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Eine effiziente Vorbereitung Beispielmethode Kohlenhydrat Ionen-Signale in der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie verbessern

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DOI:

10.3791/57660

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29. Juli 2018

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1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Verbesserung der Kohlenhydrat Ionen-Signale in der MALDI-Massenspektrometrie durch Reform kristallinen Strukturen während der Probe Herstellungsverfahren wird demonstriert.

Zusammenfassung

Probenvorbereitung ist ein kritischer Prozess in der Massenspektrometrie (MS) Analyse von Kohlenhydraten. Obwohl Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) MS ist die Methode der Wahl in Kohlenhydrat-Analyse, schlechte Ionen-Signale und Daten Reproduzierbarkeit der Kohlenhydrat-Proben weiterhin ernste Probleme. Für die Quantitative Analyse von Kohlenhydraten ist ein wirksames analytische Protokoll bietet überlegene Datenqualität erforderlich. Dieses Video zeigt Beispiel Vorbereitung Protokolle zur Verbesserung der Signalintensität und minimieren Datenabweichungen von Kohlenhydraten in MALDI-MS. Nach der Trocknung und Kristallisation der Probe Tröpfchen ist die Kristall-Morphologie von Methanol vor der massenspektrometrischen Analyse reformiert. Die Verbesserung in Kohlenhydrat-Signal wird mit MALDI bildgebende Massenspektrometrie (IMS) untersucht. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass Crystal Reformation Kristallstrukturen passt und Kohlenhydrat Analyten verteilt. Im Vergleich zu den getrockneten Tropfen Zubereitungsart in konventionellen MALDI-MS, Reform Kohlenhydrat Kristall Morphologien mit Methanol zeigt deutlich bessere Signalintensität, Ion Bildverteilung und Datenstabilität. Da die Protokolle hierin zeigte keine Veränderungen in der Probenzusammensetzung beinhalten, sind sie generell für verschiedene Kohlenhydrate und Matrizen.

Einleitung

Kohlenhydrat-Analyse ist ein wichtiges und herausfordernden Thema. Kohlenhydrate und deren Derivate spielen eine wichtige Rolle lebenden Organismen1,2,3. Diese Moleküle haben komplizierte Strukturen und neigen dazu, zu zersetzen. Viele von ihnen können nicht eindeutig aufgrund von Schwierigkeiten bei der Trennung und Erkennung charakterisiert werden. Obwohl die Analyse einer Vielzahl von Biomolekülen, aufgrund seiner Sensibilität und nachvollziehbare Ergebnisse4, Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie (MS) angewendet wurde weiter analysieren Kohlenhydrate mit MALDI-MS eine große Herausforderung aufgrund der niedrigen Ionisation Effizienz von solchen Molekülen5sein. Chemische Derivatisierung ist eine gängige Methode zur Verbesserung der Effizienz der Ionisation von Kohlenhydraten6,7, aber solche Verfahren sind Zeit und Probe zu konsumieren. Außerdem ist die Ionisation Effizienz derivatisierte Kohlenhydrate immer noch niedriger als die der Proteine. Somit ist die Entwicklung von Methoden zur Verbesserung der Kohlenhydrat-Signal im MALDI-MS ohne komplizierte Verfahren notwendig.

Die Anwendung von MALDI-MS, Quantitative Analyse ist ein weiteres anspruchsvolles Thema. Ein Hauptproblem der MALDI-MS ist, dass seine Sensibilität und Daten Reproduzierbarkeit kritisch auf Probe Vorbereitung Protokolle und experimentellen Parameter. In vielen Fällen ist die Quantitative Analyse von MALDI-MS aufgrund der heterogenen Stichprobe Morphologien und Analyten Verteilung unzuverlässig. Ein bekanntes Beispiel ist Proben mit einer 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) MALDI-Matrix. Beim DHB langsam unter Umgebungsbedingungen kristallisiert ist, ist das Ausmaß der Analyten Einbindung in Matrix Kristalle unberechenbar, weil daraus resultierenden Proben unregelmäßige Morphologien zeigen. Solche Proben bestehen in der Regel von großen nadelförmig und feinen Kristallen. Beim DHB zubereitet ist eine flüchtige Lösungsmittel und/oder einen beheizten Probenteller, ergibt sich eine schnelle Trocknung in homogener feinen Kristallen und bessere quantitative Ergebnisse8,9,10. Diese Technik nennt man "Rekristallisation" MALDI Proben. Bessere Einbindung des Analyten in feinen Matrix Kristalle während der schnellen Kristallisation wird die Verbesserung zugeschrieben. Wir haben auch gezeigt, dass Vorbereitung Probenumgebung Anpassung die Heterogenität der Kohlenhydrat-Signal und verbesserte quantitative Ergebnisse11,12reduziert. Die Ergebnisse in diesen Werken legen nahe, dass die Probe Morphologie ist ein kritischer Faktor bei der Bestimmung der Kohlenhydrat-Signalqualität. Um eine allgemeine Strategie für tägliche Analyse zu entwickeln, ist eine effiziente Reformation Beispielmethode bietet verbesserte Kohlenhydrat Sensibilität erforderlich.

