Methodenartikel

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

DOI:

10.3791/57646

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11. November 2018

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1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5'-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.

Zusammenfassung

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Die Rho-GTPase Familie gehört zu den Ras-Superfamilie und umfasst rund 20 Mitglieder in den Menschen. Rho-GTPasen sind wichtig bei der Regulation des diverse zelluläre Funktionen, einschließlich Zellskelett Dynamik, Zelle Motilität Zellpolarität, axonalen Beratung, vesikuläre Menschenhandel und Zellzyklus-Kontrolle. Änderungen bei der Signalisierung Rho GTPase spielen eine wichtige regulatorische Rolle in vielen pathologischen Bedingungen, wie Krebs, Erkrankungen des zentralen Nervensystems und Immunsystem-abhängigen Krankheiten. Die posttranslationale Modifikation der Rho-GTPasen (d.h. Prenylation von Mevalonat Weg Zwischenprodukte) und GTP-Bindung sind wichtige Faktoren, die die Aktivierung dieses Proteins beeinflussen. In diesem Beitrag werden zwei wesentliche und einfache Methoden bereitgestellt, um eine breite Palette von Rho GTPase Prenylation und GTP-Bindung-Aktivitäten zu erkennen. Details der technischen Verfahren, die verwendet wurden erklärt Schritt für Schritt in diesem Manuskript.

Einleitung

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Rho-GTPasen sind eine Gruppe von kleinen Proteine (21-25 kDa), die sind gut im Laufe der Evolution konserviert, und bilden eine einzigartige Unterfamilie in der Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. In jeder Unterfamilie innerhalb dieser Überfamilie gibt es ein gemeinsame G Domäne-Kern, der die GTPase-Aktivität und Nukleotid Exchange1beteiligt ist. Der Unterschied zwischen der Rho-Familie und den anderen Unterfamilien der Ras ist das Vorhandensein einer "Rho einfügen Domäne" innerhalb der 5th -β-Strang und die 4th -α-Helix in die kleine GTPase Domäne2.

Aufgrund der aktuellen Klassifizierung, Rho-GTPasen gelten eine Familie von Signalproteinen, die in der Ras GTPase-Superfamilie3passen. Säugetier-Rho-GTPasen haben 22 Mitgliedern, die aufgrund ihrer spezifischen Funktion und allgemeine Charakterisierung4 in der RhoA, Rac1 und Cdc42 unter den Mitgliedern die meisten studierte in dieser Gruppe sind. Rho-GTPasen sind intrazelluläre Signal-Wege über einen streng regulierten Mechanismus verbunden, der molekulare Schalter über Protein posttranslationale Modifikationen5abhängig ist.

GTP beladen und Hydrolyse sind wesentliche Mechanismen in den Kreislauf der Aktivierung/Deaktivierung der kleinen Rho-GTPasen und regulierten über GTPase-aktivierende Proteine (Lücken). Lücken sind verantwortlich für die GTP-Hydrolyse und arbeiten im Konzert mit Guanin-Nukleotid Exchange Faktoren (GEFs) die für die GTP-Loading Reaktion verantwortlich sind. Rho BIP Dissoziation Inhibitoren (GDIs) bieten weitere Regulierung der kleinen Rho-GTPasen durch Bindung an die BIP-gebundenen Rho-GTPasen. Dies hemmt BIP Dissoziation und erleichtert die Sequestrierung von kleinen Rho-GTPasen Weg von der aktiven intrazellulären Membran-Websites. Außerdem gibt es weitere Regulierung der Rho-GTPase Proteine mit der Prenylation des GDIs regelt sowohl Nukleotid Hydrolyse und Austausch und Steuerelemente BIP/GTP Radfahren1,6,7,8.

