلازمة الكلوية التجريبية بحقن ميتوتريكسات إلى الجيوب الأنفية خلف المقلة
- تحضير حقنه 0.5 مل مع قنية ز 30 محملة بمناسبة موضع التوقف للمكبس.
- حساب حجم الحقن من ميتوتريكسات للذكور (7.25 ميليلتر/غرام وزن الجسم (وزن الجسم) يساوي 14.5 ميكروغرام/غرام وزن الجسم ميتوتريكسات) والفئران الإناث (6.9 ميليلتر/غرام وزن الجسم يعادل 13.8 ميكروغرام/غرام وزن الجسم ميتوتريكسات) استناداً إلى وزن الجسم من الصباح.
ملاحظة: الجرعة المعطاة المناسبة لتحريض المتلازمة الكلوية. تغييرات طفيفة في الجرعة تؤدي إلى مسار مختلف حاسمة لحدوث الوصول إلى من أمراض الكلي المزمنة معتدلة مع تغييرات طفيفة فقط في معدل الترشيح الكبيبي (12.6 ميكروغرام/غرام وزن الجسم ميتوتريكسات) إلى فشل كلوي حاد (15.4 ميكروغرام/غرام وزن الجسم ميتوتريكسات)7، 15. - الحارة المبلغ المحسوب لحل ميتوتريكسات (2 ميكروغرام/ميليلتر) في غرفة دافئة 37 درجة مئوية.
تنبيه: ميتوتريكسات ضار إذا ابتلع ويمكن أن يسبب السرطان. دائماً ارتداء قفازات إذا كان يعمل مع ميتوتريكسات، وتجنب أي تماس الجلد. - بريفيل المحاقن مع الحل ميتوتريكسات حتى نقطة الوسم وضبط التوازن إلى الصفر. ملء المحاقن مع حجم الحقن وفحص وحدة التخزين التي تزن المحاقن.
- ناركوتيزي الماوس عميق مع المجلد 5% إيسوفلوراني باستخدام المرذاذ وتدفق الأوكسجين 2 لتر في الدقيقة.
- لا تستخدم مرهم على العيون قبل الحقن. المشغل يحتاج إلى رؤية واضحة تجويف المداري للقيام حقن خلف المقلة آمنة وناجحة.
- تقييم مستوى التخدير بدواسة العاكسة وضبط مخدر التسليم إذا لزم الأمر قبل البدء بالحقن.
- ضع الماوس في ريكومبينسي حق أفقي مع ظهرها التي تواجه الهيئة للمشغل ورئيسها التي تواجه اليد حقن للمشغل.
ملاحظة: هو وصف الإجراء لشخص اليد اليمنى، أعسر الأشخاص الذين يقومون بالحقن مع اليد اليسرى من الأسهل القيام بالموقف وترك الحقن عكس الحق. - نتا مقلة العين اليسرى للماوس من محجر العين بعناية عن طريق تطبيق ضغط لطيف للجلد، والظهري والبطني للعين.
- ثقب الجيب الأيسر خلف المقلة من زاوية العين الداخلية (كوميسوري بالبيبرال الآنسي). تجنب أي اتصال مع مقلة العين mouse´s.
- قليلاً إمالة المحاقن وحقن وحدة التخزين بأكملها دفعة واحدة. تأكد من أن وحدة التخزين يتم حقن دون أي مقاومة، ودون أي علامات للتسرب مثل اكسوبثالموس أو التسرب من موقع الحقن.
- منذ ميتوتريكسات مادة شديدة سمية، تحقق الرفاه على الأقل مرة واحدة في يوم باستخدام ورقة نقاط حسب مورتون وغريفيث et al. 16 والأجور اهتماما خاصا للحقن. إذا أي علامات للتسرب مثل اكسوبثالموس، مثل إغلاق الجفن البصر أو أي علامات نخر occure آفات تورم أو الجلد بعد الحقن أو في الأيام التالية، ينبغي أن تكون euthanized الماوس.
2-غرس الكريات الإفراج المستدام التي تحتوي على أبروتينين
- ترتيب الكريات مع الجرعة المطلوبة لمدة يوم والإفراج في وقت مبكر. في حالة أبروتينين، اختر جرعة 1 ملغ يوميا الإفراج عن أكثر من 10 أيام.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تتضمن الكريات aprotinin بجرعة 10 ملغ.- تخزين الكريات تحت الظروف الجافة، وتجنب أي تعرض للرطوبة.
