Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

Javad Alizadeh; Shahla Shojaei; Simone da Silva Rosa; Adel Rezaei Moghadam; Amir A. Zeki; Mohammad Hashemi; Marek J. Los; Joseph W. Gordon; Saeid Ghavami

doi:10.3791/57646

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Methodenartikel

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

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DOI:

10.3791/57646

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11. November 2018

Javad Alizadeh¹^,² , Shahla Shojaei¹^,²^,³ , Simone da Silva Rosa¹ , Adel Rezaei Moghadam¹^,² , Amir A. Zeki⁴ , Mohammad Hashemi⁵ , Marek J. Los⁶^,⁷^,⁸ , Joseph W. Gordon¹^,⁹ , Saeid Ghavami¹^,²^,¹⁰

¹Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, ²Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, ³Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, ⁴Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, ⁵Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, ⁶Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, ⁷Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, ⁸LinkoCare Life Sciences AB, ⁹College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, ¹⁰Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5'-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.

Zusammenfassung

Die Rho-GTPase Familie gehört zu den Ras-Superfamilie und umfasst rund 20 Mitglieder in den Menschen. Rho-GTPasen sind wichtig bei der Regulation des diverse zelluläre Funktionen, einschließlich Zellskelett Dynamik, Zelle Motilität Zellpolarität, axonalen Beratung, vesikuläre Menschenhandel und Zellzyklus-Kontrolle. Änderungen bei der Signalisierung Rho GTPase spielen eine wichtige regulatorische Rolle in vielen pathologischen Bedingungen, wie Krebs, Erkrankungen des zentralen Nervensystems und Immunsystem-abhängigen Krankheiten. Die posttranslationale Modifikation der Rho-GTPasen (d.h. Prenylation von Mevalonat Weg Zwischenprodukte) und GTP-Bindung sind wichtige Faktoren, die die Aktivierung dieses Proteins beeinflussen. In diesem Beitrag werden zwei wesentliche und einfache Methoden bereitgestellt, um eine breite Palette von Rho GTPase Prenylation und GTP-Bindung-Aktivitäten zu erkennen. Details der technischen Verfahren, die verwendet wurden erklärt Schritt für Schritt in diesem Manuskript.

Einleitung

Rho-GTPasen sind eine Gruppe von kleinen Proteine (21-25 kDa), die sind gut im Laufe der Evolution konserviert, und bilden eine einzigartige Unterfamilie in der Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. In jeder Unterfamilie innerhalb dieser Überfamilie gibt es ein gemeinsame G Domäne-Kern, der die GTPase-Aktivität und Nukleotid Exchange¹beteiligt ist. Der Unterschied zwischen der Rho-Familie und den anderen Unterfamilien der Ras ist das Vorhandensein einer "Rho einfügen Domäne" innerhalb der 5^th -β-Strang und die 4^th -α-Helix in die kleine GTPase Domäne².

Aufgrund der aktuel....