GTP-Loading und Rho GTPase Prenylation sind in der Bewegung der Rho-GTPase zwischen Zytosol und Zellmembranen beteiligt, durch Ändern der lipophilen Eigenschaften dieser Proteine1,9. Die oben genannten Regler interagieren mit Phospholipide der Zellmembran und andere modulierenden Proteine des BIP/GTP Exchange Aktivität10. Darüber hinaus blockieren GDIs, Dissoziation-Inhibitoren, die GTP-Hydrolyse und der BIP/GTP-Austausch. GDIs hemmen die Dissoziation der inaktiven Rho Proteine von BIP und somit ihre Interaktion mit nachgeschalteten Effektoren. GDIs regulieren auch den Radsport GTPasen zwischen Zytosol und Membran in die Zelle. Die Aktivität der Rho-GTPasen hängt zu einem großen Teil ihrer Bewegung an der Zellmembran; So werden GDIs als wichtige Regulatoren angesehen, die im Zytoplasma durch verstecken ihre hydrophoben Region/Domänen11,12GTPasen absondern können.

Für Rho GTPase eine optimale Signal- und Funktion in allen Phasen des Lebenszyklus Aktivierung haben ist der dynamische Zyklus der GTP-laden/GTP Hydrolyse entscheidend. Jede Art von Änderungen in diesem Prozess führen nachträgliche Änderungen in Zellfunktionen Rho GTPase, z. B. Zelle Polarität, Verbreitung, Morphogenese, Cytokinese, Migration, Haftung und überleben13,14geregelt.

Das aktuelle Protokoll bietet den Lesern eine detaillierte Methode, um kleine RhoA GTPase Aktivierung über überwachen die Untersuchung ihrer Prenylation und BIP/GTP beladen. Diese Methode kann auch verwendet werden, die Prenylation und GTP-Bindung eine Vielzahl von kleinen GTPasen zu erkennen. Die GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay kann zur Messung der Aktivierung anderer Arten von GTPasen, wie Rac1, Rac2, Rac3, h-, k- oder N-Ras, Arf und Rho15verwendet werden. Die pharmakologische Agenten Simvastatin dient als Beispiel, wie es vor kurzem berichtet wurde, beteiligt an der Regulation des kleinen Rho GTPase Prenylation und Aktivität8,9,14,16.

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Protokoll

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1. Festlegung des RhoA Lokalisierung mit Membran/Zytosol Fraktionierung