- تحضير العناصر اللازمة لعملية جراحية، بما في ذلك مقص الشعر والجلد إعداد مقص، مشرط، الملقط الجراحي، واثنين من أزواج من ملاقط الأنسجة، حامل الإبرة و 15 سم مونوفيلي خياطة ريسوربابل.
- تعقيم الأدوات استخدام التعقيم حرارة لمدة 5 دقائق في 240 درجة مئوية. قبل استخدام الصكوك، انتظر لمدة 5 دقائق حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
- تجنب أي اتصال من نصائح صك معقم للأسطح نونستيريلي.
- تجنب حرق الجلد بأدوات ساخنة.
- تعقيم الأدوات استخدام التعقيم حرارة لمدة 5 دقائق في 240 درجة مئوية. قبل استخدام الصكوك، انتظر لمدة 5 دقائق حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
- ناركوتيزي الماوس مع إيسوفلوراني المجلد 5% تليها 1.5% المجلد باستخدام تدفق المبخر والأكسجين 2 لتر في الدقيقة.
- ضع الماوس في وضع عرضه على جهاز الاحترار مغطاة بطبقة من الشاش لتجنب الإصابات الحرارية للماوس. درجة الحرارة السطحية حوالي 37 درجة مئوية.
- حماية العينين مع مرهم.
- إزالة الشعر في الوسط مرة أخرى في منطقة حول 0.5 سم2 باستخدام مقص أو المتقلب شعر وتطهير البشرة أصلع بمطهر مناسب لتطهير الجلد. إزالة الشعر أقل قدر الإمكان ولذا فإنه يبقى أكثر صعوبة للماوس للوصول إلى الجرح وينتهي الموضوع في وقت لاحق، والحفاظ على درجة حرارة الجسم.
- جداً الجلد أصلع مع مشرط في اتجاه cranio والذيلية بطول من حوالي 5 مم-تحضير حقيبة جانبي الأيسر حوالي 1 سم عمق في النسيج الضام تحت الجلد باستخدام إعداد غير حادة.
- تقييم مستوى التخدير بدواسة العاكسة وضبط مخدر التسليم إذا لزم الأمر قبل البدء بعملية جراحية.
- إدراج واحد الإفراج عن 10 أيام بيليه في استعداد الحقيبة الجانبي الأيسر استخدام الملقط الأنسجة عقيمة. اترك بيليه في أسفل الحقيبة في وضع مستو.
- تجنب أي اتصال من بيليه للسوائل والرطوبة حتى توضع في الحقيبة المعدة.
- إغلاق الجلد بخيوط 2-3. ترك نهايات الخيط قصيرة جداً لجعلها أكثر صعوبة للماوس لفتح خياطة الجروح التي تلتهم فقط.
- ضع الفئران على حدة لتقليل المعاناة بعد العملية الجراحية ومنع فتح خياطة الجروح التي تلتهم. الاحتفاظ الماوس في العرض حتى قد وعيه كافية بعد التخدير.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لإدارة الألم بعد العمل الجراحي نظراً لهذا التدخل هو جيد التحمل دون أي علامات عدم الراحة أو الألم. وبدلاً من ذلك نوصي بالمسكنات الموضعية، مثل قطره بوبيفاكيني على الشق قبل الإغلاق الذي سيوفر ما يصل إلى 8 س تسكين.
3-تقييم للتعريف النموذجي وعلامات المتلازمة الكلوية ورفاه
- جمع البول صباح اليوم (08:00 ص) إلى رد فعل كوب (1.5 مل) كل يوم من يوم الحقن بتلفيق المثانة.
- قياس البيلة باستخدام مقايسة البروتين برادفورد وتطبيع إلى كرياتينين.
ملاحظة: لتحريض المتلازمة الكلوية، بروتينية ينبغي الوصول إلى مشارف كرياتينين مجم 120 بين 7 و 10 يوم بعد حقن ميتوتريكسات.