Wir haben die Korrelation zwischen Probe Morphologie und Kohlenhydrat Empfindlichkeit im MALDI-MS in den letzten Bericht13systematisch untersucht. Die erzielten Ergebnisse mit mehreren wichtigen Kohlenhydraten und Matrizen zeigen, dass die besten Signal-Verstärkung von recrystallizing erfüllt ist getrocknet MALDI Proben. Die Morphologie der Proben mit der konventionellen getrockneten Tropfen (DD) Methode ist durch schnelle Rekristallisation mit Methanol (MeOH) reformiert. Die detaillierte Beispiel Vorbereitung Protokolle werden hier demonstriert. Das Protokoll besteht aus drei wesentlichen Schritten, einschließlich Probe Platte Vorkonditionierung, Probe-Ablagerung und Rekristallisation und Massenspektrometrie Analyse. Die verwendeten Kohlenhydrate gehören Sialyl-Lewis (SLeA) und Maltoheptaose (MH). DHB wird als Modell Matrix verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass Kohlenhydrate Signalintensität und räumliche Verteilung nach Rekristallisation deutlich verbessert. Diese Methode kann auf Proben mit anderen beliebten Matrizen, einschließlich 2,4,6-Trihydroxyacetophenone (THAP) und α- Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure angewendet werden. Diese Methode dient als eine allgemeine Ausrichtung, die leicht in der Labor-Routine für die Kohlenhydrat-Analyse integriert werden kann.

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Protokoll

1. Probe Platte Vorkonditionierung

  1. Reinigung der Probenteller
    1. Nitril-Handschuhe zur Vermeidung von Kontamination der probenplatte während der Reinigung zu tragen.
    2. Handwäsche-Probenteller mit 100,0 mL Reinigungslösung (1,0 mg/mL).
    3. Handwäsche-Probenteller mit destilliertem, entionisiertem Wasser (DDW).
    4. Spülen Sie die Probenoberfläche Platte mit 30,0 mL MeOH.
    5. Setzen Sie Probenteller in einem 600 mL-Becherglas und füllen sich mit DDW bis Probenteller vollständig in Wasser eingetaucht ist.
    6. Setzen Sie den Becher in ein Ultraschall Bad (siehe Tabelle der Materialien) und beschallen Probenteller für 15 min (200 W, 40 kHz).
    7. Nehmen Sie die Probenteller und Blasen Sie Wassertropfen mit unter Druck stehenden Stickstoff ab.
    8. Hinterlegen Sie 0,2 µL MeOH am Probenteller zu prüfen, ob MeOH breitet sich auf andere Orte.
      Hinweis: Wenn MeOH mit anderen Spots verschmilzt, wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5; Wenn dies nicht der Fall ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
  2. Regulierung der Raumtemperatur trocknen
    1. Verwenden Sie eine Trockenkammer unter konstanten Bedingungen, Tröpfchen, Trocknen wie oben beschrieben11,12,13. Verwenden Sie insbesondere die Einzelheiten des Verfahrens beschrieben Schritte 2.1-2.5 OE, Y.-M. Et al. 2016-12. Kurz:
      1. Bereinigen Sie die Trockenkammer durch Raumtemperatur Stickstoff bei konstantem Volumenstrom auf eine niedrige Relative Luftfeuchtigkeit Umgebung zu gewährleisten.
      2. Halten Sie die Probe Platte Temperatur konstant bei regelmäßigen - (25 ° C) oder schnell trocknende Bedingungen (50 ° C), geregelt durch einen temperaturgesteuerten Kupfer-Block in der Trockenkammer.
  3. Vorbereitung der Matrix und Analyten Lösungen
    1. Vorbereitung der Matrix-Lösungen
      1. Auflösen von DHB in 50 % Acetonitril (ACN): 50 % DDW eine 0,1 M Lösung vorzubereiten.
    2. Vorbereitung von Kohlenhydrat Analyten
      1. Auflösen von SLeA in DDW 10-4 M Lösung vorzubereiten.
      2. Lösen Sie auf, MH in DDW 10-4 M Lösung vorzubereiten.