  1. Kultur und Simvastatin Zelltherapie
    1. 50.000 Samen der U251 Zellen in einem 100 mm-Speise- und Kultur sie in Dulbecco den geändert Adlers Medium (DMEM) (hohe Glukose, 10 % fötalen Rinderserum [FBS]).
    2. Wenn 30 % Zusammenfluss, behandeln die Zellen durch das Medium entfernen und hinzufügen Simvastatin-haltigen Medium (10 µM von Simvastatin in Dimethyl Sulfoxid [DMSO] aufgelöst) und inkubieren Sie 36 Stunden bei 37 ° C8. Verwenden Sie DMSO allein als eine Fahrzeugkontrolle.
      Hinweis: 10 Millionen Zellen sind für die Zellflüssigkeit und Membran Fraktionierung der Zellen benötigt.
  2. Auflistung von Zellen
    1. Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator 37 ° C. Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop die Konfluenz zu bestätigen.
      Hinweis: Die Zellen sollte 70-80 % Zusammenfluss.
    2. Das Medium Aspirieren, waschen Sie die Zellen 1 X mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie 5 mL der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-Puffer (KCl: 400 mg/L NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2o: 140 mg/L, D-Glucose: 1.000 mg, EDTA Binatrium: 373 mg/L) pro Platte und die Zellen wieder in den Inkubator 37 ° C für 5 min Platz.
    3. Nach 5 min Inkubation sammeln Sie die EDTA mit den Zellen in einer 15 mL Tube mit der gleichen Menge des Mediums als EDTA.
      Hinweis: Mit Medium in das Rohr neutralisiert die EDTA und verhindert jede weitere Verdauung der Zellmembranen.
    4. Legen Sie das Rohr in eine Eisbox und fahren Sie mit der Zentrifuge.
    5. Richten Sie die Zentrifuge bis 1.500 X g bei 4 ° C und drehen Sie die Zellen für 5 min.
    6. Entfernen Sie den Überstand zu, ohne zu stören das Pellet und 1 mL kaltem PBS. Mischen Sie die Zellen gut.
    7. Übertragen Sie die Zelle Mischung (Lösung) zu einem neuen 1,5 mL Schlauch, Zentrifuge bei 1.500 X g bei 4 ° C, und drehen Sie die Zellen für 5 min.
    8. Überprüfen Sie die Pellet-Größe (für die Schätzung der Lautstärke des Puffers für den nächsten Schritt). Legen Sie die Proben auf Eis. Verwerfen des Überstands vollständig ohne zu stören das Pellet.
    9. Eiskalte Puffer, die ich (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0, 1 mM EDTA 0,1 mM EGTA, 1 mM Dithiothreitol und Protease-Inhibitor cocktail), Proben mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter, und gehen Sie dann zur Beschallung.
  3. Beschallung
    1. Legen Sie die Sonikator für fünf Zyklen, 5 s, und wiederholen Sie 3 X.
    2. Führen Sie die Anwendung von Ultraschall auf Eis. Fahren Sie mit der Ultrazentrifuge.
      Hinweis: Eis und kalten Zustand bewahren die Proteine und die Ergebnisse zuverlässiger zu machen.
  4. Ultrazentrifugation
    1. Verwenden einer Ultrazentrifuge, um die Zelle Homogenates in zytoplasmatischen zu trennen und Membran-Fraktionen. Legen Sie die Zentrifuge auf 100.000 X g für 35 min bei 4 ° C. Wie in Abbildung 1gezeigt, überprüfen Sie die Pellet-Größe.
      Hinweis: Die Membran Bruch ist an der Unterseite des Rohres und der Rest ist andere cytoplasmatischen Komponenten.