- قياس البيلة باستخدام مقايسة البروتين برادفورد وتطبيع إلى كرياتينين.
- ابحث عن تطوير استسقاء. التحقق من وجود زيادة في محيط البطن أو سطوح السفوح المتدلية.
- وزن الماوس والكريات الطعام وزجاجة مياه الشرب في الصباح (08:00 ص) كل يوم.
- تحقق الرفاه على الأقل مرة واحدة في يوم باستخدام ورقة نقاط حسب مورتون وغريفيث وآخرون. 16
4-قياس حوزتي سيرين البولية مع مقايسة اللونية
- تعد الركيزة العامل الحل عن طريق إضافة 15 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) باستخدام زجاجة من 25 ملغ الركازة اللونية ليوفيليسيد S-2251، مما أسفر عن تركيز من 2 مم. حل أبروتينين في برنامج تلفزيوني للحصول على حل aprotinin بتركيز من 2 ملغ/مل.
- المتجر أعد الحلول عند-20 درجة مئوية. وهذا يبطئ إلى حد كبير السيارات-تدهور S-2251. عدم استخدام الحلول القديمة مع قوي ظل الأصفر.
- استخدم الحل العامل الركازة المعدة، طازجة أو المذابة والحارة أنه في غرفة حرارة 37 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد عينات البول في درجة حرارة الغرفة.
- منع تدهور حوزتي بتجنب تكرار ذوبان الجليد وتجميد. تخزين عينات البول من-20 درجة مئوية.
- استخدام لوح ميكروويل 96 مناسبة لقياس الضوء. إضافة 3 ميليلتر من البول غير مخفف في كل من بئرين وإضافة 50 ميليلتر من الركازة العامل الحل مع 3 ميليلتر من حل برنامج تلفزيوني أو أبروتينين للآبار. وتغطي اللوحة مع السدادة لوحة.
- احتضان لوحة مغطاة ميكروويل لمدة 60 دقيقة في غرفة حرارة 37 درجة مئوية.
- قياس الكثافة الضوئية لكل بئر في 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
- أن الفرق بين OD دون aprotinin ومع أبروتينين كنشاط البروتياز البولي aprotinin تراعي سيرين.
ملاحظة: قياس العينة المزدوجة مع أو بدون أبروتينين يزيد خصوصية الفحص حيث يمكن أيضا أن يكون المشقوق الركيزة من البروتياز الأخرى التي لا تقوم دور الفيزيولوجية المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد إدخال الخدر isoflurane، تم حقن ميتوتريكسات سريعاً عن طريق الجيوب الأنفية اليسرى خلف المقلة. وحدة التخزين بأكملها 7.25 ميليلتر/غرام وزن الجسم تم حقن دون أي مقاومة والتسرب تثبت تصحيح موقع القنية الحقن الوريدي. تعافي من الخدر سرعة الماوس وكان عدم الإخلال في ذلك اليوم، وبعد ذلك. خاصة، لا توجد أي إشارة للضرر في العين اليسرى. بعد ميتوتريكسات الحقن والمواد الغذائية والسوائل المدخول انخفض على مدى 3 أيام الأولى بسبب تأثير سمية عامة من ميتوتريكسات واستردادها بعد ذلك (الشكل 1a). وخلال أول 3 أيام بعد الحقن، فقدت الماوس 3.4 في المائة وزن الجسم سبب إينابيتينسي (الشكل 1b). اعتبارا من اليومال 5، وضع الماوس بروتينية ملحوظ (الشكل 1 ج) الذي أعقب انخفاض ضخمة من إفراز الصوديوم البولي رغم تناول الطعام الكافي (الشكل 1 أ، ب). هذا استبقاء الصوديوم يؤدي إلى مكسب ضخمة من وزن الجسم بنسبة 22.2 في المائة من يوم 3 حتى يوم 10 وكان مصحوبا باستسقاء. نتيجة بروتينية، الماوس نمواً طفيفا (الشكل 1 ج). في عينة بلازما في اليوم 10، كان الدهون المرئية. وتوضح هذه البيانات أن يستحث ميتوتريكسات قدمها الجيوب الأنفية خلف المقلة سريع ومثير للإعجاب متلازمة الكلوية كاملة في الفئران 129S1/سفيمج wildtype.