2. Probieren Sie Ablagerung und Rekristallisation

Hinweis: Die optimierte Verfahren für die Analyse von klein- und regelmäßigen Mengen an Proben werden hier beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Probe-Platte vor Hinterlegung der Lösungen auf der gewünschten Temperatur stabilisiert wird. Wenn die Probe über ein großes Gebiet um andere Probe-Spots während Rekristallisation decken sich ausbreitet, bereiten Sie eine neue Probe oder wiederholen Sie Schritt 1.1.

  1. Für die Analyse der eine kleine Menge (0,1 µL) der Probe
    Hinweis:     die folgenden Schritte wurden für Probe und Zeit Verbrauch minimieren. Es eignet sich für die Quantitative Analyse von realen Proben mit einer begrenzten Menge oder schnelle IMS zur Quantifizierung Analyse.
    1. Premix 0,25 µL des DHB und 0,25 µL SLeA oder MH-Lösung in einem Microcentrifuge Schlauch.
    2. Wirbel der gemischten Lösung mit einem Vortex-Mixer für 3 s.
    3. Spin-down der gemischten Lösung in einer Mini-Zentrifuge für 2 s (2000 X g).
    4. Verwenden Sie eine Pipette, um 0,1 µL der vorgemischte Lösung ziehen und sofort auf den Probenteller zu hinterlegen.
      Hinweis: Bei Hinterlegung eine kleine Menge der Probe Nicht halten die vorgemischte Lösung in der Spitze der Pipette für mehr als 10 s.
    5. Warten Sie, bis die Probe trocken werden. Typische Trocknungszeiten sind in Tabelle 1aufgeführt.
    6. Verwenden Sie eine Pipette, um 0,2 µL MeOH rechts auf die getrocknete Probe vor Ort zu hinterlegen. Die Probe erhalten nass und sofort trocknen.
      Hinweis: Sicherzustellen, dass die Abscheidung in 3 abgeschlossen s um signifikante Verdunstung MeOH zu vermeiden.
    7. Die Probe unter dem Mikroskop zu untersuchen. Wenn der Kristall-Morphologien nicht wie erwartet (siehe Abbildung 1 zum Beispiel der gewünschten Ergebnisse) sind, wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.6, eine neue Probe vorzubereiten.
    8. Tragen Sie Nitril-Handschuhe zu und herausnehmen Sie sorgfältig Probenteller aus der Trockenkammer.
  2. Für die Analyse einer regulären Menge (1 µL) der Probe
    Hinweis: Die folgenden Schritte werden für die Maximierung der Homogenität der Kohlenhydrat-Proben mit in der Regel eingesetzten MALDI Probenmenge entwickelt. Das Verfahren eignet sich für Routine- und Quantitative Analysen. Die Rekristallisation Prozess verteilt Proben und Matrizen gleichmäßig auf größeren Flächen.
    1. Premix 2,5 µL des DHB und 2,5 µL SLeA oder MH-Lösung in einem Microcentrifuge Schlauch.
    2. Wirbel die vorgemischte Lösung mit einem Vortex-Mixer für 5 s.
    3. Spin-down der gemischten Lösung in einer Mini-Zentrifuge für 2 s (2000 X g).
    4. Verwenden Sie eine Pipette, um 1,0 µL der vorgemischte Lösung ziehen und sofort auf den Probenteller zu hinterlegen.
      Hinweis: nicht Nutzung der verbleibenden vorgemischter Lösung wieder nach Hinterlegung der Proben.
    5. Warten Sie, bis die Probe trocken werden. Typische Trocknungszeiten sind in Tabelle 1aufgeführt.
    6. Verwenden Sie eine Pipette, um 1,5 µL MeOH rechts auf die getrocknete Probe vor Ort zu hinterlegen. Die Probe erhalten nass und sofort trocknen.
      Hinweis: In Fällen mit hohen Probentemperatur Platte (50 ° C), der Rekristallisation Schritt getan werden, innerhalb von 5 s, Verdampfung von MeOH in PIPETTENSPITZE zu minimieren.
    7. Die Probe unter dem Mikroskop zu untersuchen. Wenn der Kristall-Morphologien nicht wie erwartet (siehe Abbildung 1 zum Beispiel der gewünschten Ergebnisse) sind, wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.6, eine neue Probe vorzubereiten.
    8. Tragen Sie Nitril-Handschuhe zu und herausnehmen Sie sorgfältig Probenteller aus der Trockenkammer.