    2. Sammeln Sie überstand vollständig, während man aufpassen, nicht zu stören das Pellet. Der Überstand wird die cytosolische Fraktion. Ort der Überstand in ein neu beschrifteten Röhrchen.
    3. Fügen Sie 300 µL Puffer Dissoziation (Puffer II) (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,15 M NaCl, 1 mM Dithiothreitol, 1 % SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA und Protease-Inhibitor cocktail) zum Pellet (enthält die Membran-Bruch). Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter.
    4. Gehen Sie zur Proteinbestimmung und western-Blot (Immunoblot Analyse) Probenvorbereitung.
  5. Immunoblotting
    1. Bereiten Sie die Zelle Protein Auszüge aus den getrennten Fraktionen in Lyse Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,5 mM PMSF, 0,5 % nicht-ionische Waschmittel-40, 100 µM β-Glycerin-3-Phosphat und 0,5 % Proteaseinhibitor cocktail).
    2. Messen Sie die Konzentration des Proteins mit der Lowry-Methode8 und berechnen Sie das Volumen des Puffers lyse (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,5 mM PMSF 0,5 % nondenaturing Reinigungsmittel, Octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-Glycerin-3-Phosphat und 0,5 % Protease-Hemmer Cocktail), die Konzentration des Proteins zwischen den Proben zu normalisieren.
    3. Erwärmen Sie die Proben bei 90 ° C für 5 min und laden Sie 15-20 µL der Proben auf einem 15 % SDS-PAGE Gel um die Proteine zu trennen.
      Hinweis: Last 1 µg Protein für jede Probe. Berechnen Sie das Volumen, das muss entsprechend ausgeführt werden.
    4. Übertragen Sie die getrennten Proteine auf Nylon-Membranen unter reduzierenden Bedingungen (500 nM Glycin 50 mM Tris-HCl und 20 % Methanol) für 2 h bei Raumtemperatur (RT) bei 100 V.
      Hinweis: Zur Bestätigung des erfolgreichen Protein Transfers verwenden Sie Ponceau Fleck oder visualisieren Sie den Protein-Marker auf der Membran zu.
    5. Blockieren der Membranen mit 5 % getrockneten Magermilch und 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Waschmittel (TBS/0.01% nichtionische Reinigungsmittel; TBST), unspezifische Antikörperbindung bei 4 ° C über Nacht oder bei RT für 1 h zu blockieren.
    6. Fügen Sie Primärantikörper für Immunoblotting Analyse und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: In diesem Experiment Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH und Pan-Cadherin dienten bei einem 1:1,000 Verdünnung in 1 % Milch in 1 X TBST. Pan-Cadherin und GAPDH wurden verwendet, um die Membran und die cytosolische Fraktion Reinheit, bzw. bestätigen.
    7. Waschen Sie die Membranen 3 X mit einem Wasch-Puffer mit 1 X TBST für 20 Minuten.
    8. Die Membranen mit Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubieren-konjugierten Sekundärantikörper für die jeweiligen primären Antikörper (für 1 h bei RT).
    9. Waschen Sie die Flecken 3 X 20 min und verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Erkennung zu entwickeln.