الاحتفاظ بالصوديوم في المتلازمة الكلوية التجريبية مرتبطاً بتفعيل ايناك عن طريق الترشيح الشاذة من البروتياز سيرين مثل لازمين11،12. إذا كان هذا المفهوم صحيحاً، ينبغي حماية تثبيط البروتياز سيرين البولية التي أبروتينين من ايناك التنشيط والاحتفاظ بالصوديوم. دراسة تأثير أبروتينين على تنشيط ايناك ونعامل ماوس الكلوية مع أبروتينين. كما يتم مسح aprotinin سريعاً عن طريق الترشيح الكبيبي، اخترنا إدارة المخدرات باستخدام بيليه الإفراج المستدام لضمان استمرار توافر aprotinin في أنبوب القاصي أكثر من 10 أيام. اليوم الثالث بعد الحقن ميتوتريكسات، كان مزروع ماوس واحدة مع بيليه المحتوية على أبروتينين وتلقى ماوس تحكم بيليه غفل تحت التخدير إيسوفلوراني. الحيوانات سرعة تعافي الخدر النموذج والجرح تلتئم دون أي مشاكل. ابتداء من اليوم 5، وضعت بروتينية في كلا الفئران بدرجة مماثلة (الشكل 2a). ومع ذلك، شهدت فقط التعامل مع الغفل الكلوية الفئران استبقاء الصوديوم (الشكل 2) وزيادة الوزن الجسم (الشكل 2 ج) تشير إلى تفعيل ايناك. وفي المقابل، الماوس تعامل aprotinin محمي من الاحتفاظ بالصوديوم وكسب وزن الجسم (الشكل 2، ج). وهذا يبين بوضوح أن نشاط البروتياز سيرين البولية هو السبب للاحتفاظ بالصوديوم في المتلازمة الكلوية.
تم قياس تركيز aprotinin المحرز في البلازما والبول مع أليسا. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، تركيز aprotinin البولية بلغت ذروتها بعد غرس وكانت مستمرة بعد ذلك. يعني كان تركيز aprotinin البولية 207 ± 29 ميكروغرام/مل (32 ± 4 ميكرومتر) في حين كان تركيز البلازما aprotinin بعد 10 أيام علاج 13 ميكروغرام/مل (2 ميكرومتر)، ومماثل لتركيز البلازما يتحقق في معاملة aprotinin المرضى17. تم قياس تأثير أبروتينين على نشاط البروتياز سيرين البولية مع مقايسة اللونية استخدام عينات البول خلال سير المتلازمة الكلوية التجريبية. ويستند هذا التحليل على التحلل المائي للسندات ببتيد في الركيزة الإفراج عن نيتروانيليني ف يمكن الكشف عنها بسهولة بقياس الضوء في 450 نانومتر. سيرين حوزتي النشاط كما هو موضح في الشكل 3، زيادة سريعة في البول من الماوس الكلوية تعامل الغفل موازاة بداية بروتينية. على النقيض من ذلك، تماما تحول دون نشاط البروتياز سيرين البولية في الماوس الكلوية تعامل aprotinin الذي تزامن مع منع التنشيط ايناك واستبقاء الصوديوم هو مبين في الشكل 2، ج.