3. mass Spectrometry Daten Erfassung und Analyse

Hinweis: Die Analyse erfolgt mit Hilfe einer kommerziellen Time-of-Flight Massenspektrometer (Table of Materials) mit einem MALDI-Ionenquelle ausgestattet. Das Instrument wird durch spezielle Steuerungssoftware (Table of Materials) mit Pre-optimierte Extraktion Verzögerung und Laser-Energie betrieben. Spektren werden aufgezeichnet, im linearen Modus mit einem Massenbereich von m/Z = 0 – 1500. Potenzielle Probenteller ist ±25 keV und jedes Spektrum im Durchschnitt 10 Laserschüsse. Benutzer sollten Instrument Optimierung und Analyse von Proben mit kompatibler Software durchführen und Instrument des Herstellers zu folgen.

  1. Öffnen Sie die Instrument-Steuerungs-Software (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Das Massenspektrometer stecken Sie Probenteller.
  3. Wählen Sie die bereits optimierten Daten Akquisition in der Software.
  4. Die gesamte Probe-Region für IMS über die imaging-Software zu registrieren (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt nicht tun, IMS.
  5. Beginnen Sie Datenerfassung in der Batch-Modus der Steuerungssoftware.
  6. Zeichnen Sie die Ionen-Bilder über die imaging-Software, nachdem die Datenerfassung abgeschlossen ist.
  7. Massenspektren mit Analysesoftware zu analysieren (siehe Tabelle der Materialien) Wenn die Daten ohne Ionen-Bild aufgezeichnet werden.

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Ergebnisse

Repräsentative SEM Bilder der SLeA gemischt mit DHB vorbereitet, mit DD und Rekristallisation Methoden sind in Abbildung 1dargestellt. Eine typische Morphologie der DHB ist, da durch die DD-Methode vorbereitet große nadelförmige Kristalle an der Felge und feine kristalline Strukturen in der Mitte der Probe stellen. Die typischen Längen der solche nadelförmige Kristalle sind ~ 100 µm. Nach Rekristallisation von MeOH hat die Probe eine größere Fläche...

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Diskussion

Probe Heterogenität ist ein entscheidendes Problem in der MALDI-MS. DD ist die am häufigsten verwendeten Probe Vorbereitung Methode, aber die daraus resultierende Kristalle sind sehr heterogen. Solche Beispiele zeigen schlechtes Signal von Schuss zu Schuss und Probe zu Probe Reproduzierbarkeit. Auf der Suche nach "Sweet Spots" in Probeflächen während der Datenerfassung ist daher, ein gemeinsames Vorgehen in MALDI-Experimente. Solchen heterogenen Proben sind ungeeignet für die Quantifizierung in Routineanalysen.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
Detergent PulverAlconox242985
MethanolMerck106009
AcetonitrilMerck100003
2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB)Alfa AesarA11459
Sialyl-Lewis A (SLeA)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
PipettenspitzenMettler Toledo17005091
MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q WasseraufbereitungssystemMilliporeZMQS6VFT1
Puderfreie NitrilhandschuheMicroflexSU-690
600 mL BecherglasDuran2110648
UltraschallreinigerDeltaDC300H
HygrometerWisewind5330
Stickstoffgas-DurchflussmesserDwyerRMA-6-SSV
Thermoelemente vom Typ KDigitron311-1670
Vortex-MischerScientific Industries  SI-0236
Mini-ZentrifugeSelect BioProductsForce Mini 
PipetteRaininpipet-lite XLS
StereomikroskopOlympusSZX16
Temperierbare TrockenkammerDieses Labor
Ultraflex II TOF/TOF MassenspektrometerBruker Daltonics
MTP 384 Zielplatte Stahl poliert BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol Version 3.4Bruker DaltonicsSteuerungssoftware
Fleximaging Version 2.1Bruker DaltonicsImaging Software
Flexanalysis Version 3.4Bruker DaltonicsAnalysesoftware
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Referenzen

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MALDI MassenspektrometrieKohlenhydratanalyseKristallreformationMethanolbehandlungSignalverst rkungImaging MassenspektrometrieDried Droplet MethodeUltraschallbadmikroskopische Untersuchung

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