2. Messung der RhoA GTP Last mit einem kleinen G-Protein-Aktivierung-Assay

  1. Graf 10.000 Zellen/mL und Kultur Gericht die U251 Zellen in einem 100 mm.
  2. Wenn sie 30 % Zusammenfluss sind, behandeln Sie die Zellen mit Simvastatin wie unter Punkt 1.1.2 beschrieben.
  3. Die Kultur-Platten aus dem Inkubator zu bringen. Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop, Konfluenz zu bestätigen. Sicherstellen Sie, dass die Zellen 70-80 % Zusammenfluss sind. Die Petrischale auf Eis legen, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen 3 X mit eiskaltem PBS (pH 7,2).
  4. Aspirieren Sie die PBS. Kippen Sie die Petrischale auf Eis für eine weitere Minute, alle Reste von PBS zu entfernen.
    Hinweis: Passives PBS beeinträchtigt dieser Assay.
  5. Lösen Sie die Zellen in einem 700 µL Volumen von eiskalten Lyse Puffer mit Phosphatase, Protease-Inhibitoren.
    Hinweis: 700 µL ist normalerweise ausreichend für eine 100 mm Petrischale. Siehe Tabelle 1 , die richtige Lautstärke für jede Kulturgefäß zu finden.
  6. Ernten Sie die Zelle lysate mit der Zelle-Schaber. Neigen Sie die Kultur-Platte für diese Technik.
  7. Übertragen Sie der lysate auf einem beschrifteten eiskalten Cryotube und halten sie auf dem Eis.
  8. Mischen Sie gründlich mit einem Wirbel. Halten Sie 10 µL lysate für das Protein Assay, der Proteinkonzentration in der Probe zu messen.
  9. Snap-Freeze die noch verbleibende Zelle lysate in flüssigem Stickstoff.
    Hinweis: Bereiten Sie mehrere Aliquote Zelle lysate vor dem Snap-einfrieren lassen, um wiederholte Frost/Tau-Wechseln zu vermeiden, die zum Verlust der Aktivität der RhoA GTPase führen kann.
  10. Übertragen Sie die Snap eingefroren Cryoröhrchen bis-80 ° C Gefrierschrank und speichern Sie die Proben für die GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay.
    Hinweis: Bewahren Sie die Proben länger als 14 Tage. Arbeiten Sie schnell und lassen Sie niemals die Proben auf Eis länger als 10 Minuten. Nie behandeln Sie alle Petrischalen gleichzeitig.
  11. Messen Sie die Konzentration des Proteins mit der Lowry-Methode8 und berechnen Sie das Volumen des Puffers Lyse die Konzentration des Proteins zwischen den Proben zu normalisieren.
    Hinweis: Die beste Konzentration ist in der Regel 1 mg/mL; jedoch können 0,3 - 2 mg/mL nachweisbar sein.
  12. Bereiten Sie ein leeres Steuerelement, indem 60 µL Lyse Puffer und 60 µL Puffer Bindung an ein Reaktionscup.
    Hinweis: Die Blindkontrolle hat alle Reagenzien außer das Antigen und dient für die Subtraktion des Hintergrunds.
  13. Bereiten Sie eine Positivkontrolle indem 12 µL Rho Kontrolle Protein, 48 µL Lyse Puffer und 60 µL Bindung Puffer.
    Hinweis: Die Positivkontrolle hat alle Reagenzien sowie eine bestätigte Antigen für Rho-A-GTP.
  14. Nehmen Sie die Rho-Affinität-Platte aus seiner Tasche und legen Sie ihn auf Eis.
  15. Das Pulver in den Vertiefungen mit 100 µL eiskaltes destilliertem Wasser auflösen. Halten Sie die Platte auf dem Eis.
  16. Tauen Sie das Snap eingefroren Zelle Lysates in einem Wasserbad, eingestellt auf 25 ° C.
  17. Fügen Sie das berechnete Volumen der eiskalte Lyse-Puffer (ab Schritt 2.11) zu jeder Probe, die Proteinkonzentration zu normalisieren.
    Hinweis: Entfernen Sie die PBS nach dem Waschen der Zellen (mit einer Vakuumröhre Absauganlage) um zu vermeiden, dass Änderungen in der Zusammensetzung des Puffers Lyse. Das Probe-Protein zu einer Konzentration zwischen 0,8 und 2 mg/mL für einen genauen Vergleich zwischen Proben in GTPase Aktivierung Assays auszugleichen. Tabelle 2 enthält Details über den Puffer für diesen Test verwendet werden.
  18. Übertragen Sie 60 µL der normalisierten eiskalten Proben für Mikroröhrchen und fügen Sie 60 µL Puffer zu binden; Mischen der Proben und halten sie auf dem Eis.
  19. Vollständig zu entfernen die Wasserlösungen aus der Mikrotestplatte durch kräftiges streichen, gefolgt von fünf bis sieben harte Hähne auf einem Labor-Matte.
  20. Die Brunnen in Duplikate 50 µL der normalisierten Proben, ein leeres Steuerelement und eine Positivkontrolle hinzufügen.