رقم 1: بالطبع لتناول الطعام والسوائل (أ) والصوديوم البولي الإفراز والجسم الوزن (ب) وتركيز الزلال بروتينية والبلازما (ج) قبل وبعد تنصيب المتلازمة الكلوية التجريبية. وبعد هبوط في الغذاء وتناول السوائل خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد ميتوتريكسات، تظهر الفئران كمية ثابتة تقريبا. بعد خمسة أيام، يبدأ تطوير بروتينية ويصل إلى عتبة الكلوية بين 7 و 10، مما يؤدي إلى متلازمة الكلوية كاملة مع تشكيل ذمة والاحتفاظ بالصوديوم وطفيفا اليوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: دورة بروتينية (أ) وإفراز الصوديوم البولي (ب) ووزن الجسم (ج) في ماوس تعامل كل منهما مع بيليه aprotinin أو الغفل في اليوم الثالث بعد الحقن ميتوتريكسات. وعلى الرغم من تطوير بروتينية في درجة مماثلة يحمي aprotinin تشكيل الاستبقاء وذمة الصوديوم الناجم عن تفعيل ايناك خلال المتلازمة الكلوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: بالطبع من تركيز aprotinin البولية بعد زرع بيليه مع تركيز البلازما aprotinin. دورة النشاط حوزتي سيرين البولية تقاس بمقايسة اللونية هو موضح في الخطوة 4. تركيز أبروتينين البولية قمم قريبا بعد غرس وهو ثابت بعد ذلك. سيرين مبطلات النشاط الزيادات السريعة في البول خلال المتلازمة الكلوية، موازاة بداية بروتينية. Aprotinin في فيفو يمنع ضد الزيادة في نشاط البروتياز سيرين المسالك البولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، علينا أن نظهر أن حقن ميتوتريكسات عبر حقن الجيوب الأنفية خلف المقلة يستحث المتلازمة الكلوية التجريبية في الفئران 129S1/سفيمج مع بيله، والاحتفاظ بالصوديوم، هيبوالبومينيا والدهون. ومع ذلك، هناك اثنين من القضايا الحرجة التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند استخدام هذا النموذج. أولاً، التعريف النموذجي هو دقة الجرعة تعتمد والانحرافات من ميتوتريكسات جرعة صغيرة مثل 0.3 ميكروغرام/غرام تؤثر على استجابة الفئران15. عند حقنه بجرعة أقل مثل 14 ميكروغرام/غرام وزن الجسم أو أدناه، يسبب ميتوتريكسات بروتينية غير الكلوية إلا أن لم يقترن بالاحتفاظ بالصوديوم العلني والاستسقاء والدهون. وفي المقابل، حقن جرعة أعلى يؤدي إلى الفشل الكلوي الحاد وارتفاع معدل الوفيات الحاد. وفقا للجرعة والاستجابة للفئران، معدل ميتوتريكسات الأسباب بطبيعة الحال تشبه الإصابة البشرية الكلي الحاد (أكي)، أمراض الكلي المزمنة مع الحفاظ على الترشيح الكبيبي (كد المرحلة G1-3) أو أمراض الكلي المزمنة التدريجي مع انخفاض معدل الترشيح الكبيبي (كد G4-5) مما يؤدي إلى أورميا7،15.
وثانيا، هذا النموذج يقتصر على بعض سلالات الماوس وسلالة C57Bl/6 المستخدمة على نطاق واسع هو مقاومة8. وعلاوة على ذلك، تلوث الوراثية كما أنها قد تكون موجودة خلال باككروس قد يؤدي إلى نسبة استجابة أقل بكثير. وهذا يمكن تجنبها إلى حد ما بزيادة جرعة ميتوتريكسات. بيد أن جرعة ميتوتريكسات تستخدم لتحريض النموذجي (14.5 ميكروغرام/غرام وزن الجسم) هو الفعل قريبة من LD50 وصف بين 15-17 ميكروغرام/غرام وزن الجسم في هذا سلالة7،18.
استخدام هذا النموذج الماوس يفتح إمكانية دراسة مختلف المسائل مبتكرة للغاية فيما يتعلق بالمتلازمة الكلوية، وصلت من تشكيل بروتينية وذمة ديسريجولاتيونس الصماوي وفقر الدم الكلوي15. وبهذا المعني، حدوث فعل ميتوتريكسات يغطي طائفة واسعة من كد البشرية والبحوث بديلاً جيدا للنماذج الحالية المستخدمة في أمراض مثل 5/6 استئصال19،20 أو ربط الحالب الانفرادية21. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لتطبيق هذا النموذج على الفئران المهندسة وراثيا لدراسة دور مورثة معينة من الاهتمام خلال النموذج مثل عدم وجود كيناز المصل وجلوكوكورتيكويد 1 (SGK1)7 أو العديد من الآخرين.
ميزة خاصة للنموذج المقدم هو حدوث بروتيسوريا، أي.، إفراز البروتياز سيرين النشطة التي تسبب تنشيط ايناك proteolysis γ-فرعية لها. وهذا يؤدي إلى إفراز خالية تقريبا من الصوديوم البول وحجم الاحتفاظ تتسم بزيادة الوزن الجسم السريع والتنمية استسقاء بعد ظهور بروتيسوريا. ومع ذلك، هذه الظاهرة عابر، وبعد 15 يوما، الفئران عفويا فضفاضة الاستسقاء والوزن على الرغم من استمرار البيلة. والسبب، ومع ذلك، لا يزال بعيد المنال. ولوحظ أيضا في دراسات الفئران الكلوية4 هذا السلوك المتناقض ويبدو أنه يمثل سمة عامة للمتلازمة الكلوية التجريبية في القوارض.
تم قياس النشاط حوزتي سيرين البولية مع مقايسة اللونية بسيطة وسريعة. ويستند على التحلل المائي للسندات أميد من فنيتروانيليني مرتبطة تيد طول 4 الأحماض الأمينية التي يمكن المشقوق من البروتياز المختلفة. عموما، ليست محددة حوزتي بعض ركائز اللونية وهناك تداخل كبير بين البروتياز التي تهزم الركازة خاصة. الركازة المستخدمة هنا ركيزة مفضل من البروتياز سيرين مثل التربسين مثل كاليكرين البلازما أو لازمين22. لزيادة الدقة، ينبغي أن تحدد نشاط حوزتي دائماً من عينة مقترنة مع أو بدون مثبطات23،24. في هذه الدراسة، استخدمت أبروتينين لتحديد نشاط البروتياز سيرين مثل التربسين. عن طريق حساب النشاط aprotinin الحساسة من الفرق، يتم إلغاء أنشطة أخرى البروتياز. في الماوس الكلوية تعامل مع أبروتينين الحية، كان لا زيادة النشاط مبطلات سيرين البولية والأهم تزامنت مع إلغاء الاحتفاظ بالصوديوم. وهكذا، سيرين البولية حوزتي النشاط ليس فقط المسببة للاحتفاظ بالصوديوم في المتلازمة الكلوية، بل يمكن أيضا أن يعتبر النهج القائم العلامات البيولوجية للتنبؤ بمدى فعالية مثبط البروتياز سيرين في المتلازمة الكلوية، الذي قد يصبح علاجية جديدة في علاج المتلازمة الكلوية. في دراسة أجراها بوهنيرت وآخرون. 13، سيرين حوزتي مثبط كاموستات والبلاسمينوجين التحويل المانع الترانيكساميك الحامض لم تكن فعالة في منع استبقاء الصوديوم الذي تزامن مع عدم تطبيع نشاط البروتياز سيرين البولية.
على الرغم من ميتوتريكسات مادة شديدة سمية، يتم حقن خلف المقلة آمنة ولا يرتبط بأي أذى من شأنه أن يمس رفاه الحيوان. يمكن القول بأن حقن الوريد ذيل نهجاً أكثر ملاءمة خفض الشدة الحيوان. في دراسة مقارنة، وجدنا أن الاستقراء عن طريق حقن الوريد الذيل من ميتوتريكسات كان أدنى من الطريق خلف المقلة بسبب معدل أعلى من الفئران التي لم تتطور المتلازمة الكلوية (34% غير-المستجيب) مقارنة بتلك التي تحدثها (الطريق خلف المقلة 0-15% عدم الرد). وباﻹضافة إلى ذلك، بيله بحقن الوريد الذيل كان أقل مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالصوديوم الموهن. يمكن تفسير ذلك بالاختلافات في الدوائية وتركيز ذروة أعلى من ميتوتريكسات حقق بعد حقن خلف المقلة السريع ضروري لتحريض النموذجي بالضرر بودوسيتي. بيد أنه يجب التأكيد على أن الحقن خلف المقلة يحتاج عامل درجة عالية من المهارة والخبرة لتجنب المضاعفات المتصلة بالتسرب مبالغ حتى اللحظة من ميتوتريكسات.
وفي الختام، المتلازمة الكلوية التجريبية من ميتوتريكسات هو نموذج متعدد الاستخدامات لأمراض الكلي بروتينوريك في الفئران 129S1/سفيمج الذي يسمح بالتحقيق في المسائل العلمية العالية الحالية، والأهم من بروتيسوريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة على منحة من "مؤسسة البحوث الألمانية" (DFG، ع 1092/2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