  21. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 30 min bei 4 ° C bei 300 u/min.
    Hinweis: Der schüttelnde Schritt ist sehr wichtig, und es wird empfohlen, den orbitalen Platte Shaker bei 300 u/min zu verwenden.
  22. Deaktivieren Sie die Proben von der Platte durch streichen und waschen Sie sie 2 X mit 200 µL Waschpuffer bei RT kräftig entfernen waschen Puffer aus den Brunnen nach jedem Waschen durch streichen, gefolgt von klopfen, und halten Sie die Platte auf der Bank bei RT
  23. Fügen Sie 200 µL RT Antigen-präsentierenden Puffer in jede Vertiefung und 2 min bei RT inkubieren.
  24. Streichen Sie die Lösung aus dem Brunnen und waschen Sie die Brunnen 3 X mit 200 µL Waschpuffer bei RT
  25. Jede Vertiefung 50 µL der frisch zubereiteten 1/250 Anti-RhoA Primärantikörper hinzufügen.
  26. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 45 min bei 300 u/min, eingestellt auf 25 ° C. Streichen Sie die Lösung aus dem Brunnen.
  27. Wiederholen Sie die Waschschritte 2 x (Schritt 2.24).
  28. Jede Vertiefung 50 µL der frisch zubereiteten 1/250 Anti-RhoA Sekundärantikörper hinzufügen.
  29. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 45 min bei 300 u/min, eingestellt auf 25 ° C.
  30. Bereiten Sie das HRP-Erkennung-Reagenz durch Mischen gleiche Volumina von Reagenz A und Reagenz B.
  31. Die Lösung aus jedem Brunnen wechseln und Waschen der Vertiefungen 3 X mit 200 µL Waschpuffer bei RT
  32. Jede Vertiefung 50 µL frisch zubereitete HRP-Erkennung-Reagenz hinzufügen.
  33. Lesen Sie die leuchtende Signal innerhalb 3-5 min, das maximale Signal erhalten und analysieren Sie die Ergebnisse mit einer entsprechenden Software-Paket.
    Hinweis: Lesungen müssen innerhalb von 3-5 min getroffen werden, um die maximale Signal zu erhalten. Führen Sie eine "Testplatte" bestätigen die richtige Lyse Puffervolumen ist für die Zelle Lysates verwendet wird, so dass die Proteinkonzentration hoch genug ist, um RhoA GTPase-Aktivität zu erkennen. (Eine Testplatte ist eine Platte von Zellen verwendet, um festzustellen, ob die Proteinkonzentration im zulässigen Bereich fällt und auch um festzustellen, ob die Lautstärke des Puffers Lyse verwendet wird.) Die Positivkontrolle sollte 4 bis 10 fache höher als die leeren Brunnen lesen, wenn es im linearen Bereich. Wenn dies nicht der Fall ist, dann stellen Sie die Luminometer durch Rücksprache mit dem Hersteller. Die Einstellungen für die Luminometer sind in Tabelle 3angegeben.
  34. Geben Sie raw-Daten in den Spalten wo die Überschriften lesen, Probe, bedeuten, Standardabweichung, rep1, rep2, rep3und rep4, die ist, die Anzahl der Wiederholungen getan wird auf jede Probe zu zeigen.
  35. Unter bedeuten, geben Sie die Formel =average(Xn:Yn) wobei X = Spalte Kennung für rep1, Y = Spalte Kennung für rep4und n = Zeile Bezeichner der Zeile gearbeitet wird.
  36. Unter Standardabweichung, geben Sie die Formel = STABW (Xn:Yn) wobei X = Spalte Kennung für rep1, Y = Spalte Kennung für rep4und n = Zeile Bezeichner der Zeile gearbeitet wird.
  37. Geben Sie die Replicate Daten in rep1, rep2, etc.
  38. Verwenden Sie nach Eingabe der Daten die Click-and-Drag Methode der Probe, die Bedeutungund die Standardabweichungzu wählen.
  39. Wählen Sie im Daten-Analyse-Software, die Funktion für Diagramm machen, die aussieht wie ein Quadrat mit einem Mini-Balkendiagramm im Inneren.
    Hinweis: Dadurch wird das Diagramm Entscheidungsprozess wo Design Diagramme basierend auf den Daten, die eingegeben werden kann.
  40. Wählen Sie Säulendiagramm und für Eingabewerte, bezeichnen Sie die Zahlen bedeuten .
    Hinweis: Das Diagramm für die Zahlen bedeuten wird zuerst, und dann wird die Spalte " Standardabweichung " für die y-Achse Fehlerindikatoren bezeichnet. Um dies zu tun, doppelklicken Sie auf die Grafik Balken, wählen Sie die Registerkarte " Y-Achse Fehler ", klicken Sie auf die Option " Benutzerdefiniert " und wählen Sie den Bereich im Arbeitsblatt, die Position der Standardabweichung Daten einzugeben. Nach der Erstellung der gewünschten Charts sehen der Unterschied zwischen den Gruppen, die verglichen werden müssen.

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Ergebnisse

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Membran Fraktionierung:

Ultrazentrifugation wurde für die Fraktionierung von Membran und Zytosol Komponenten verwendet. Wie in Abbildung 1dargestellt, der Überstand enthält die cytosolische Fraktion und das Pellet den Membran-Bruch. Die Fülle von RhoA in Bruchteilen der cytosolischen Andmembrane aus U251 Zellen gewonnen wurde nach der Behandlung mit Simvastatin mit Immunoblotting un...

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Diskussion

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Hier beschreiben wir eine genaue Methode zur Messung der kleine GTPase Prenylation und GTP-Bindung als kleine GTPase subzelluläre Lokalisation (Membran gegen Zytosol) und Rho GTP laden gezeigt. Kleinen GTPasen sind in eukaryotischen Zellen und spielen eine entscheidende Rolle in der Zellproliferation, Motilität und Struktur. Prenylation und GTP-Bindung engagieren sich bei der Regulierung der GTPase-Aktivität; Tests zur Bewertung der Prenylation und GTP-Bindung dieser Proteine sind daher wichtige Werkzeuge für Ze...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Saeid Ghavami war Gesundheit Wissenschaft Mitte in Betrieb, CHRIM Grant und Manitoba neue Ermittler Betrieb Forschungsstipendium in Betrieb unterstützt. Javad Alizadeh unterstützte Forschung Manitoba Zugehörigkeit. Shahla Shojaei wurde durch eine Finanzhilfe von Gesundheit Wissenschaft Stiftung und die MITACS beschleunigen postdoctoral Fellowship unterstützt. Adel Rezaei Moghadam wurde unterstützt durch eine NSERC Betrieb Zuschuss von Joseph W. Gordon stattfand. Amir A. Zeki wurde von den NIH/NHLBI K08-Award (1K08HL114882-01A1) unterstützt. Marek J. Los bitte würdigt die Unterstützung von NCN gewähren #2016/21/B/NZ1/02812, von LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (Region Centre-Val de Loire, Frankreich) durch seine intelligente Loire Tal allgemeine Programm unterstützt und mitfinanziert von Marie Sklodowska-Curie-Maßnahmen, gewähren #665790. Simone da Silva Rosa wurde von UMGF Zugehörigkeit unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM VWR mit hohem Glukosegehalt(Kanada)VWRL0101-0500
Fötales RinderserumVWR (Kanada)CA45001-106
Penicillin/StreptomycinVWR (Kanada)97062-806
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)VWR (Kanada)CA71007-118
EGTA (Ethylenglykolbis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'- Tetraessigsäure)VWR (Kanada)CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Dithiothreitol)VWR (Kanada)CA97061-340
AmmoniumpersulfatVWR (Kanada)CABDH9214-500G
Tris-HydroxymethylaminomethanVWR (Kanada)CA71009-186
30%ige Acrylamid/Bis-LösungBiorad (Kanada)1610158
TEMEDBiorad (Kanada)1610801
Proteaseinhibitor-CocktailSigma/Aldrich (Kanada)P8340-5ML:75 Verdünnung
Rho-GTPase Antikörper Sampler KitCell Signaling (Kanada)99681:1000 Verdünnung
Pan-Cadherin AntikörperCell Signaling (Kanada)40681:1000 Verdünnung
GAPDH AntikörperSanta Cruz Biotechnology (USA)sc-69778:3000 Verdünnung
RhoA G-LISA Aktivierungsassay (Lumineszenzformat)Cytoskeleton Inc. (USA)BK121Zytoskelett I. G-LISA Aktivierungsassays Technischer Leitfaden. 2016.RhoA
AntikörperZellsignalisierung2117
ECLAmersham-Pharmacia BiotechRPN2209
Anti-Kaninchen-IgG (Ganzmolekül) Peroxidase-AntikörperSigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate ReaderMolekulare Geräte 1612071ASpektralphotometer
Nonidet P-40Sigma11332473001nicht denaturierendes Denaturierungsmittel, Octylphenoxypolyethoxyethanol
DMSOSigma D8418-50ML
PBSSigmaP5493-1L
Phophatase InhibitorCocktail SigmaP5726-5ML1:75 Verdünnung
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Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Rho GTPasePrenylierungsnachweisGTP Bindungsassaysubzellul re FraktionierungWestern Blot AnalyseUltrazentrifugationSimvastatin BehandlungGlioblastom ZelllinienProteinlokalisation

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